UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ UNOCHAPECÓ

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1 UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ UNOCHAPECÓ Área: CIÊNCIAS EXATAS E AMBIENTAIS Curso: MEDICINA VETERINÁRIA Componente Curricular: MICROBIOLOGIA Turma: A e B Período: 2º Ano/Semestre: 2015/2 Professor(a): RAQUEL ZENI TERNUS ROTEIROS DE AULAS PRÁTICAS 2015/2 CHAPECÓ SC, 2015.

2 Cronograma de aulas práticas TA (3ª feira - turno NOTURNO 20h55 às 22h35) Aula 1 Turma A 01/09: Apresentação e microscopia Aula 1 Turma B 08/09: Apresentação e microscopia Aula 2 Turma A 15/09: Preparo de materiais, meios de cultura e esterilização Aula 2 Turma B 22/09: Preparo de materiais, meios de cultura e esterilização Aula 3 Turma A 29/09: Técnicas de Coloração (Gram e endósporos) e microbiologia do ambiente Aula 3 Turma B 03/11: Técnicas de Coloração (Gram e endósporos) e microbiologia do ambiente Aula 4 Turma A 10/11: Cocos Gram + (Staphylococcus e Streptococcus) diluição, contagem e provas bioquímicas Aula 4 Turma B 17/11: Cocos Gram + (Staphylococcus e Streptococcus) diluição, contagem e provas bioquímicas Aula 5 Turma A 24/11: Atividade antimicrobiana a agentes químicos / Testes de sensibilidade a antimicrobianos Aula 5 Turma B 01/12: Atividade antimicrobiana a agentes químicos / Testes de sensibilidade a antimicrobianos

3 NORMAS DE SEGURANÇA ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas de Microbiologia tem como objetivo ensinar ao estudante os princípios e métodos básicos utilizados em um Laboratório de Microbiologia. Neste laboratório, trabalha-se com uma variedade de bactérias, algumas patogênicas para o homem, sendo, portanto, essencial seguir as normas de segurança estabelecidas para um laboratório de microbiologia a fim de evitar contaminação. O aluno é responsável pelo material que receber; Usar sempre, jaleco de material não inflamável (algodão). Além de protegê-lo contra contaminações, muitos dos corantes e reagentes utilizados em microbiologia são de difícil remoção. É proibida a permanência nas dependências do laboratório de pessoas que não estiverem adequadamente vestidas, ou seja, sapato fechado, calça comprida e jaleco de manga longa. Os alunos que tem cabelos compridos, devem mantê-los sempre amarrados. Além disso deve-se evitar o uso de adornos, como brincos, anéis, pulseiras, piercings, etc. As vestimentas de laboratório (jaleco) não devem ser usadas fora do local de trabalho. Caso o jaleco tenha sido contaminado acidentalmente autoclavar a 121 C por 30 minutos antes da lavação; Não comer, beber, mascar chiclete ou fumar no laboratório. Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer micro-organismo, comer ou fumar é meio eficiente para uma autocontaminção; Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática. Para essa finalidade, usa-se álcool 70% e algodão hidrofílico. Com esse procedimento os micro-organismos que poderiam contaminar as culturas na área de trabalho são removidos; Guardar casacos, blusas, jaquetas e outros itens de vestimentas pessoais, livros, de preferência, em compartimentos fora do laboratório de microbiologia. Nunca misturá-los com roupas utilizadas no laboratório. Se possível, traga uma sacola plástica e ao final da aula, guarde seu jaleco dentro desta sacola; Não tocar as faces, lamber etiquetas ou colocar as mãos, lápis e outros materiais na boca; Avisar o professor ou técnico de laboratório em caso de contaminação como: derramamento de cultura sobre a bancada ou no chão, ferimentos, etc.; Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen), verificando sempre se não existem substâncias inflamáveis por perto; Lavar cuidadosamente as mãos utilizando sabonete germicida e álcool 70% antes de iniciar as práticas e antes de sair do laboratório e/ou sempre que suspeitar de contaminação; Usar luvas de borracha quando houver perigo significativo de contaminação, tal como durante a manipulação de materiais que possam estar contaminados; Colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas, vidrarias em geral em recipientes apropriados contendo hipoclorito de sódio a 2%, que estarão dispostos sobre a bancada); Flambar alças e agulha antes e após o uso. A flambagem dever ser feita de maneira adequada, colocandose a alca de inoculação a ser flambada em posição posterior a chama (e não na frente da mesma) para evitar a dispersão de aerossóis. Regular a chama do bico de Bunsen para que permaneça azul. Evitar conversas desnecessárias, como também reduzir ao mínimo absoluto durante o período de trabalho, visando prevenir a contaminação do analista e/ou da amostra a ser analisada; Tratar todas as culturas de micro-organismos e amostras como sendo potencialmente patogênicas. Nunca jogar culturas viáveis ou materiais contaminados diretamente na pia. Esse material deve ser esterilizado antes de sua disposição final; Nunca pipetar amostras com a boca. Para este procedimento utilizar sempre pêras de sucção ou outro equipamento. Seguir as normas de uso dos aparelhos. Quando utilizar o microscópio com objetiva (x100), de imersão em óleo, a lente deve ser limpa com a solução indicada após o uso. Nunca guardar alimentos ou bebidas no refrigerador do laboratório, preparar café ou chá, ou qualquer outro alimento que posteriormente será ingerido, na área do laboratório. Ao final da aula ou do procedimento, todo o material deve ser recolocado no lugar ou nos descartes apropriados. Isto inclui o microscópio, material semeado em aula, corantes, alça de platina, as estantes e os bancos.

4 AULA 01: Apresentação do laboratório e microscopia 1. COMO TRABALHAR NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um laboratório de microbiologia em geral, não importando se o micro-organismo estudado será uma bactéria, um fungo ou um vírus. 1.1 CUIDADOS FUNDAMENTAIS Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com micro-organismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o professor ou o monitor para te auxiliar. 1.2 PROCEDIMENTOS DE PRECAUÇÃO E SEGURANÇA O laboratório de microbiologia é um lugar onde culturas de micro-organismos são manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Também como técnicas assépticas, todos os materiais que serão utilizados serão esterilizados para eliminar todos os micro-organismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para não haver recontaminação deste material com micro-organismos do ambiente. Geralmente, os micro-organismos estudados não são patogênicos, mas ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente patogênico, lembrando que muitos micro-organismos que geralmente não são patogênicos podem causar doenças oportunistas. Cada estudante deve aprender e praticar as práticas assépticas no laboratório. Isto é importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com material contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus colegas que estarão trabalhando na bancada ao lado. A importância da assepsia e desinfecção apropriadas está descrita na apostila e será observada em uma das aulas práticas. Em geral, todos os procedimentos de segurança e precauções tomados no laboratório de microbiologia se resumem em: 1 restringir os micro-organismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubação) ou sua análise; 2 prevenir a contaminação com micro-organismos ambientais (normalmente presentes nas mãos, cabelos, roupas, superfícies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode interferir nos resultados obtidos. Mãos e superfícies devem ser higienizadas e tratadas com antissépticos e desinfetantes corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trás, e as áreas de trabalho devem estar livres de objetos desnecessários. Lembre-se que na hora de transferir os micro-organismos ou culturas não devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). A conduta pessoal no laboratório de microbiologia deve ser sempre observada. O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema. 1.3 CONDUTA GERAL NO LABORATÓRIO 1. Antes de começar devemos lembrar: - Prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; - Não use jóias e acessórios durante a aula prática; - Mantenha seus dedos, lápis, caneta e quaisquer objetos longe da sua boca; - Não fume, coma ou beba nada no laboratório; - Não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação. 2. Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na aula prática. 3. Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência limpo e branco. 4. No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada com álcool etílico a 70% (v/v). Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o decorrer e ao final de toda a aula prática. 5. Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratório. 6. Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dúvida persistir, chame o professor ou monitor. Evite tirar dúvidas com os colegas de outros grupos. 7. Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto. 8. Trabalhe sempre próximo ao fogo. A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de microorganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada

5 para flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a flambagem). No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. (Figura 1). Figura 1: (a) Zonas de uma chama; (b) característica da chama, dependendo da coloração a) b) 9. Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 10. Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 11. Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias. 12. Antes de sair do laboratório, cuidadosamente lave e faça a antissepsia em suas mãos. 13. Nunca guarde seu jaleco juntamente com demais matérias. Traga sempre uma sacola plástica para guarda-lo, ao término do experimento. 14. Lembre-se de lavar seu jaleco para a próxima aula prática. 1.4 MICROSCOPIA O microscópio foi inventado em 1590 por Hans Janssen e seu fiiho Zacharias, dois holandeses fabricantes de óculos. Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos foi o neerlandês Antonie van Leeuwenhoek ( ). Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas, os glóbulos vermelhos do sangue e os espermatozoides presentes no sêmen dos animais. Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos micróbios, como eram antigamente chamados os seres microscópicos, hoje conhecidos como micro-organismos. Dividem-se basicamente em duas categorias: a) Microscópio Luminoso ou ótico Microscopia de Campo Claro Microscopia de Campo Escuro Microscopia de Fluorescência Microscopia de Contraste de Fase b) Microscópio Eletrônico (alemão Ernest Ruska) Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET (para observação de cortes ultrafinos) Microscópio Eletrônico de Varredura MEV (para observação de superfícies) Microscópio Eletrônico de Tunelamento - ME (para visualização de átomos) TÉCNICAS EM MICROSCOPIA Dentre as técnicas empregadas em microscopia destacam-se: a) Microscopia de fundo escuro É uma aplicação do princípio de Tyndall. Assim os corpúsculos a examinar são fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que é conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a única luz que penetra na objetiva é a difratada pelas partículas presentes na preparação, pelo que passam a ser visíveis em fundo escuro. b) Microscopia de fluorescência Permite observar micro-organismos capazes de fixar substâncias fluorescentes. A luz UV, ao incidir nessas partículas, provoca a emissão de luz visível e observam-se os micro-organismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da tuberculose fixa a auramina, pelo que o diagnóstico da doença pode ser feito por microscopia de fluorescência. c) Microscopia de contraste de fase Permite a observação de micro-organismos vivos, sem coloração, através do contraste devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à fase da luz que atravessa os micro-organismos. Esta diferença de fase é conseguida por utilização de uma objetiva de fase, que consiste num disco de vidro com uma escavação circular, de modo que a luz que atravessa a escavação tem diferença de 1/4 de fase em relação à

6 que atravessa a outra porção do vidro. Assim, os objetos não corados podem funcionar como verdadeiras redes de difração, pois os pormenores da sua estrutura resultam de pequenas diferenças nos índices de refracção dos componentes celulares, e estes originam diferenças de fase nas radiações que os atravessam MICROSCÓPIO ÓPTICO O microscópio óptico refere-se ao instrumento que utiliza a luz para a observação das amostras. Divide-se em porção mecânica e óptica. a) Parte mecânica - Pé ou base serve de apoio dos restantes componentes do microscópio. - Coluna ou Braço fixo à base, serve de suporte a outros elementos. - Platina onde se fixa a preparação a observar; tem uma janela por onde passam os raios luminosos e também parafusos dentados que permitem deslocar a preparação. - Tubo ou canhão suporta a ocular na extremidade superior. - Revólver peça giratória portadora de objetivas de diferentes ampliações. - Parafuso macrométrico a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude. - Parafuso micrométrico a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, lentos e de pequena amplitude, permitem aperfeiçoar a focagem. - Charriot - Movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo. b)parte óptica: - Condensador conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio. - Diafragma permite regular a intensidade da luz que incide no campo de visão do microscópio. - Objetivas permitem ampliar a imagem do objeto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. As objetivas de 10x, 40x e 50x são designadas objetivas secas, pois entre a preparação e a objetiva existe somente ar. As objetivas de 90x e 100x são designadas objetivas de imersão, uma vez que, para as utilizar, é necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre elas e a preparação, a qual, por ter um índice de refração semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso para fora da objetiva. - Oculares sistema de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva, formando uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos microscópios binoculares também existem oculares de 12,5x, 8x e 6x. - Fonte luminosa luz artificial, fornecida por uma lâmpada de tungstênio ou de halogênio, incluída no aparelho juntamente com um interruptor com reostato, que permite regular a intensidade da luz emitida COMO TRABALHAR COM O MICROSCÓPIO Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios (Figura 2): Figura 2: Microscópio ótico binocular - Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as capas devem ser lavadas periodicamente).

7 - Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. - Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. - Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. - Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio. - Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamínula. Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com o micrométrico. O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento. Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da objetiva; Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalização com o micrométrico. 1.5 MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Todo laboratório bacteriológico, seja qual for a sua finalidade, deve obedecer a um conjunto de normas gerais, as quais são sempre comuns. Deve possuir amplitude suficiente para abrigar comodamente os móveis, aparelhos e instrumental necessário. Paredes e pisos devem ser recobertos de material impermeável, de fácil limpeza e as mesas devem ser resistentes a ação de substâncias químicas. A iluminação natural ou artificial tem que ser abundante e difusa. As correntes de ar devem ser evitadas e a ventilação tem que ser controlada, a fim de que possa ser totalmente eliminada, quando necessário. É indispensável o conhecimento do instrumental especializado exigido no trabalho bacteriológico, sendo a maioria de vidro e de outros materiais diversos. - Tubos de ensaio: Existem tubos de ensaio de diversos tamanhos e formatos, tubos grossos (20 x 200 mm), tubos finos (12 x 180 mm), tubos de hemólise (10 x 90 mm), tubo de Durham (5 x 30 mm). - Pipetas (graduadas ou sorológicas, de Pasteur e micropipetas) - Frascos: Balões, erlenmeyer, kitasato, frascos tipo conta gotas, provetas, cálice (vasos cônicos), ecker (copo graduado), garrafa de Roux - Vidrarias diversas: Placas de Petri, alça de Drigalsky, Funil, Gral e pistilo, lâmina de vidro, lâmina escavada, lamínula, cristalizadores, bastão de vidro, lâmpada a álcool, etc. - Instrumental Alça de platina, fio ou agulha de platina, estantes para tubos de ensaio, galerias ou placa de Malassez, swab, espátulas, pinças, etc. - Aparelhos: Balança simples, balança de precisão ou analítica, estufa bacteriológica, estufa de esterilização, autoclave, banho Maria, microscópio, centrifuga, potenciômetro, contador de colônias, filtro Seitz, bico de Bunsen, micro incinerador, destilador. É indispensável no laboratório: capela de fluxo laminar, água corrente, caneta vidrográfica, água destilada, papel kraft, cordão, fita adesiva, algodão hidrófilo e hidrófobo. 1. Autoclave (calor úmido) O seu funcionamento baseia-se no vapor d água sob pressão, e é utilizada para esterilização de materiais usados em microbiologia, principalmente meios de cultura. 2. Estufa esterilizadora ou Forno Pasteur (calor seco) Usado para esterilizar materiais secos tais como tubos, placas, etc. 3. Estufa Incubadora Onde os micro-organismos são mantidos durante o seu desenvolvimento em uma temperatura constante. 4. Microscópio Para observação de micro-organismos. 5. Placa de Petri Recipiente redondo de vidro com tampa rasa, destinada ao cultivo de micro-organismos em meio sólido. 6. Tubo de Cultura Destinado ao cultivo de micro-organismos em pequeno volume de meio (líquido ou sólido). 7. Pipeta Graduada Utilizada para diluição, inoculação, etc. Contém um tampão de algodão hidrófobo em uma das extremidades. 8. Lâmina e Lamínula Para o exame microscópico de micro-organismos. QUESTIONÁRIO 1. Desenhe o que você observou (microscopia de lâminas permanentes):

8 A. Visualização de bactérias B. Visualização de fungos Filamentosos Leveduras AULA 02: Preparo de materiais e meios de cultura para uso em análises microbiológicas

9 1. LIMPEZA E PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA É muito importante a assepsia dos materiais e do próprio laboratório, quando se trabalha com microorganismos, isto porque, qualquer matéria estranha pode ser uma fonte de contaminação. O chão do laboratório deve ser esfregado todos os dias com pano molhado e um desinfetante, preferencialmente lisoforme. Os balcões e todas as outras superfícies também devem ser desinfetados. Placas de Petri - se tiverem culturas desenvolvidas, devem ser inicialmente autoclavadas (121 ºC, 15 minutos), o meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com água e sabão e deixadas por algumas horas em solução detergente. Depois disso são passadas em água corrente, secas e preparadas para a esterilização. As tampas são revestidas com discos de papel de filtro e as placas são então embrulhadas ou colocadas em estojos apropriados para serem esterilizadas em estufa a 180 ºC por 90 minutos. Tubos de Culturas - se tiverem culturas desenvolvidas, proceder como descrito anteriormente. Após a lavagem, e antes da esterilização, são tamponados com algodão. A esterilização é feita em estufa (180ºC, 90 minutos) ou em autoclave, quando já possuem meio de cultura em seu interior. Pipetas - são lavadas com água corrente, deixadas em solução detergente e novamente passada em água. Depois de secas, coloca-se uma mecha de algodão na boquilha e em seguida, são esterilizadas em estojos especiais ou embrulhadas em papel. No caso do uso de pipetas automáticas, as ponteiras devem ser esterilizadas e descartadas após o uso. Lâminas e lamínulas - uma vez retiradas do microscópio, são colocadas numa cuba contendo solução detergente. Daí são lavadas, deixadas uma noite em solução sulfocrômica e lavadas novamente. Observações: Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. É importante que se faça o esfriamento da alça antes de ser colhido o material. Em relação às semeaduras feitas em tubos de ensaio, deve ser flambada a boca dos mesmos, após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este deve ser mantido pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deixado sobre a mesa do laboratório. As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não poderão ficar abertas no ambiente, além do cuidado de manuseá-las sempre próximo a uma chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa voltada para baixo. 1.1 DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO Esterilização: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos. Desinfecção: Consiste na destruição, remoção ou redução dos micro-organismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local. Assepsia: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local. Anti-sepssia: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Limpeza: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização ESTERLIZAÇÃO A esterilização é o processo que inativa todos os micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminação, classificados como críticos, ou seja, aqueles que durante o procedimento penetrarão em pele e mucosa, ou serão introduzidos diretamente na corrente sanguínea, sendo portanto de alto risco. A melhor maneira de garantirmos a destruição de micro-organismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos micro-organismos que causam infecções em seres humanos desenvolve-se em temperaturas próximas a do corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o micro-organismo fica apenas inibido, e não é destruído. Alguns micro-organismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade. Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos. Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas definitivamente os métodos de esterilização mais empregados são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO (ESTUFA OU FORNO DE PASTEUR) Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos micro-organismos. A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.

10 Para ser eficiente, este processo depende de: - Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material. - Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados. - A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas. - O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO O calor úmido pode ser utilizado para destruir micro-organismos presentes em materiais através das formas de: vapor d água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição. - Água fervente É a água levada a ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os micro-organismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança, pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora. - Vapor d água O vapor d água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os micro-organismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos micro-organismos, e por este motivo é mais rápido. Funcionamento da autoclave: 1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol², na qual a temperatura do vapor é de 121ºC. A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores: Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida. A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado CONTROLE DA ESTERILIZAÇÃO É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente. O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis,que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este controle deve fazer parte da rotina do laboratório para garantir a saúde de pacientes e isolamento correto dos micro-organismos, como também biossegurança ocupacional CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES a) É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de serem submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue, e outras secreções) protege o microorganismo da ação esterilizante. É adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna antes da esterilização. b) Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrário voltam a se recontaminar com micro-organismos presentes no ambiente. c) Estudos recentes mostraram que os termômetros e termostatos embutidos na estufas em laboratórios não são confiáveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termômetros calibrados de acordo com as especificações do INMETRO. Se não for possível, deve-se considerar que o termômetro de mercúrio tem uma incerteza na medição da faixa de 5ºC a 10ºC. d) Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através de profissionais preparados para tal procedimento DESINFECÇÃO Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.

11 1- Desinfecção de alto nível: inativa todos os micro-organismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como semi-críticos, ou seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra. 2- Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como não-críticos, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (p. ex. estetoscópios, termômetros, gorro, máscara, refletor, etc.) 3- Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus. É indicada também para itens de uso não-crítico DESINFECÇÃO POR AGENTES FÍSICOS Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C) Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de micro-organismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos DESINFECÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS a) Método de Desinfecção de alto nível: - Glutaraldeído: é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com ph alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. - Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por 30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa. - Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por minutos. - Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos. b) Método de Desinfecção de nível intermediário: - Compostos Clorados: Causa a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucleicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos. - Álcoois (Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílico. - Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos nãocríticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia), e ação residual em materiais porosos. - Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos. c) Método de Desinfecção de baixo nível - Álcoois - Compostos Clorados - Fenólicos: em concentração menor que 5% - Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm - Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas, desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies) - Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e lípases, e,portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras (ex: Endozime ) A seguir (fig.4), são apresentados os principais agentes utilizadosem procedimentos de assepsia e desinfecção Figura 4: Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia

12 *Formas vegetativas; **Bacilos álcool-ácido resistentes; ***Ativos contra esporos Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Editora Atheneu 2 MEIO DE CULTURA Os micro-organismos possuem um ciclo natural na água, solo, ar, na nossa superfície corporal e de outros animais etc. Estes micro-organismos conseguem sobreviver à custa de materiais orgânicos e inorgânicos existentes nestes ambientes. O ciclo artificial (meio de cultura) é o modo que empregamos em laboratório para cultivarmos os micro-organismos. Chamamos de meio de cultura ao conjunto de substâncias necessárias ao crescimento e multiplicação dos micro-organismos SUBSTÂNCIAS NUTRITIVAS Substâncias nutritivas em concentrações adequadas, que devem servir como: - fonte de energia - fonte de nitrogênio - fonte de carbono - fonte de sais e íons - fonte de enxofre e fósforo - fatores de crescimento - doador de elétrons - receptor de elétrons 2.2. CONDIÇÕES AMBIENTAIS FAVORÁVEIS - temperatura (termófilos, mesófilos e psicrófilos) - umidade - ph ( de 2 a 9 ) - atmosfera de incubação (aerobiose, microaerofilia, anaerobiose) 2.3. TÉCNICAS PARA A EXECUÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA a) Usar somente substâncias químicas ou ingredientes de boa qualidade b) Fazer a pesagem corretamente c) Usar vidraria seca e limpa d) Usar apenas os ingredientes da fórmula e) Se necessário, filtrar f) Ajustar o ph do meio após a filtração, antes de juntar o agar g) Para manter a eficiência dos meios depois de prontos, conservá-los em lugar frio, escuro e em recipientes herméticamente fechados ESTADO FÍSICO (CONSISTÊNCIA) MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS São aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja, o meio sofre uma turvação. São utilizados para crescimento em massa (não promovem a formação de colônias, mas sim, crescimento por dispersão).

13 2.4.2 MEIOS DE CULTURA SEMI-SÓLIDOS São aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo proveniente de algas marinhas (0,5% de agar-agar). São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana MEIOS DE CULTURA SÓLIDOS São aqueles que possuem uma porcentagem maior de Ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em Ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de micro-organismos. para fazer isolamento, devido a formação de colônias (1,5 % a 2% de agar-agar) 2.5. FINALIDADE - Meios de enriquecimento: aumentam a possibilidade de crescimento da espécie desejada, quando a mesma se encontra em pequeno número. São adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar sangue. - Meios indicadores (ou diferenciais): revelam uma propriedade bioquímica, permitindo uma identificação presuntiva. Permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de micro-organismo. Ex: Ágar MacConkey. - Meios seletivos: impedem o crescimento de determinados grupos num inóculo misto, mas permite o desenvolvimento de outros. Aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Ágar SS (Salmonella-Shigella). - Meios seletivos-indicadores: revelam uma propriedade bioquímica e selecionam grupos de bactérias. - Meios de triagem: empregados para separar bactérias da mesma família. - Meios de transporte: garantem por mais tempo a viabilidade dos micro-organismos que não podem ser semeados logo após a coleta e que poderiam morrer. São aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente COMPONENTES BÁSICOS DOS MEIOS DE CULTURA - Extratos: de carne e de levedura. Concentrados aquosos desidratados que servem como fonte de: carboidratos, vitaminas, compostos orgânicos nitrogenados e sais. - Peptonas: derivados da hidrólise ácida ou enzimática de proteínas de origem animal ou vegetal (peptona de caseína, peptona de soja) que servem como fonte de N orgânico, vitaminas, carboidratos, enxofre, fósforo, cálcio e magnésio. - Agar-agar: polissacarídeo obtido a partir de algas rodofíceas. Função: agente solidificante, cujo P.F.= 95 C e o P.S.= 45 C. Não tem função nutritiva. - NaCl: mantém o equilíbrio osmótico do meio e serve como fonte dos íons Na e Cl. - Água: umidade e fontes de íons FÓRMULAS DE ALGUNS MEIOS BÁSICOS, DE USO ROTINEIRO EM BACTERIOLOGIA CALDO SIMPLES: AGAR SIMPLES: - Extrato de carne - 5 g - H2O ml - Caldo simples ( com ph aferido ) ml - Peptona - 10 g - ph: 7,4 +/- 0,2 - Ágar-agar - 20 g - NaCl - 5 g Obs.: Aferir o ph após a dissolução dos componentes, distribuir nos tubos, acondicionar e esterilizar. Modo de preparo: Fundir a mistura acima em banho-maria até a completa dissolução do ágar. -a- Meios em tubos: distribuir o meio ainda quente nos tubos e depois autoclavar (no caso de necessitarmos utilizar agar inclinado, inclinar os tubos após autoclavação, com o meio ainda quente para solidificação ). -b- Meios em placas: autoclavar o balão onde foi preparado o meio e a seguir distribuí-lo ainda quente, em placas previamente esterilizadas em forno de ar quente. Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização. Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas(figura 5): Figura 5: Classificação dos meios de cultura usados em Microbiologia

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15 3. ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA PARA O PREPARO DE MATERIAIS E MEIOS DE CULTURA - Preparar e empacotar espátula, pinça e cabo de bisturi, tesoura cirúrgica, alça de Drigalski, caixas de ponteiras (empacotar em papel pardo e identificar). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos. - Empacotar placas de Petri, identificar no pacote o conteúdo e autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Os pacotes deverão conter no máximo 08 placas. - Empacotar pipetas de 5 ml e 10 ml, identificar no pacote o conteúdo e autoclavar a 121ºC por 15 minutos. - Materiais autoclavados precisam ser secados em estufa de esterilização e secagem (65 70 ºC) antes de serem utilizados ou de serem guardados. - Calcular a quantidade necessária para o preparo do meio de cultura a ser pesado, para preparar 125 ml de meio. - Pesar assepticamente, a quantidade necessária do meio de cultura em béquer, cápsula de porcelana, papel vegetal ou alumínio. - Para a hidratação dos meios, acrescentam-se os volumes apropriados de água destilada ou água deionizada em cada recipiente, deixando de repouso por, aproximadamente, 10 minutos. Dissolver o restante com auxílio de um bastão de vidro. O ágar deverá ser aquecido até a completa dissolução. Vedar o recipiente com tampa (tubos) ou tampão (balões), identificar e autoclavar a 121ºC por 15 minutos (Observar o rótulo, pois alguns meios não podem ser autoclavados, em virtude da sua composição nutricional. Neste caso, usa-se vapor fluente ou filtração). - Meios de cultura, bem com de reagentes que venham ser preparados, e demais materiais preparados para os ensaios microbiológicos devem ser devidamente identificados (o que preparou e quando preparou). - Meios que serão usados logo após serem autoclavados devem ser mantidos em banho-maria, em temperaturas entre ºC e meios que serão usados posteriormente, devem ser armazenados, preferencialmente sob refrigeração,

16 QUESTIONÁRIO 1. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 2. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? 3. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado? 4. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante? 5. Qual a diferença entre os meios de enriquecimento e seletivo? 6. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: alimento)? 7. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente laboratorial? 8. O que é contaminação cruzada?

17 AULA 03a: Técnicas de coloração (Gram e endósporos) 1. COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS 1.1 PREPARANDO ESFREGAÇO PARA COLORAÇÃO A maioria das observações iniciais dos micro-organismos é feita de preparações coradas. Porém, antes que o micro-organismos possa ser corado, deve ser fixado (aderido) à laminado microscópio. A fixação simultaneamente mata o micro-organismo e o fixa na lâmina. Ela também preserva várias partes dos micro-organismos em seu estado natural, com apenas um mínimo de distorção. Os micro-organismos podem ser observados de duas maneiras: com e sem coloração. 1- Sem coloração: os micro-organismos são observados vivos, podendo ser evidenciada a motilidade. 2- Com coloração: os micro-organismos são corados após serem mortos. Quando uma amostra biológica precisa ser corada, um filme delgado de material contendo micro-organismos é espalhado sobre a superfície da lâmina. Esse filme, denominado esfregaço, é secado, passando-se sobre a chama de um bico de Bunsen, com o lado do esfregaço para cima, ou recobrindo a lâmina com álcool metílico por 1 minuto. A fixação do material é uma etapa importante, pois sem a fixação, a coloração poderia lavar os microorganismos da lâmina. Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, os micro-organismos são quase incolores não apresentando contraste suficiente com o meio em que se encontram o que dificulta sua visualização. A diferença química entre os micro-organismos e o meio é que nos permite distingui-las por meio de coloração, pois o corante não reage com o meio externo, tornando-as quando coradas, mais visíveis ao microscópio. Desta maneira poderemos observar suas formas fundamentais, dimensões e arranjos. Os corantes são sais compostos por um íon positivo e um íon negativo. A cor dos corantes básicos está no íon positivo e em corantes ácidos, está no íon negativo. Desse modo, o íon positivo colorido de um corante básico é aderido à célula bacteriana carregada negativamente. Os corantes básicos, cristal violeta, azul de metileno, verde de malaquita e safranina são mais comumente utilizados que os corantes ácidos. Exemplos de corantes ácidos são a eosina, a fucsiona ácida e a nigrosina. A coloração apresenta ainda outras vantagens, pois com a utilização da objetiva de imersão teremos uma maior amplificação da imagem, além de nos permitir o estudo de estruturas da célula bacteriana como: parede celular, endósporos, flagelos e cápsula. Para aplicar corantes ácidos ou básicos, utilizam-se três tipos de técnicas de coloração: simples, diferencial e especial. Na coloração simples utiliza-se apenas um corante e ela baseia-se na diferença química existente entre as bactérias e o meio. Uma vez coradas, apresentam contraste, podendo ser melhor visualizadas. Já a coloração diferencial utiliza geralmente 2 corantes, além do mordente e do diferenciador. Baseia-se na diferença química existente entre os micro-organismos e consequentemente na reação diferente que os micro-organismos podem apresentar frente a um determinado corante. É utilizada para distinguir diferentes tipos de bactérias. Os métodos de Gram (1884) (Figura 3) e de Ziehl-Neelsen (1882) são exemplos de coloração diferencial. As colorações especiais são usadas para corar e isolar partes específicas dos micro-organismos. Como endósporos e os flagelos, e para revelar a presença de cápsula. 1.2 COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE GRAM INTRODUÇÃO A coloração é um dos passos mais importantes para a identificação bacteriana. A finalidade é facilitar a observação microscópica das bactérias e diferenciá-las quanto às suas características morfotintoriais (Figura 3). Nas bactérias Gram-negativas, o álcool remove os lipídeos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; o complexo violeta de cristal-iodo pode assim ser extraído, descorando as bactérias. Nas bactérias Gram-positivas, o tratamento com álcool resulta na sua desidratação, com redução da permeabilidade da parede e consequente retenção do complexo violeta de cristal-iodo. Importância do método:. Separa as bactérias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS (G+/GP) e GRAM NEGATIVAS (G- /GN);. Taxonomia (identificação, classificação e nomenclatura, sendo o primeiro passo no processo de identificação);. Possibilita o diagnóstico presuntivo (preliminar), principalmente em casos de infecções graves e de evolução fatal quando o médico necessita introduzir uma terapêutica, antes mesmo da identificação do micro-organismo causador da infecção;. Permite evidenciarmos a contaminação a partir de diferentes materiais PREPARO DO ESFREGAÇO Coloca-se no centro da lâmina, com a alça de platina estéril uma alçada do material a ser examinado e com movimentos circulares espalhamos cuidadosamente. Se o material estiver em meio sólido, colocar previamente uma gota de solução salina estéril com a alça de platina no centro da lâmina e sobre esta uma alçada do material,

18 misturamos e espalhamos. O esfregaço deve ser fixado pelo calor, passando a lâmina três a quatro vezes pela chama do bico de Bunsen. O aquecimento fixa e mata as bactérias do esfregaço. Deixar a lâmina esfriar COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM A coloração de Gram é uma das mais importantes e rotineiras em Microbiologia, É uma coloração composta e diferencial, pois permite a diferenciação de bactérias em Gram positivas e Gram negativas. Técnica Cobrir o esfregaço com cristal violeta durante 1 minuto, escorrer o corante e lavar rapidamente. Cobrir a preparação com lugol, durante 1 minuto. Lavar em água corrente. Diferenciar com álcool etílico a 95% ou álcoolcetona até que não se desprenda mais corante (cerca de 30 segundos). Lavar e escorrer o excesso de água. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada diluída durante 30 segundos, Lavar em água corrente, escorrer, secar com papel de filtro e passar rapidamente na chama do bico de Bunsen para terminar a secagem. Examinar em microscópio ótico utilizando objetiva de imersão (100x). Figura 3: A coloração de Gram. 1.3 COLORAÇÃO ESPECIAL PELO MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN - TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE ENDÓSPOROS (Esporos) INTRODUÇÃO Esta coloração baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante, comparada com o resto da célula bacteriana, tornando possível a sua diferenciação. O esporo bacteriano é uma parede espessa formada no interior de algumas células bacterianas. É muito resistente ao calor e a outros agentes físicos e químicos; é capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa FINALIDADE Evidenciar a presença de esporos no interior do Bacillus sp MATERIAL Cultura em agar de Bacillus sp. Soluções: Verde malaquita a 5% em água Safranina a 1% em água Solução fisiológica Lâmina de microscopia e alça de platina ESFREGAÇO Espalha-se sobre uma lâmina, com o auxílio da alça de platina, uma gota do material a ser corado. Fixar pelo calor, passando-se a lâmina (a superfície sobre a qual foi feito o esfregaço voltada para cima) sobre a chama por 3 vezes PROCEDIMENTO TÉCNICO: Preparar esfregaço, secar a temperatura ambiente. Cobrir com solução de verde malaquita. Aquecer até o desprendimento de vapores por 6 minutos. (aquecer até a emissão de vapores e a partir daí iniciar a marcação do tempo) Não deixar ferver ou secar. Lavar em água corrente, suavemente.

19 Cobrir com solução de safranina durante 30 segundos. Lavar em água corrente e secar ao ar. Examinar no microscópio com objetiva de imersão RESULTADO O esporo se cora na de verde, porém o resto da célula ou a célula que não possui esporo se tinge de vermelho ou róseo INTERPRETAÇÃO Com a ação drástica do calor sobre a célula esporulada há penetração do verde malaquita no cerne do esporo e não há descoramento com a lavagem de água; quando se coloca a safranina, ela cora as estruturas da célula vegetativa que não conseguiram reter o verde malaquita.

20 QUESTIONÁRIO 1. Desenhe o que você observou (coloração de Gram e de endósporos): 2. Complete o quadro: Material/micro-organismo Morfologia Arranjo Gram 3. Complete o quadro a seguir, descrevendo o que ocorre na coloração de Gram. Cristal violeta Lugol Álcoo Fucsina Solução Bactéria Gram + Gram - 5. Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram? 6. Qual a razão das bactérias Gram positivas manterem a coloração violeta e as Gram negativas a coloração rosa? 6. Cite dois exemplos de micro-organismos Gram positivos (cocos e bacilos) e Gram negativos (cocos e bacilos) 7. Em uma coloração de Gram o técnico de laboratório esquece-se de colocar Lugol. O que acontecerá? 8. Qual a diferença básica entre uma célula vegetativa e um endósporo? 9. As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria a explicação para esse fato?