Aulas Práticas de Microbiologia Prof. Márcia G. Perdoncini AULA PRÁTICA CONDUTA E ATITUDES NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA:

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1 AULA PRÁTICA CONDUTA E ATITUDES NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA: 1- As normas regulamentadoras de segurança e saúde no trabalho do Ministério do Trabalho e Emprego devem ser seguidas. Estas estão disponíveis no site: < 2- O laboratório deverá ser utilizado, exclusivamente, com atividades para o qual foi designado. 3- É proibido o uso de qualquer aparelho de som e imagem, tais como rádios, televisões, aparelhos de MP3, reprodutores de CDs e DVDs e telefones celulares, entre outros. 4- É proibido fumar no laboratório. 5- É proibida a ingestão de qualquer alimento ou bebida nas dependências do laboratório. 6- É proibido o uso de medicamentos e a aplicação de cosméticos nas dependências dos laboratórios. 7- É proibido o manuseio de lentes de contato nas dependências dos laboratórios. 8- Deve-se evitar trabalhar com roupas folgadas, fios, pulseiras ou outro tipo de adornos que coloquem em risco a segurança. 9- Toda atividade que envolver certo grau de periculosidade exigirá obrigatoriamente a utilização de EPIs adequados (luvas, óculos, máscaras, jalecos, mangotes etc.). 10- É obrigatório o uso do jaleco até os joelhos, preferencialmente de manga longa, calça comprida até os pés, calçado completamente fechado e cabelo longo preso dentro das dependências do laboratório. 11- Os Equipamentos de Proteção Individual são de uso restrito às dependências do setor laboratorial e de uso obrigatório para todos no setor. 12- Vestuário, livros e outros objetos de uso pessoal, não necessários ao trabalho prático, deverão ser colocados em locais apropriados, nunca nas áreas de trabalho. 13- Em aulas práticas, os alunos de graduação só deverão ter acesso ao laboratório com a presença do professor responsável, do professor da disciplina usuária ou do técnico responsável, e durante o horário de expediente; o professor ou técnico deverá permanecer com os alunos durante todo o período de desenvolvimento das atividades. Exceções serão admitidas apenas mediante autorização por escrito do professor responsável. 14- Os usuários não deverão deixar o laboratório sem antes se certificar de que os equipamentos, bancadas, ferramentas e utensílios estejam em perfeita ordem, limpando-os e guardando-os em seus devidos lugares, de forma organizada. 15- Utilizar as tomadas elétricas exclusivamente para os fins a que se destinam, verificando se a tensão disponibilizada é compatível com aquela requerida pelos aparelhos que serão conectados. 16- Não levar à boca o material de trabalho (lápis, canetas, etc) e evitar colocar as mãos na boca, nos olhos e no nariz. 17- Lavar cuidadosamente as mãos antes e depois do trabalho prático. 18- Limpar as bancadas de trabalho com álcool 70 antes e depois do trabalho prático. 19- Não pipetar produtos com a boca, usar sempre os dispositivos mecânicos. 20- Não levar o material usado nas aulas práticas para fora do laboratório. 21- Evitar a contaminação das bancadas de trabalho, chão e cestos de papéis. O material contaminado nunca deve ser esquecido em locais desapropriados, nem colocado inadvertidamente em cima das bancadas de trabalho. 22- Colocar o material contaminado (pipetas, espátulas, lâminas e lamínulas) após a sua utilização em recipientes próprios contendo desinfetante. 23- Materiais para descontaminação (com cultivo microbiano) devem ser colocados antes do descarte em lugar apropriado e previamente identificado. 24- Relatar imediatamente ao docente qualquer acidente que provoque lesão corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura. 25- No final da aula prática, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado. 26- Verificar se o microscópio fica desligado, limpar as objetivas e colocar a capa protetora. 27- Verificar ainda se o gás ficou desligado. 28- Procedimentos de esterilização de materiais devem ser acompanhados completamente e se preciso, solicitar ajuda dos técnicos.

2 29- Equipamentos que usam calor e pressão precisam de cuidados redobrados no uso. Não deixar materiais sob aquecimento sem o seu acompanhamento. Pedir auxílio aos técnicos, se necessário. 30- Colocar vidrarias quentes sobre panos ou flanelas, e não diretamente sobre a bancada ou outras superfícies mais frias, pois podem trincar ou quebrar. 31- Cuidado ao trabalhar com vidrarias: elas são frágeis, fáceis de quebrar, e o estoque é limitado; 32- Manter um comportamento apropriado e com disciplina. Não correr e não fazer barulho desnessário. 33- Certificar-se da correta utilização dos equipamentos. Pedir explicação de uso aos técnicos, se necessário. 34- O professor (responsável pelo laboratório ou pela turma que estiver usando o laboratório) tem total autonomia para remover do laboratório o usuário que não estiver seguindo estritamente as normas de utilização (gerais e/ou específicas). 35- Em casos de acidentes (cortes, queimaduras, etc.) com equipamentos, vidrarias, reagentes, microrganismos procure manter a calma, comunique os técnicos e solicite ajuda. Existe um procedimento de atendimento para estes casos. A) Materiais mais utilizados no laboratório de microbiologia: 1. Alça de inoculação; 2. Autoclave; 3. Balanças; 4. Balão de fundo chato; 5. Bastão de vidro; 6. Becker; 7. Bico de gás; 8. Cálice; 9. Chapa elétrica; 10. Conta-gotas; 11. Erlenmeyer; 12. Escova para limpeza de vidrarias; 13. Espátulas; 14. Estante para tubos de ensaio; 15. Estufa; 16. Esterilizador; 17. Pisseta ou pissete 18. Funil; 19. Lâminas; 20. Lamínulas; 21. Microscópio; 22. Pera; 23. Pinças;

3 24. Pipetas; 25. Placa de Petri; 26. Provetas; 27. Tela de amianto; 28. Tripé; 29. Tubos 1 ) ALÇA DE INOCULAÇÃO: Arame de liga metálica e cabo; Transfere por toques leves, a amostra infectada para culturas 2) BALANÇA: Determina a massa de um corpo ( peso ) Balança analítica elétrica: cuidar com a conservação Balança analítica eletrônica: Estágio mais avançado décimo do grama ao milésimo do miligrama 3) BALÃO DE FUNDO CHATO: Balão de Florence ou Florença; Vários usos; Condicionamento e preparo de meios de cultura; 4) BASTÃO DE VIDRO: Muito usado; Agitação de soluções; Cuidado: não ser danificado nem danificar o recipiente; 5) BECKER: Copo de Becker, copo de Griffin, copo de Berlim; Varios usos; Pesagem e diluição 6) BICO DE GÁS: Chamas de diferentes intensidades ; Vários tipos; Bico de Bunsen, Bico de Tirril, Bico de meker; Cuidados no acendimento: 1. Segurar o fósforo aceso acima e ao lado do tubo; 2. Abrir cautelosamente a torneira de gás; 3. Chama acesa ( ajustá-la) : Amarelada e fumacenta: Falta ar Desprendendo do bico: Excesso de gás; Bico queimado por dentro: Mistura de ar e gás não está bem regulada apagar imediatamente o bico. Esfriar; Como acender corretamente o bico de gás: 1. Fechar a entrada de gás; 2. Abrir o gás e acender a chama; 3. Abrir o ar até obter uma chama totalmente azulada; 4. Se a chama não estiver azul e estiver totalmente aberto, diminuir o gás. 7) CÁLICE: Copo de precipitação ou sedimentação Usado em decantação ou substâncias quando em suspensão 8) CHAPA ELÉTRICA: Fonte de calor ( resistência elétrica); Protegida por material refratário ( ex. Amianto); Uso: Aquecimento de substâncias inflamáveis 9) CONTA GOTAS: Colorações 10)ERLENMEYER: Aquecer substâncias; Boca estreita: substâncias voláteis ou inflamáveis ( Vantagens sobre o becker) Agitação / destilação

4 Acondicionar meios de cultura 11) ESCOVA PARA LIMPEZA DE VIDRARIAS: Cuidado: evitar atrito entre sua parte metálica e o material a ser lavado 12) ESPÁTULA: Pesagem de sólidos e pastosos; Aço inoxidável, níquel, porcelana, madeira, osso, plástico. 13) ESTANTE PARA TUBOS DE ENSAIO: Suporta tubos na posição vertical; 14) ESTUFA: Estufa para cultura bacteriológica e estufa para secagem e esterilização de materiais; Parede dupla: Interna chapa de aço com anticorrosivo Externa aço ou madeira de lei Isolamento térmica : lã de vidro entre as paredes Regular a estufa Vidraria: Impecavelmente limpa e escorrida; Boca dos frascos sempre para cima; Retirar tampas; Retirar qualquer parte de plástico; Arrumar de maneira que não caia ou role quando abrir a estufa; Os tubos de ensaio devem ficar na estante; Feita a secagem, desligar a estufa e guardar a vidraria. 15) FRASCO LAVADOR, PISSETA OU PISSETE: Colocar água 16) FUNIL: Transposição de substâncias Filtração Haste: longa maior rapidez de filtração ; curta: menor rapidez de filtração 17) LÂMINA: Usada em microscopia Deve estar limpa e desengordurada para ser utilizada; 18) LAMÍNULA: Dá cobertura ao material colocado sobre a lâmina; 19) MICROSCÓPIO 20) PERA DE BORRACHA: Uso: sopro ou sucção Ex. Pipetar ácidos 21) PINÇAS: Uso variado Madeira: tubos de ensaio levados ao fogo; 22) PLACAS DE PETRI: Par de placas Acondiciona meios de cultura; 23) PIPETAS: Graduadas ou volume fixo a) escoamento total b) escoamento parcial volumétricas ou transferidoras Micropipetas. 24) PROVETA: Medir volumes sem grande previsão 25) TELA DE AMIANTO: Tela de arame com cimento à base de amianto Amianto: distribui o calor uniformemente; 26) TRIPÉ: Sustentam recipientes que devem ser aquecidos com o bico de Bunsen Aulas Práticas de Microbiologia

5 27) TUBOS: Uso variado Diâmetro e comprimento variam PROVETAGEM: Proveta: cilindro graduado / medir volumes Não é utilizado para volumes com alta precisão Calibração à 20C Substância becker proveta Becker bastão de vidro proveta ( paredes) Graduação LEITURA: 1. Analisar a proveta (capacidade, subdivisões,...) 2. Medida desejada parte inferior do líquido menisco solução transparente; 3. Parte superior do menisco substância opaca 4. Leitura: menisco à altura dos olhos do observador; Obs. A proveta deverá estar de repouso, se segurar com as mãos a leitura é incorreta. PIPETAGEM: 1. Mergulhar a pipeta limpa e seca na solução ( a ponta não deve tocar o fundo, nem ficar muito na superfície) 2. Sucção: até acima do volume desejado 3. Controlando com o dedo indicador ajustar o volume desejado ( menisco) 4. Retirando o dedo o volume escoa rapidamente OBS. Nunca pipetar líquidos corrosivos ou venenosos com a boca e sempre com a pera; Ao encher a pipeta deixar sempre a ponta da mesma abaixo da solução; A ponta da pipeta deve ficar em contato com a parede interna para o volume escoar completamente; Uma pequena quantidade sempre permanece na ponta da pipeta previsível AUTOCLAVE: Vários modelos: horizontais, verticais, gas, vapor; Laboratórios de microbiologia: Caldeira cilíndrica de paredes resistentes; Tampa com borracha: perfeita vedação Interior: suporte para cesta metálica; Fundo: espaça água (onde fica mergulhada a resistência) Tampa: orifício de escapamento, válvula de segurança e manômetro ( pressão e temperatura) Obs. Ar residual forma uma película no material, evitando a penetração do calor - O vapor tem ação esterilizante pois se condensa na superfície fria dos objetos cedendo-lhes seu calor latente.

6 AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA AULA PRÁTICA ASSUNTO: Uso do Microscópio Luminoso A) ROTEIRO TEORIA: Microscópio Luminoso: Partes Mecânicas: base ou pé, platina, presilhas, charriot, revólver, canhão, botões macrométrico e micrométrico, botões de controle coaxiais x e y, condensador, diafragma, botões do condensador, botão de abertura do diafragma. Lentes oculares Lentes objetivas Objetiva de imersão / Óleo de imersão Poder de resolução do microscópio (comprimento de onda da luz) Microscópio Eletrônico B) RESUMO TEORIA: Microscopia Luminosa e Eletrônica 1) Microscopia Luminosa (Microscópio Luminoso ou Óptico): - Produz ampliação máxima de cerca de 1000 vezes o tamanho original da amostra - Possui dois tipos de lentes: Objetivas e Oculares - São obtidas ampliações com poder de resolução de até 0,25 mícron (µm). A ampliação do microscópio é limitada pelo seu poder de resolução. 1.1) Poder de Resolução: - Consiste em distinguir dois pontos vizinhos, mostrando-os como detalhes separados e não como borrão ou soma de duas imagens; -Partículas colocadas a uma distância menor que 0,25 µm entre sí são vistas como uma partícula só. 1.2) Aumento Total do Microscópio Óptico: - É determinado pelo fator de ampliação da objetiva e o fator de ampliação da ocular, como mostra a tabela abaixo: Designação da objetiva Ampliação da objetiva Ampliação da ocular Ampliação total Baixo poder Médio poder Alto poder Imersão ) Partes do Microscópio Luminoso: - Base ou pé: apoio para a parte óptica;

7 - Platina: local onde se põe a lâmina contendo o material para análise; - Espelho ou fonte de luz (lâmpada de halogênio) - Condensador e diafragma: concentram os raios luminosos sobre a lâmina e o material em exame; - Tubo ou canhão: contém as lentes oculares e o revólver; - Revólver: peça giratória na qual se prendem as lentes objetivas; - Objetivas: ampliam a imagem do material observado. Gira-se o revólver da objetiva de menor aumento para a de maior poder de ampliação. - Objetiva de imersão: é a objetiva de maior aumento, caracterizada por um anel fino em sua extremidade; - Óleo de imersão: colocado entre entre a lâmina e a lente. O uso deste óleo permite que se captem os feixes de raios luminosos que seriam desviados pelas superfícies da lâmina e ar. - Lentes oculares: amplia a imagem já ampliada pelas objetivas; - Botões macrométrico e micrométrico: aproximam ou afastam a platina com a lâmina da objetiva para proporcionar um bom foco; - Macrométrico: faz aproximações e afastamentos amplos; - Micrométrico: faz aproximações e afastamentos pequenos; C) ROTEIRO PRÁTICA: 1. Observar as lâminas em objetivas de 5, 10 e 40 vezes 2. Observar as lâminas em objetiva de imersão

8 PROCEDIMENTO: Procedimento Geral: 1. Ligar o cabo elétrico na tomada. 2. Ligar a lâmpada. 3. Colocar o preparado no microscópio. 4. Ajustar a distância interpupilar (ver 1.4.2) e a dioptria (ver 1.4.1). 5. Colocar a objetiva de 10x no trajeto de luz. 6. Encostar o condensador na lâmina. 7. Regular a intensidade luminosa com o botão de ajuste correspondente, quando existir este dispositivo. A intensidade luminosa deve ser ajustada para cada tipo de objetiva. Quanto maior a capacidade de aumento, maior será a necessidade de iluminação. 8. Colocar a lente auxiliar em posição, nos microscópios com este dispositivo. 9. Fixar o preparado microscópico, montado em lâminas perfeitamente limpas, no "charriot" e colocar na posição desejada por meio dos controles coaxiais (Controles nas coordenadas X e Y). 10. Focalizar com o macrométrico. 11. Realizar a focalização fina com o controle micrométrico. 12. Movimentar o controle micrométrico para evidenciar estruturas existentes em vários níveis do preparado. 13. Movimentar toda lâmina através dos controles coaxiais de modo regular até encontrar a estrutura procurada. 14. Se necessitar de maior aumento, colocar as lentes correspondentes em posição e focalizar. NOTA: A lente frontal do condensador deverá estar na sua posição mais alta para que se possa aproveitar toda a sua capacidade. Observação com aumento de 10x e 20x: Geralmente utilizada para organismos grandes como helmintos e seus ovos e para focalização de lâminas. Observação com aumento de 40x: É possível a observação de alguns organismos maiores ou células neste aumento. É utilizado para pré-focagem do campo, pois torna mais cômoda a focalização fina com a objetiva de 100x. Para observação com este aumento é necessário a utilização de lamínulas. A espessura da lamínula não deve ultrapassar a 0,17 mm. Esta medida vem gravada na objetiva de 40x. A espessura da montagem da peça (corte histológico ou esfregaço mais meio de montagem e lamínula) deve ser o mais fina possível. A espessura excessiva interfere na formação da imagem devido à difração da trajetória do feixe luminoso. Observação com aumento de 100x (em óleo de imersão) É necessário utilizar óleo de imersão para que os raios luminosos não sejam desviados pela camada de ar entre a lente e a lâmina. - Focalizar o preparado com a objetiva de 40x; - Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o preparado (o óleo de imersão deve apresentar índice de refração ne = 1,518 e de dispersão de g = 43); - Colocar a objetiva de imersão (100x) em posição; - Encostar a lente frontal da objetiva no óleo por meio da manipulação dos controles coaxiais do "charriot"; - Focalizar através do controle micrométrico.

9 UTILIZAÇÃO DE LÂMINAS E LAMÍNULAS As lâminas devem ser transparentes, livres de manchas e devem medir um milímetro de espessura. As lamínulas devem medir 0,17 mm de espessura para permitir a formação de uma boa imagem. Preparo: - Lavar as lâminas e lamínulas com detergente comum, esfregando uma a uma; - Enxaguar em água destilada duas vezes para retirar os resíduos; - Secar e manter em frascos com álcool etílico comercial até o momento do uso. Descarte: - As técnicas de coloração nem sempre são suficientes para inativar o organismo presente na lâmina ou lamínula. - As lâminas e lamínulas devem ser tratadas como as demais vidrarias de laboratório, depositadas em frascos contendo desinfetante após o uso e descartadas por meio de tratamento pelo calor úmido. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO Durante o uso: Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartículas de saliva podem se depositar nas lentes. Nunca usar lenços faciais para limpeza de lentes pois estes podem conter filamentos de vidro que riscam a lente. Poderão ser usados tecido de linho ou algodão hidrófilo. Seguir rigorosamente as instruções do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes para a limpeza. Nunca usar álcool para limpeza de lentes, pois a cola usada na montagem das mesmas é freqüentemente solúvel em álcool. Limpar o óleo residual das objetivas ao final de cada uso com algodão hidrófilo, ou uma flanela macia, umedecido em xilol ou em éter-acetona 1:1. Nunca deixar os orifícios de conexão das objetivas e oculares abertos. Mantê-los fechados por plug de proteção adequados ou com as próprias oculares ou objetivas. Não tocar nas lentes com as mãos. Somente usar óleo de imersão que atenda a especificação estabelecida pelo fabricante. Nunca usar óleo de imersão para trabalhos com objetivas que não sejam de imersão. Estes óleos danificam as substâncias de montagem destas objetivas. Os microscópios devem ser colocados em superfícies isentas de vibrações e não são recomendadas mudanças de localização. Limpeza: Corpo: Usar álcool ou uma flanela levemente umedecida com água para limpeza do corpo do microscópio. Quando usar a flanela úmida, secar imediatamente com uma flanela seca. Lubrificar as partes móveis com lubrificante derivado do petróleo, como a vaselina, ou outro lubrificante recomendado pelo fabricante. Lentes e partes óticas: Retirar a poeira usando ar expulso por bulbo de borracha. Para limpar as lentes, usar tecido especial para limpeza de lentes levemente umedecido em solução limpadora (ex.: Kodak), específica para lentes de microscópios e equipamentos óticos. Resíduos de corantes podem ser retirados com algodão hidrófilo embebido em xilol.

10 ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: AMOSTRA: RESULTADOS:

11 AULA PRÁTICA ASSUNTO: Colorações ROTEIRO TEORIA: - Exame à fresco - Colorações: Coloração simples Coloração composta Etapas da coloração: preparação do esfregaço, fixação do esfregaço, coloração RESUMO TEORIA: - Exame à fresco - Coloração: Qualquer processo de coloração segue basicamente três passos: 1. Preparo do esfregaço: O esfregaço é a colocação dos microrganismos na lâmina de vidro para serem submetidos à coloração. Deve ser oval e delgado. 2. Fixação do esfregaço: serve para fixar os microrganismos do esfregaço na lâmina de vidro, para que posteriormente não sejam removidos durante o processo de coloração. Este procedimento faz com que o protoplasma das células dos microrganismos se coagule,aderindoos desta forma na lâmina. A forma mais utilizada de fixação de esfregaço, é passá-lo pela chama umas três vezes. Há também outros processos utilizando produtos químicos. 3. Coloração propriamente dita: são os procedimentos de cada técnica de coloração. PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO Para sucesso na observação, é necessário que o esfregaço seja bem feito, apresentando-se em monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualização. A secagem dos esfregaços deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaços podem ser fixados com calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes através da chama de bico de Bunsen. FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO Após secar, passar a lâmina com o esfregaço para cima, por três vezes pela chama do bico de Bunsen. COLORAÇÃO: As técnicas de coloração usadas em microbiologia se destinam à observação de estruturas morfológicas como esporos, flagelos e forma das células, diferenciando microrganismos. As colorações podem ser: Simples (quando se utiliza apenas um corante): estudo morfológico básico da célula, como forma e agrupamentos dos microrganismos. Ex. coloração por azul de metileno Diferencial ou Composta (quando se utiliza dois ou mais corantes): estudo morfológico e de algumas ultra estruturas dos microrganismos. Ex. Coloração de Gram, Coloração de esporos, Coloração de Flagelos, Coloração de Corpúsculos de inclusão, etc.

12 Coloração Simples Coloração Composta ou Diferencial COLORAÇÃO DE GRAM A coloração de Gram é uma das mais importantes em microbiologia, pois separa asbactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas. A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células bacterianas. Estas características diferenciais se referem à estrutura da parede celular dos microrganismos.

13 Os microrganismos que contêm altos teores de ácido teicóico (peptideoglicano) em sua parede celular se coram, pela coloração de Gram, em roxo-azulado intenso e são chamados de "Gram positivos". Os microrganismos que contém lipopolissacarídeos na membrana externa somente se coram com o contracorante, mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e são denominados "Gram negativos". Parede Celular de Bactérias Gram Positivas e Gram Negativas Reagentes 1. Cristal Violeta Este composto cora toda a célula em roxo-azulado intenso. Preparo Solução A: Cristal violeta (90-95% de pureza) - 2 g Etanol 95% - 20 ml Filtrar em papel de filtro. Preparo Solução B: Oxalato de amônio - 0,2 g Água destilada - 80 ml Preparo Solução de Trabalho: Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A. Deixar em repouso por 24 horas, filtrando em seguida. Estocar em frasco âmbar. 2. Solução de lugol (iodo iodeto de potássio) O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo insolúvel em água. Preparo da solução de trabalho: Cristais de iodo (ou ressiblimado) - 1 g Iodeto de potássio - 2 g Água destilada ml Misturar e deixar em repouso até dissolução.

14 3. Descorante A solução de etanol 95% - acetona atua como descorante. A descoloração ocorre apenas nas células de microrganismos Gram negativos. Alguns autores sugerem que o álcool altera a permeabilidade da membrana externa dos organismos Gram negativos, devido à sua ação sobre a membrana lipopolissacarídica, permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto da célula. Preparo da solução descorante de etanol - acetona: Acetona - 10 ml Etanol 95% ml 4. Safranina (contracorante) A safranina atua como contracorante tornando as células Gram negativas coradas e visíveis. As células de microrganismos Gram positivos provenientes de culturas velhas, lesadas por qualquer motivo ou mortas, também podem ser coradas pela safranina. Preparo do contracorante - Safranina O - Solução estoque: Safranina O - 2,5 ml Etanol 95% ml Solução de trabalho: Solução estoque de safranina O - 10 ml Água destilada - 90 ml

15 Etapas da Coloração de Gram COLORAÇÃO DE GRAM INTERPRETAÇÃO: Existem algumas teorias que explicam a coloração de Gram: 1. O mecanismo da coloração de Gram se refere á composição da parede celular, sendo que as Gram positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e as Gram negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos.

16 Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool - acetona) extrai os lipídeos, resultando então uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas. Assim o complexo cristal violeta - iodo ( CV-I ) pode ser retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude da sua composição diferente, torna- se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. 2. Outra explicação baseia- se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas bactérias Gram positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool- acetona, o que causa provavelmente uma diminuição da do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram negativas permanece suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com o álcool- acetona, possibilitando a extração do complexo CV-I. 3. Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com o álcool -acetona, as bactérias Gram negativas devido a pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, tem o complexo corado extraído pelo álcool, que deixa as células descoradas. ROTEIRO PRÁTICA: EXAME À FRESCO; 1. Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, cortando lentamente a chama do bico de Bunsen; 2. Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar, conservando-a todavia, perto da chama; 3. Tomar o tubo com a suspensão de microrganismos, agitá-lo levemente com a mão esquerda e, com os dedos mínimos e anular da mão direita, remover o tampão de algodão da boca do tubo; 4. Flambar a boca do tubo de cultura; 5. Introduzir a alça de repicagem, presa entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo, até tocar a suspensão; 6. Flambar novamente a boca do tubo de cultura; Fechar o tuba com o tampão de algodão e colocá-lo na estante; 7. Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão e depositar em seu centro uma gotícula de supensão; 8. Pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar uma lamínula; 9. Observar ao microscópio em objetiva de 40x. COLORAÇÕES: 1. Preparar o esfregaço: desengordurar e identificar a lâmina e, ao redor da chama do bico de Bunsen: 2. Colocar sobre a lâmina 1 gota da cultura líquida ou, se for cultura sólida, colocar 1 gota de solução fisilógica e espalhar a cultura sólida sobre esta gota com um alça de inoculação 3. Fazer o esfregaço, espalhando a cultura na lâmina com a alça de inoculação de modo que ele fique de forma oval, no centro da lâmina e delgado (pouco material). Deixar secar espontaneamente ao ar ao lado da chama do bico de Bunsen. 4. Após secar bem, fixar o esfregaço passando a lâmina por 3 vezes na chama do bico de Bunsen (com o esfregaço voltado para cima) 5. Levar a lâmina para a pia para a realização da coloração de Gram Coloração simples:

17 1. Colocar sobre o esfregaço o corante azul de metileno ou o corante Fucsina de Ziehl; 2. Enxaguar em água corrente de baixa pressão; 3. Após secar espontaneamente ao ar, observar em objetiva de imersão. 4. Desenhar os microrganismos observados e anotar e os resultados (morfologia celular, arranjos celulares). Coloração de Gram: 1. Preparar o esfregaço (vide acima); 2. Colocar sobre o esfregaço o corante cristal violeta e deixar por 1 min. 3. Colocar lugol sobre o esfregaço e deixar por 1 min. 4. Enxaguar em água corrente de baixa pressão. 5. Descorar o esfregaço com álcool-acetona 1:1 por aproximadamente 10 seg. 6. Enxaguar em água corrente de baixa pressão 7. Colocar o corante Safranina (ou o corante fucsina de Ziehl 10%) sobre o esfregaço e deixar por 30 seg. 8. Enxaguar em água corrente de baixa pressão. 9. Deixar secar espontaneamente ao ar. 5. Observar em objetiva de imersão. 6. Desenhar os microrganismos observados e anotar e os resultados (morfologia celular, arranjos celulares). Exercícios de fixação: 1) Descreva detalhadamente o processo de esfregaço, a partir de uma cultura bacteriana sólida. 2) Qual a diferença entre esfregaço de cultura sólida e o de cultura líquida? 3) Como se faz a fixação de um esfregaço bacteriano? 4) Esquematize as preparações a fresco e as preparações coradas simples observadas. 5) Descreva a técnica da coloração de Gram. 6) Explique porque bactérias Gram-negativas apresentam coloração diferente das bactérias Gram positivas. ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: REAGENTES: AMOSTRA: RESULTADOS:

18 AULA PRÁTICA Assunto: Averiguação da presença de microrganismos no ambiente e experimento de Price INTRODUÇÃO O meio aquático foi, provavelmente, o ambiente de origem dos microrganismos que, posteriormente, se especializaram e colonizaram o ambiente terrestre. Hoje, eles são encontrados em toda parte, em suspensão ou assentados com poeira em várias superfícies. Como os microrganismos estão presentes nas partículas de poeira, são passíveis de entrar no organismo do indivíduo cada vez que se respira. O ar deposita-se nos cabelos, nas roupas, na pele e nas mucosas. Do ar passam para o alimento e para a bebida. Felizmente, na sua maioria, os microrganismos são inócuos ou benéficos. São relativamente poucos os que causam prejuízos ao homem. É função do tecnólogo em alimentos estimular e otimizar o desenvolvimento de microrganismos benéficos e inibir aqueles que causam doenças ou deterioram os alimentos e o ambiente. As mãos, por outro lado, constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele deve ser reduzida, de modo a eliminar possíveis microrganismos patogênicos aí presentes. OBJETIVOS Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratório de microbiologia; Averiguar a presença de microrganismos no ambiente e na pele; Averiguar o efeito da higienização das mãos. PROCEDIMENTO A. - Verificação de contaminação ambiental 1. Remover a tampa de uma placa de Petri com ágar nutriente e expô-la em uma determinada condição de sua preferência. Ar: deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos; ou colocar a placa sobre o parapeito da janela e remover a poeira ao redor com um pano. Pele ou cabelo: passar os dedos em vários pontos da superfície do ágar; ou agitar vigorosamente os cabelos em direção à superfície da placa; Respiração: inocular na placa, tossindo ou espirrando, diretamente sobre a superfície do ágar; 2. Utilizar como controles uma placa com meio estéril fechada e outra aberta, por cerca de 60 segundos, próximo ao bico de Bunsen aceso; 3. Abrir um dos tubos de caldo nutriente, deixando-o aberto ao ambiente por alguns minutos; 4. Identificar as placas e os tubos; 5. Fazer a incubação das placas e dos tubos à temperatura ambiente por 7 dias. As placas devem ser incubadas invertidas, para evitar que o meio se desidrate e que água de condensação caia sobre a superfície do meio; 6. Após o período de incubação, anotar a presença e a diversidade morfológica das colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do ágar. B- Experimento de Price 1. Dividir o fundo da placa de Petri com ágar sangue em três partes, com lápis marcador, e identificar a placa. 2. Retirar um swab (zaragatoa) do tubo com assepsia e umedecê-lo em salina estéril; 3. Esfregar sobre a pele da palma da mão; 4. Semear em um terço da placa de ágar sangue, identificando-o como mão sem lavar

19 5. Lavar as mãos com detergente, vigorosamente, em todas as superfícies, durante 5 minutos; 6. Pegar outro swab esterilizado, umedecê-lo com salina e esfregá-lo nas palmas das mãos lavadas; 7. A seguir, semear o segundo swab em um terço da placa, identificando-o como mãos lavadas ; 8. Desinfetar as mãos pré-lavadas com álcool iodado (durante 1 minuto) ou álcool a 70% (também durante 1 minuto); 9. Pegar outro swab esterilizado, umedecê-lo com salina e esfregá-lo nas palmas das mãos lavadas e desinfetadas; 10. Semear na terceira parte do meio de cultura e identificá-la como mãos desinfetadas ; 11. Realizar a incubação a incubação a 37 C, por 48 horas, e fazer a leitura. EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 1. Em relação às placas com ágar nutriente (ar, pele, cabelo e respiração), enumere e caracterize as colônias que cresceram na superfície das placas, quanto a tamanho, cor e forma. Ar Respiração Pele ou cabelo Placa Número Cor Forma Tamanho 2. Em relação às placas com ágar sangue, esquematize o resultado obtido com a experiência de Price. Nome do aluno Mãos sem lavar Mãos lavadas Mãos desinfetadas 3. Qual a utilidade do bico de Bunsen no laboratório de microbiologia?

20 4. O que ocorreu com os controles? Justifique os resultados e tire suas conclusões sobre essa aula. ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: REAGENTES: AMOSTRA: RESULTADOS:

21 AULA PRÁTICA ASSUNTO: Preparo de Material de Laboratório para Análises Microbiológicas (Limpeza de Vidrarias: Descontaminação, Lavagem e Secagem) TEORIA /PRÁTICA: Todos os materiais (frascos, vidrarias, instrumentos, utensílios, etc) utilizados em uma análise microbiológica passam por diversas etapas até que se encontrem totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos. Para isto, são utilizados os agentes físicos e agentes químicos. Este trabalho envolve as atividades de descontaminação, descarte dos resíduos contaminados, lavagem, acondicionamento e esterilização. 1. DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DOS RESÍDUOS: 1.1. Material Novo: Toda a vidraria nova deve passar por um tratamento de limpeza, pois podem estar presentes esporos resistentes provenientes do material de embalagem; As vidrarias devem ser mergulhadas em água destilada, enxaguadas e submetidas a testes de ph, antes de serem utilizadas; Um outro método também utilizado é a fervura em da vidraria em solução detergente, causando assim a lise dos organismos; Proceder o resfriamento e lavagem completa com água destilada. Tampas de plástico ou borracha, tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento para a remoção de resíduos tóxicos: Mergulhar em água destilada, autoclavar a 121 o C/15 minutos e enxaguar com água destilada. Repetir este procedimento mais de uma vez Material Contaminado: Todo o material contaminado, incluindo os meios de cultura onde foi submetido o crescimento microbiano e demais utensílios que tenham entrado em contato com os microrganismos, principalmente os patógenos, devem ser submetidos à esterilização em autoclave a 121 o C por 30 minutos, observando os seguintes cuidados: Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca; Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os resíduos e facilitar a posterior remoção; Após passar por este processo de esterilização, os resíduos contidos nas vidrarias ou em outros materiais podem ser descartados. Obs.: Pode-se também proceder a descontaminação dos materiais em estufa à temperatura de o C por um tempo de 1-2 horas. Porém deve-se levar em consideração o seguinte critério: Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em estufa. Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor dilatam e podem sofrer alterações significativas nas medidas de volume; Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser submetidos à temperaturas muito elevadas por longos períodos Material não contaminado:

22 Materiais utilizados nas análises microbiológicas que não entram em contato com as culturas de microrganismos passam diretamente para a etapa de lavagem, descartando esta etapa de descontaminação. 2. LAVAGEM: Nesta etapa deve-se levar em consideração a escolha do detergente e os métodos de enxágüe, para a remoção dos resíduos Escolha do Detergente: Os detergentes mais utilizados são os aniônicos, principalmente aqueles que contém compostos alcalinos como os silicatos carbonatos ou fosfatos. O detergente escolhido deverá satisfazer os seguintes critérios: Ter a capacidade de amolecer a água fornecida localmente. Obs.: Água mole é aquela que carece de íons que formam sais insolúveis com os ácidos graxos de tal forma que o sabão espumará facilmente em tal fluido. Ter a capacidade de remover rapidamente o material orgânico à temperatura de 60 oc; Ser facilmente removido da vidraria após um enxágüe normal, com ph neutro; Depois de enxaguada a vidraria deverá estar livre de fatores antimicrobianos. Eventualmente, pode ser necessária a aplicação de um agente mais forte, principalmente para a limpeza de utensílios que não permitem a introdução de escovas, ou para a remoção de resíduos mais resistentes à ação dos detergentes. Nestes casos os agentes mais freqüentemente utilizados são a solução sulfocrômica e a solução de hidróxido de sódio a 1 N. O enxágüe dos utensílios deve ser feito de forma a garantir a completa remoção dos resíduos de detergente, solução sulfocrômica ou outro agente de limpeza utilizado. Os resíduos destes compostos podem interferir nas análises microbiológicas, tanto por alteração das características dos meios de cultura, como por inibição do crescimento dos microrganismos Procedimento para a lavagem: a. Remover todo o material contaminado nos frascos e utensílios; b. Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho por 2 horas ou mais, dependendo do grau de aderência do material a ser removido. Deve-se fazer um pré lavagem para retirar o excesso de material orgânico nas bacias de lavagem; Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em frascos separados, reesistentes ao calor, e submetidos à ação do vapor fluente por 15 minutos para a remoção dos resíduos de meio de cultura. c. Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais utensílios; d. Enxaguar todo o material em água corrente, por dez vezes consecutivas. e. Enxaguar em seguida com água destilada, pelo menos uma vez. No caso de pipetas recomenda-se o uso de um lavador de pipetas, mantendo cada batelada sob enxágüe contínuo, por pelo menos uma hora. 3. SECAGEM: Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais utensílios passam para a etapa de secagem; Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou em forno próprio para a secagem de materiais à temperatura de 100 o C por aproximadamente 1 a 2 horas. 4. ACONDICIONAMENTO: Os procedimentos seguintes referem-se aos frascos e utensílios vazios. Material com meios de cultura, diluentes e reagentes devem ser preparados, acondicionado e esterilizado seguindo as orientações geralmente contidas nos rótulos de embalagens ou no manual próprio de preparo de reagentes e meios de culturas.

23 a) Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até dez placas. b) Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesmo volume com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do estojo. Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou gaze para evitar danos nas pontas das pipetas. Pode-se também embrulhar as pipetas individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise, e e anotar externamente o volume da pipeta. c) Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas tampas no caso dos tubos rosqueáveis. Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo tamanho e volume, embrulhar com papel Kraft e vedar com fita crepe especial. d) Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft. e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente com papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise. 5. ESTERILIZAÇÃO: A destruição de todos os microrganismos presentes em um material, incluindo os esporos, é denominada esterilização. Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras, etc) após a etapa de acondicionamento devem ser esterilizados em autoclave (calor úmido) ou estufa (calor seco). A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, radiações, filtrações) ou químicos (óxido de etileno, beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeido) Esterilização pelo calor: A temperatura elevada é um dos métodos de maior eficiência e um dos mais utilizados na destruição de microrganismo. O calor pode ser aplicado tanto em condições úmidas (vapor ou água) quanto secas. O método que utiliza temperaturas extremas para matar os microrganismos é o da incineração 5.1. Esterilização pelo calor seco: Calor seco ou ar quente em temperaturas suficientemente altas, levam os microrganismos a morte. Entretanto esta técnica não é tão efetiva quanto o calor úmido e, portanto, são necessárias temperaturas muito altas e tempos de exposição maior. Por exemplo: a esterilização de vidrarias de laboratórios (como placas de petri, pipetas) requer um tempo de 2 horas de exposição a o C, enquanto que a esterilização dos mesmos materiais em autoclave requer somente 15 minutos a 121 o C. Há situações entretanto em que um material não poderá ser exposto à umidade, e o método pelo calor seco é preferido Flambagem: Consiste em passar o material sobre a chama de um bico de Bunsen ou lamparina. Utilizado para bocas de tubos de ensaio, lâminas de vidro e, eventualmente para espátulas, sondas, etc. Para tubos de ensaio, a flambagem tem finalidade de evitar possíveis contaminações na transferência ou inoculação de culturas. No caso de lâminas, espátulas e sondas a flambagem é efetuada após imersão em álcool, não implicando necessariamente em esterilização Aquecimento ao rubro em chama:

24 Utilizado para esterilização de alças e agulhas de inoculação. Aulas Práticas de Microbiologia Uma alça de inoculação pode ser esterilizada colocando-se na chama do bico de Bunsen por alguns segundos. Parte mais quente x Parte mais fria Quando a alça de inoculação é colocada na chama, gotículas podem ser formadas, resultando em propagação de organismos vivos. Para prevenir, deve-se colocar a alça primeiramente na porção mais fria da chama e só depois colocá-la na parte mais quente Ar quente (Estufa ou forno de Pasteur): Pipetas e placas de Petri são esterilizadas a uma temperatura de o C por um período de 1 a 2 horas em equipamento denominado Forno de Pasteur ou mais conhecido como estufa de esterilização. O papel que protege o material deve adquirir cor parda, porém não deve escurecer muito ou se tornar quebradiço. Após o término da esterilização, deve-se esperar a o resfriamento total da estufa antes de se abrir a porta da mesma. Isto deve ser feito para se evitar mudança brusca de temperatura nas vidrarias o que levaria à quebra das mesmas Esterilização por Calor Úmido: O calor úmido é muito mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos. Isto porque o calor úmido causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas, enquanto o calor seco causa oxidação dos constituintes orgânicos da célula (isto é, ele queima lentamente as células). A desnaturação de proteínas celulares ocorre com temperaturas e tempos de exposição menores do que aqueles requeridos para a oxidação. Por exemplo: os esporos de Bacillus anthracis são destruídos entre 2 e 15 minutos pelo calor úmido a 100 o C, mas com o calor seco leva mais de 180 min a 140 o C para conseguir o mesmo resultado. Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida. Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são muito mais sensíveis ao calor e usualmente são mortas dentro de 5 a 10 minutos pelo calor úmido a o C.

25 Células vegetativas de leveduras e outros fungos são geralmente destruídas entre 5 e 10 minutos pelo calor úmido a o C. Para matar os esporos dos fungos no mesmo período de tempo são necessárias temperaturas de o C. A susceptibilidade dos protozoários e de muitos vírus ao calor é similar àquela da maioria das células vegetativas. O calor úmido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de vapor, água fervente ou água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição Vapor d água sob pressão: O uso do vapor d água sob pressão é o método mais prático e seguro de aplicação do calor úmido. Em um sistema fechado de volume constante, um aumento de pressão permitirá um aumento na temperatura. Vapor d água sob pressão fornece temperaturas maiores do que aqueles possíveis com vapor sem pressão ou água fervente. Há a vantagem também de um aquecimento rápido e maior penetração do calor. O aparelho destinado a esterilizar com vapor de água sob pressão é a autoclave. AUTOCLAVE: Desenvolvida no século XIX, a autoclave é um equipamento essencial em todo o laboratório de microbiologia. Muitos meios de culturas, soluções e materiais contaminados são esterilizados rotineiramente com este aparelho. A autoclave parece uma panela de pressão no sentido em que ambas utilizam vapor sob pressão, porém a temperatura e a a pressão interna na autoclave podem ser bem mais controladas. Â câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente lavada com vapor fluente, para remover todo o ar. É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período especifico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d água. Se o ar estiver presente, reduzirá a temperatura interna da autoclave. É a temperatura e não a pressão no interior da câmara, que mata os microrganismos Uma autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb/pol2, na qual a temperatura do vapor é 121oC. O tempo necessário para esterilizar nesta temperatura depende do material que está sendo tratado. Leva mais tempo para o calor penetrar em um material viscoso ou sólido do que em material fluido. O tempo necessário também depende do volume do material que está sedo esterilizado. Por exemplo, tubos contendo 10 ml cada de um meio líquido podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121 o C, enquanto o mesmo volume de meio (10 litros) em um único frasco necessitará de uma hora ou mais, pois mais tempo será requerido para o calor penetrar no centro do material volumoso. Vapor sob Pressão (autoclave): É o método mais eficiente para esterilizar meios de cultura e soluções diluentes. Deve ser utilizado para todo meio que resiste a altas temperaturas sem se alterar. Também é utilizado para vidrarias e para esterilização de cultivos e material contaminado antes da lavagem. A esterilização na autoclave geralmente é atingida a uma temperatura de 121 o C por minutos a uma pressão de 15 lbs. Obs. Ao usar a autoclave é importante que todo o ar seja removido antes que a pressão seja aumentada, pois uma mistura de ar e vapor resulta numa temperatura menor a uma dada pressão.

26 Por exemplo: se 1/3 do ar permanece na autoclave, a temperatura atingida será de apenas 115 o C. Corte longitudinal de uma autoclave ilustrando as partes e a via do fluxo de vapor Vapor Fluente: Consiste em tratar térmica,mente um material à temperatura de 100 o C, em autoclave, sem utilizar a pressão de vapor. É utilizados para certos meios de cultura que sofrem alterações quando submetidos a tratamentos térmicos acima de 100 o C. O tratamento pode ser: Por aquecimento a 100 o C por no mínimo 60 minutos por máximo de 90 minutos; Calor intermitente (tindalização): por aquecimento a 100 o C por 30 minutos, repetindo este tratamento por três dias consecutivos, sendo o meio incubado nas condições que será usado entre um aquecimento e outro. O aquecimento do primeiro dia mata as formas microbianas vegetativas presentes no meio; Durante a incubação entre um aquecimento e outro, possíveis formas esporuladas germinam e então são destruídas nos aquecimentos subseqüentes Esterilização por Filtração: Os filtros são utilizados para esterilizar materiais que não podem ser submetidos aos outros processos de esterilização. São utilizados filtros ou membranas filtrantes capazes de reter os microrganismos.

27 Estas membranas filtrantes são discos de ésteres de celulose finos (150 µm), com poros pequenos, que retém os microrganismos. Um sistema de filtração por pressão positiva muito utilizado para pequenos volumes (até 100 ml) é o Swinnex filter-holderr (Millipore Filter Corporations) que é facilmente adaptados a seringas hipodérmicas. Para evitar a contaminação do analista por partículas aerossóis que são emitidas durante a manipulação de materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de segurança biológica que empregam sistema de filtração. O ar é aspirado para dentro do equipamento e filtrado através de filtros de acetato de celulose aderido a uma folha de alumínio, com a finalidade de reter 99 % de partículas presentes no ar Esterilização por radiações: Radiação ultra violeta ( nm) agem sobre o DNA da célula do microrganismo tornando-o inativo. As fontes são: lâmpadas de vapor de mercúrio a baixa pressão. 6. SECAGEM DE MATERIAIS: Esta etapa pode ou não ser realizada. É utilizada quando a etapa de esterilização é por calor úmido (autoclave). Geralmente após este tipo de esterilização, os materiais ficam úmidos, podendo facilitar uma contaminação. A secagem pode ser realizada em estufa de Pasteur a temperaturas de no máximo 100 o C. A armazenagem dos materiais deve ocorrer apenas após os mesmo estarem totalmente secos. AULA PRÁTICA ROTEIRO: Preparar os materiais e vidrarias para serem utilizados em análises microbiológicas, seguindo a seguinte ordem: 1. Descontaminação em autoclave (121 o C por 30 minutos) 2. Descarte dos resíduos; 3. Lavagem e enxágüe; 4. Secagem; 5. Acondicionamento em papel Kraft; 6. Esterilização em autoclave; 7. Armazenamento Obs. Identificar os pacotes de vidrarias acondicionados com o nome da equipe, a data da esterilização e volume da vidraria quando pertinente; Usar luvas de borracha para a lavagem das vidrarias; Usar avental especial para a lavagem das vidrarias; Não esquecer do último enxágüe em água destilada; Não esquecer de retirar o ar residual da autoclave. Exercícios de fixação: 1) O que indica a mudança de cor da ampola com Bacillus stearothermophilus? 2) Descreva o procedimento necessário para esterilização de materiais em autoclave (placas de Petri, pipetas e bonecas). 3) Porque se deve sempre esperar que a autoclave escoe todo o vapor (posição zero do manômetro) antes de se proceder à abertura da tampa?

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