Prática 1 MATERIAL E TÉCNICAS BÁSICAS UTILIZADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

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1 Prática 1 MATERIAL E TÉCNICAS BÁSICAS UTILIZADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

2 Prática 1 Microrganismos Localização em todos os ambientes naturais; Populações mistas; Necessidade de isolamento. Cultura pura crescimento de um único microrganismo em um meio de cultura adequado. Somente podem existir indivíduos da mesma espécie.

3 Prática 1 Para obtenção de cultura pura: Esterilização eliminação de toda e qualquer forma de vida em determinado material ou ambiente. Assepsia impedir a entrada de microrganismos onde não são desejados.

4 Manobras assépticas Prática 1 Trabalhar dentro da zona de segurança do bico de Bunsen. Flambar a alça de platina ou a agulha de platina antes e após a inoculação. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança, preferencialmente na parte interna do recipiente. Flambar a boca dos tubos contendo microrganismos. A tampa ou rolha de gaze nunca deve ser colocada sobre a bancada Flambar a alça de platina 2- Remover a tampa e flambar a boca dos tubos 3 -Transferir as culturas 4- Flambar a boca dos tubos e recolocar as tampas 5- Flambar a alça de platina

5 Prática 1 OBJETIVOS DA PRÁTICA Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais freqüente em microbiologia Definir cultura pura, esterilização e assepsia. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas. Desenvolver habilidade de manipular tubos com meios estéreis, bem como transferir microrganismos de meio sólido para meio líquido. Conscientizar-se da presença de microrganismos no ambiente

6 Prática 1 1 a Parte - Apresentação do material de laboratório Tubos Pipetas Pasteur Placas Alças e agulhas de platina Bico de Bunsen

7 Prática 1 2 a Parte Manobras assépticas Distribuir de um tubo para o outro, caldo simples estéril, usando pipeta. Transferir uma porção do crescimento de Serratia crescida em tubo de ágar-inclinado contendo meio ágar-simples para outro tubo com meio idêntico, com o auxílio da alça de inoculação. Transferir uma porção do crescimento de Serratia crescida em tubo de ágar-inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os tubos no escuro, por no mínimo 48 horas.

8 Prática 1 3 a Parte Verificar a presença de microrganismos no ambiente Verter meio de ágar-simples fundido em placa e esperar solidificar. Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar. Com a segunda placa realizar os seguintes experimentos: Friccionar um swab na bancada e em seguida espalhar o mesmo na superfície do ágar. Friccionar alguns fios de cabelo sobre o ágar. Tocar levemente a superfície dos dedos na superfície do ágar. Soprar, tossir ou espirrar sobre a superfície do ágar. Incubar as placas a temperatura ambiente por pelo menos 1 semana.

9 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS PRÁTICA 1 1 a Parte Manobras assépticas Leitura dos tubos de caldo simples que foram somente passados para outro tubo com pipeta. Turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, ou seja, houve contaminação do meio durante as manobras assépticas. Presença de crescimento de Serratia, cor alaranjada indica que houve transferência da cultura. Presença de crescimento de colônias com outra coloração indica contaminação com outro microrganismo manobra asséptica inadequada. Leitura de tubos de caldo simples inoculados com Serratia indica crescimento bacteriano. Não é possível verificar contaminação. Observar a presença de colônias diferentes.

10 Prática 2 MÉTODOS FÍSICOS NO CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO Esterilização, Desinfecção e Antissepsia. Teste de ação de calor sobre as bactérias

11 Prática 2 O crescimento dos microrganismos pode ser controlado através de métodos físicos. Eliminação total Esterilização. Esterilização eliminação total dos microrganismos presentes em determinado material ou ambiente. Eliminação parcial Desinfecção e Assepsia. Desinfecção consiste na inativação ou redução do número de microrganismos presentes em um material inanimado. Tem como objetivo eliminar microrganismos patogênicos. Eliminar a potencialidade infecciosa. Antissepsia consiste no mesmo conceito dado à desinfecção porém, está relacionado com substâncias (anti-sépticos) aplicadas ao tecido vivo.

12 Prática 2 MÉTODOS FÍSICOS Temperatura Radiação Filtração Dessecação TEMPERATURA Atua nos sistemas enzimáticos; Desnaturação de proteínas estruturais e enzimas- perda de integridade e função celular; Resistências diferentes dependendo do tipo de célula ; Esporos suportam temperaturas acima de 100 o C; Células vegetativas morrem após 10 minutos a o C

13 Prática 2 Calor Seco Fornos ou estufas utiliza o calor seco durante 1 ou 2 horas na temperatura de 180 o C (forno Pasteur). Esterilização de vidrarias e materiais danificáveis pela umidade (metais e óleos). Flambagem ou Chama direta Aquecimento ao rubro. Esteriliza agulhas,alças microbiológicas, pipetas Pasteur, etc... Incineração Para materiais a serem descartados. Ex: animais de laboratório, lixo hospitalar.

14 Prática 2 Calor Úmido Maior poder de penetração na célula do que o calor seco.

15 Prática 2 Calor Úmido Abaixo de 100 o C Pasteurização reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Ex: Indústrias de alimentos ( leite, cerveja, etc...) Leite 72 o C por 15 segundos mata todos os patógenos e quase todos os não patogênicos.

16 Prática 2 Calor Úmido A 100 o C Água fervente ou vapor fluente Tindalização Utiliza o calor na forma de vapor d água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100 o C/20 minutos durante 3 dias consecutivos) Ex: vacinas e alguns medicamentos. Água em ebulição utiliza o calor da forma de vapor d água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100 o C/20 minutos).

17 Prática 2 Calor Úmido Acima de 100 o C Autoclavação utiliza o calor da forma de vapor d água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121 o C/15-30 minutos). Ex: esterilização de meios de cultura, esterilização de vidrarias, etc.... VHT (very-high-temperature) o C / 1-2 segundos. Ex: esterilização de alimentos sem alterar a textura e o sabor. Tipo de pasteurização.

18 FRIO Prática 2 Tem efeito apenas estático, isto é, reduz a taxa de crescimento e atividade enzimática do microrganismo, redução de reações químicas e possíveis alterações nas proteínas. Congelamento Resfriamento Liofilização (dessecação): congelamento rápido do material sob N 2 e posterior remoção da água por sublimação.

19 Prática 2 Radiação Raios g - alto poder de penetração. Induz formação de radicais livres tóxicos que podem atuar na polimerização e outras reações químicas acarretando assim desorganização química dos microrganismos. Ex: materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. OBS: é um método caro e perigoso. Ultra-violeta Baixo poder de penetração, causa lesão no DNA formando dímeros de timina. Ex: esterilização de salas cirúrgicas.

20 Prática 2 Filtração Algodão cardado (tubos de ensaio, erlenmeyers) Velas bacteriológicas Diatomáceas e Porcelana Discos filtrantes (Seitz-amianto) Membranas filtrantes (Millipore - Acetato de Celulose) Filtros HEPA filtros de alta eficiência para retenção de partículas do ar) fluxo laminar. Ex: materiais termolábeis como soros, enzimas, meio de cultura, etc....

21 Filtração Prática 2

22 Prática 2 OBJETIVOS DA PRÁTICA Conceituar diferentes métodos físicos de esterilização. Comparar diferentes métodos físicos de esterilização. Listar alguns métodos de esterilização pelo calor. Relacionar as finalidades da desinfecção e assepsia. Testar a eficácia da ação do calor sobre o crescimento bacteriano.

23 Prática 2 EXECUÇÃO DA PRÁTICA 1 a Parte - Teste de ação de calor sobre as bactérias: será verificada a ação de dois métodos diferentes de controle de microrganismos que empregam calor úmido: autoclave e água em ebulição. Adicionar 1 ou 2 gotas de cultura pura de bactérias a tubos contendo caldo simples e submetê-los aos seguintes tratamentos: Tubo 1 controle, sem tratamento. Tubo 2 ferver 5 minutos em banho Maria. Tubo 3 ferver 20 minutos em banho Maria. Tubo 4 submeter a autoclavação durante 15 minutos.

24 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS PRÁTICA 2 1 a Parte Ação do calor sobre as bactérias. 2 Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou a presença de uma película na superfície do meio, indica a presença de crescimento bacteriano. Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle). Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas: Bacillus subtilis e Escherichia coli. As culturas de B. subtilis, por serem esporuladas, são muito mais resistentes e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.

25 Prática 3 MÉTODOS QUÍMICOS NO CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

26 Prática 3 Agentes químicos são usados para controlar o crescimento de micróbios tanto em tecidos vivos como em objetos inanimados. A maioria dos agentes químicos somente reduz a população bacteriana. Nenhum desinfetante isolado será apropriado para todas as circunstâncias.

27 Prática 3 Devem ser levados em consideração os seguintes fatores: Propriedades do desinfetante. Concentração a ser utilizada. Natureza do material a ser desinfetado (alguns materiais orgânicos podem interferir com a atividade do desinfetante). Se o desinfetante entrará em contato com os microrganismos algumas vezes a área precisa ser esfregada e lavada antes do desinfetante ser aplicado. Tempo efetivo de contato com o desinfetante. Quanto maior a temperatura do desinfetante melhor o efeito.

28 Prática 3 Avaliação do desinfetante Teste da diluição padrão do teste de diluição é feito com 3 cepas de bactérias, Salmonela cholerae-suis, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.

29 Prática 3 Método do Papel de Filtro um disco de papel de filtro embebido com um produto químico é colocado em uma placa de ágar que foi previamente inoculada e incubada com o organismo-teste. Após a incubação, se o produto químico for efetivo, aparecerá uma zona clara de inibição de crescimento à volta do disco de papel de filtro.

30 Prática 3 Agentes Químicos Utilizados para Controlar o Crescimento Bacteriano Fenol causa ruptura de membrana plasmática, desnaturação de proteínas (enzimas). Raramente usado como desinfetante ou anti-séptico devido a suas qualidades irritante e odor desagradável. Fenólicos - causa ruptura de membrana plasmática, desnaturação de proteínas (enzimas). Utilizado para superfícies ambientais, instrumentos, superfícies cutâneas e membranas mucosas. São reativos mesmo em presença de material orgânico. Álcoois desnaturação de proteínas e dissolução de lipídeos. Utilizados em termômetros e outros instrumentos. Bactericida e fungicida, mas não é efetivo contra endósporos ou vírus nãoenvelopados: álcoois comumente utilizados são o etanol e o isopropanol.

31 Prática 3

32 Prática 3 Agentes Químicos Utilizados para Controlar o Crescimento Bacteriano Halogênios: - Iodo inibe a função das proteínas e é um forte agente oxidante; - É um antisséptico efetivo. - Reage com a tirosina, um aminoácido encontrado em proteínas. - A diiodotirosina formada inibe a função da proteínas da célula. - Provavelmente também reage com outros constituintes celulares. - É efetivo contra todas as bactérias, muitos endosporos, vários fungos e alguns vírus.

33 Prática 3 Agentes Químicos Utilizados para Controlar o Crescimento Bacteriano Halogênios: Cloro forma o agente oxidante forte denominado ácido hipocloroso, que altera os componentes celulares. O cloro é usado para desinfetar água, utensílios para refeições, itens domésticos e vidrarias.

34 Prática 3 Agentes Químicos Utilizados para Controlar o Crescimento Bacteriano Sabões e Detergentes Aniônicos remoção mecânica dos micróbios por escovação. Degerminação da pele e remoção de resíduos. Muitos sabões antibacterianos contêm antimicrobianos como o triclocarban e triclosan. Detergentes ácido-aniônicos mecanismo de ação incerto, pode envolver a inativação ou ruptura de enzimas. Sanitização em indústrias de processamento de lacticínios e alimentos. Amplo espectro, atóxico, não corrosivo e de ação rápida. Detergentes catiônicos (compostos de amônio quaternário) inibição de enzimas, desnaturação de proteínas e ruptura de membrana plasmática. Anti-séptico para a pele, instrumentos, utensílios e objetos de borracha. Bactericida, bacteriostático, fungicida e viricida contra vírus envelopado. Ex: Cepacol.

35 Prática 3 Agentes Químicos Utilizados para Controlar o Crescimento Bacteriano Peroxigênios Oxidação. Superfícies contaminadas, alguns ferimentos profundos, em que eles são muito efetivos contra os anaeróbicos sensíveis ao oxigênio. Ex: ozônio, peróxido de hidrogênio e ácido peracético. Esterilizantes gasosos Desnaturação de proteínas, ação mutagênica, age contra formas vegetativas e esporuladas. Excelente agente esterilizante para objetos que seriam danificados pelo calor. Ex: mais usado é o óxido de etileno. Metais pesados e seus compostos Desnaturação de enzimas. O nitrato de prata é utilizado para prevenir infecções oculares. O sulfato de cobre é um algicida. Metais pesados como a prata, mercúrio, cobre e zinco são usados como germicidas ou antissépticos.

36 Prática 3 OBJETIVOS DA PRÁTICA Fazer apreciação dos diferentes agentes antissépticos. Testas a eficácia de agentes químicos sobre o crescimento bacteriano.

37 Prática 3 EXECUÇÃO DA PRÁTICA 1 a Parte - Teste de eficácia de agentes químicos (antissépticos) sobre as bactérias. Será demonstrada a ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária etc..., sobre o crescimento de Serratia (técnica do polegar). Em placa de Petri contendo meio de cultura delimitar 3 regiões, utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1,2 e 3. Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na região 1, tomando todo o cuidado para não ferir o Agar. Umedecer o polegar no papel de filtro embebido com cultura de Serratia e comprimindo-o ligeiramente na região 2. Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissépticos a sua escolha (álcool, álcool iodado, detergente ou água sanitária). Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente sobre o ágar, na região 3. Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar em papel e incubar a temperatura ambiente (25-28 o C) durante horas.

38 Prática 3 EXECUÇÃO DA PRÁTICA 2 a Parte Observação ao microscópio de lâminas prontas Adicionar sobre o esfregaço uma pequena gota de óleo de imersão e examinar ao microscópio utilizando a objetiva de imersão (100X). Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de crescimento corados pelo método de Schaeffer Fulton. Bactérias coradas pelo Gram : Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (Gram-positiva) e Escherichia coli (Gram-negativa)

39 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS PRÁTICA 3 Teste da ação dos agentes antissépticos Observar a placa da aula anterior e verificar o crescimento bacteriano nas 3 regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antissépticos usados pelos outros grupos da sua turma

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