Noções Básicas na Prática Microbiológica. Microbiologia Clínica Prof. Thiago Marconi Cardoso

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1 Noções Básicas na Prática Microbiológica Microbiologia Clínica Prof. Thiago Marconi Cardoso

2 Pedido do Exame Preparo do paciente Pré-analítico Frequência de erros ~60-70% Obtenção da amostra Procedimento de medição Analítico ~20-30% Procedimento pós-analítico Resultado Pós-analítico ~10% Avaliação médica do resultado

3 Requisição Médica Envolvimento do médico com laboratório pode ser útil Microbiologia envolve etapas interpretativas (flora normal) Suspeita clínica é importante para direcionar os testes Requisição deve conter maior número de informações

4 Condições de Segurança Um profissional de laboratório nunca deve realizar qualquer procedimento sem antes conhecer as condições de segurança necessárias à execução de suas tarefas: Normas de biossegurança Cuidados com derramamentos Cuidados com materiais pérfuro-cortantes Cuidados com respingos Cuidados com aerossóis Conhecimento de técnicas de esterilização e desinfecção

5 Coleta Todo resultado liberado pelo laboratório é conseqüência da qualidade da amostra recebida O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico, favorecendo o desenvolvimento de flora contaminante e induzindo a um tratamento não apropriado

6 Procedimento de Coleta Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível Instruir claramente o paciente sobre o procedimento Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado Considerar o estágio da doença na escolha do material Colher quantidade suficiente de material para permitir completa análise microbiológica

7 Transporte e Conservação de amostras Deve assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo Evitar erro de interpretação de culturas quantitativas Antes da coleta verificar a disponibilidade dos meios de transporte

8 Temperatura de transporte Temperatura Ambiente Líquor Aspirado de joelho Swab vaginal Swab cervical Secreções anaeróbias 35º C - Estufa Hemoculturas Secreção ocular em placa 2 a 8º - Geladeira Urina Fezes Escarro

9 Transporte das Amostras

10 Critérios de Rejeição de Amostras Discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico Falta de identificação da amostra Origem da amostra ou tipo de amostra não identificada Teste a ser realizado não especificado

11 Amostras Inadequadas Material colhido em formol Frascos não estéreis Swab seco Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície externa. Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas Urinas colhidas há mais de 24 horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração

12 Amostras não recomendadas

13 Procedimentos no laboratório de Microbiologia Microscopia Preparo de esfregaços Exame direto a fresco Exames diretos corados (Gram e Ziehl) Exame direto em campo escuro Inóculo Seleção de meios de cultura Incubação Atmosfera Tempo Temperatura

14 Procedimentos no laboratório de Microbiologia Morfologia colonial Contagem de colônias Identificação bacteriana Provas bioquímicas Antibiograma Métodos não convencionais Automação Biologia molecular

15 Fluxograma de exames microbiológicos

16 Referências Bibliográficas ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Brasília: Editora ANVISA, 2004; Guder, WG. Coleta de amostras: do paciente para o laboratório: o impacto das variáveis pré-analíticas sobre a qualidade dos resultados laboratoriais. São Paulo: Editora Câmara Brasileira do Livro, 1996; Oplustil, CP. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2. ed. São Paulo: Editora SARVIER, 2004.

17 Staphylococcus sp Streptococcus sp Cocos Gram positivos Catalase + Catalase - Microbiologia Clínica Prof. Thiago Marconi Cardoso

18 Staphylococcus sp COCOS GRAM POSITIVOS DE INTERESSE MÉDICO

19 Família Micrococcaceae Staphylococcus Micrococcus Planococcus

20 Principais Espécies S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

21 Fatores de virulência Proteína A Componente da parede celular Liga-se à porção Fc da IgG Reduz opsonização e fagocitose e tem efeitos quimiotáticos Cápsula Proteção contra fagocitose

22 Fatores de virulência Toxinas e enzimas Coagulase: converte fibrinogênio em fibrina Catalase: catalisa a remoção do peróxido de hidrogênio Hialuronidase: hidrolisa o ácido hialurônico no tecido conjuntivo, promovendo a disseminação dos Staphylococcus nos tecidos Fibrinolisina: dissolve coágulos de fibrina Lipases: hidrolisa lipídeos Nucleases (DNAse): hidrolisa DNA Penicilinase: hidrolisa penicilinas

23 Fatores de virulência Exotoxinas Três mais importantes: * Enterotoxina: causa intoxicação alimentar, vômitos e diarréia. É resistente ao calor O alimento é (1) cozido, (2) Manipulado (portador) e (3) deixado resfriar lentamente a bactéria produz e secreta a toxina mesmo que o alimento seja reaquecido, a toxina não é destruída * Toxina da Síndrome do Choque Tóxico: mulheres menstruadas (absorvente interno) ou pacientes com infecções de feridas * Esfoliatinas (5% das cepas de S. aureus) - Ação localizada Impetigo Bolhoso ( Bolhas na pele) - Ação generalizada Síndrome da Pele Escaldada (toxina é produzida no sítio de infecção e levada pela corrente circulatória)

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25 S. Aureus agente mais comum de infecções piogênicas Intoxicações Decorrente de um processo infeccioso: 1. Síndrome da pele escaldada - Deslocamento de extensas áreas da epiderme - Toxina esfoliatina ou epidermolisina 2. Impetigo bolhoso (ação localizada) Na ausência de processo infeccioso: 1. Intoxicação alimentar - Ingestão de toxinas previamente formadas em alimento contaminado pelo S. aureus - Chamadas enterotoxinas (superantígenos) são termostáveis 2. Síndrome do choque tóxico - Geralmente mulher no período menstrual - Febre alta, eritema com descamação da pele, insuficiência renal, diarréia, etc. - Uso de tampões absorventes X S. aureus na mucosa vaginal

26 S. aureus agente mais comum de infecções piogênicas Pele Foliculite Infecção de um folículo piloso em decorrência de sua obstrução Furunculose Infecção de folículos pilosos ou glândulas sebáceas obstruídas, com envolvimento de tecido celular subcutâneo. Carbúnculo Furúnculo com vários sítios de drenagem localizado na nuca ou parte superior das costas. Terçol Infecção de glândula sebácea marginal das pálpebras. Indivíduos debilitados Bacteremia Pode ter origem em qualquer infecção estafilocócica localizada Endocardite Pode surgir em decorrência de bacteremias, ou em conseqüência de próteses e processos cirúrgicos cardíacos. Pneumonia Mais freqüente no primeiro ano de vida. As viroses respiratórias podem predispor à pneumonia por S. aureus

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28 S. saprophyticus Staphylococcus Mecanismos de patogenicidade: aderência ao epitélio urinário Causa infecção urinária em mulheres jovens sexualmente ativas S. epidermidis * Bacteremia * Infecções de próteses valvulares ou articulares * Infecções de ferimentos cirúrgicos * Endocardite

29 Diagnóstico - Cultura Placa de Ágar Sangue, a 35º C, horas Crescimento rápido em condições aeróbicas ou microaerófila Em meios sólidos, as colônias são redondas, lisas, elevadas, cremosa, brilhantes, amarela ou branca As colônias de S. aureus normalmente ß-hemolíticas são amarelo-ouro, As colônias de S. epidermidis apresenta coloração branca não hemolítica

30 S. aureus S. epidermidis

31 Hemólise em AS Ausência de hemólise Alfa Beta

32 Diagnóstico - Catalase Diferencia Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) Reagente: H 2 O 2 a 3% Reação: 2H 2 O 2 + Catalase 2H 2 O + O 2 Procedimento: Gotejar 1ml do reativo sobre o crescimento bacteriano. O meio não poder conter sangue; Alternativamente pode-se fazer o teste em lâmina, retirando-se uma porção da colônia da placa, tendo cuidado de não tocar no meio de cultura.

33 Catalase Positivo Staphylococcus Cocos Gram positivos Teste da Catalase Catalase Negativo Streptococcus

34 Diagnóstico - Coagulase Diferencia S. aureus (coagulase +) de outras espécies Reagente: Plasma não diluído de coelho Procedimento: Emulsionar alça cheia de bactéria em solução salina Adicionar 1 gota do plasma e homogeneizar Resultado positivo é indicado por aglutinação em 10-15

35 Coagulase Positivo S. aureus Catalase Positivo Staphylococcus Teste da Coagulase Cocos Gram positivos Teste da Catalase Coagulase Negativo Staphylococcus Coagulase negativo Catalase Negativo Streptococcus

36 Diagnóstico - Novobiocina Teste de sensibilidade à Novobiocina Staphylococcus saprophyticus são resistentes S. saprophyticus S. epidermidis ou S. aureus

37 Diagnóstico - DNAse DNAse» Incubar por horas em meio específico» Adicionar ácido clorídrico após incubação» Reação positiva: Presença de zona transparente ao redor do crescimetno bacteriano S. aureus positivo S. epidermidis e S. saprophyticus negativo

38 ESPÉCIE COAGULASE ou DNAse SENSIBILIDADE À NOVOBIOCINA S. aureus + Sensível S. epidermidis Sensível S. saprophyticus Resistente

39 Tratamento 95% cepas resistentes á Penicilina G * ß-lactamase * Penicilina sensível à ß-lactamase (amoxicilina) * Penicilina resistente à ß-lactamase (naficilina ou cloxacilina) e algumas cefalosporinas e vancomicina * Associação de Penicilina sensível à ß-lactamase com ácido clavulânico (inibidor de ß-lactamase). 20% são resistentes a meticiclina (ou naficilina) droga de escolha é a Vancomicina.

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41 Streptococcus sp COCOS GRAM POSITIVOS DE INTERESSE MÉDICO

42 Cocos Gram (+) Catalase (-) Família Streptococcaceae Principais Gêneros: Streptococcus Enterococcus Lactococcus Vagococcus

43 Epidemiologia Comumente encontrado como parte da flora normal Contaminantes de espécimes clínicos Espécies importantes: Estreptococos β-hemolíticos: S. pyogenes (Grupo A) S. agalactiae (Grupo B) Grupos C, F e G S. pneumoniae Estreptococos Grupo D S. bovis e S. equinus Enterococos E. faecalis E. faecium Estreptococos viridans (Latim: vĭrĭdis = verde) S. mutans S. salivarius S. mitis

44 Categorias de estreptococos de importância médica: 1. Estreptococos beta-hemolíticos (ou piogênicos) 2. Pneumococos 3. Estreptococos do Grupo D (S. bovis) 4. Estreptococos Viridans Estes estreptococos podem ser facilmente identificados utilizando testes laboratoriais relativamente simples: Grupo Sorológico Características Hemólise Bacitracina Optoquina Bile Solub CAMP BE PYR NaCl 6,5% S. pyogenes A b S (R) R S. agalactiae B (b) R R (+) Grupos C e G C ou G b R R S. bovis D g, a R R S. pneumoniae - a R S Viridans (-) g, a (R) R - - (-) - - Enterococcus -* a b, g R R

45 S. pyogenes Patogênese Fatores de virulência: Estreptolisinas S e O: provoca produção de autoanticorpos febre reumática e glomerulonefrite Faringite 90% das faringites bacterianas Piodermites Impetigo e erisipela S. agalactiae Infecções geniturinárias Meningite neonatal Infecções pós-parto

46 S. pneumoniae Patogênese Pneumonia Meningite Septicemia Otite média Sinusite Vacina polissacarídica 23 valente S. bovis Bacteremia, meningite e endocardite Associado a carcinoma de cólon

47 Patogênese Grupo Viridans Bacteremia Endocardites Abscessos Infecções do trato geniturinário S. mutans formação de placa dentária Enterococcus spp. Infecções nosocomiais Infecções urinárias

48 Diagnóstico Laboratorial Cultivo em AS, 35º C, 5 a 10% de CO 2 Hemólise em AS Ausência de hemólise Alfa Beta Streptococcus Grupo D S. penumoniae S. viridans Streptococcus Grupo D S. pyogenes Streptococcus Grupo B e D

49 Catalase Positivo Staphylococcus Cocos Gram positivos Teste da Catalase Catalase Negativo Streptococcus

50 Sensibilidade à Bacitracina Discos de Bacitracina inibem o crescimento do S. pyogenes em ágar sangue Sensível: formação do halo de inibição. Resistente: não há formação do halo de inibição S. agalactiae S. pyogenes

51 Teste do PYR (Pirrolidonil-β-Naftilamida) Avalia a capacidade da bactéria hidrolisar a PYR. Reação positiva: Cor vermelha após 5 Enterococcus e Streptococcus Grupo A (S. pyogenes) - +

52 Sensibilidade à Optoquina Discos de Optoquina inibem o crescimento do S. pneumoniae em ágar sangue Sensível: formação do halo de inibição > 14 mm Resistente: não há formação do halo de inibição (< 10mm)

53 Solubilidade em Bile Realizado quando inibição da optoquina fica entre 10 e 14 mm 20% dos pneumococos são resistentes à optoquina Teste positivo: Meio fica límpido S. pneumoniae Teste negativo: Meio continua turvo Enterococos, Grupo Viridans ou Grupo D

54 Teste de CAMP Identifica Streptococcus Grupo B (S. agalactiae) Inocula uma amostra de S. aureus produtor de beta lisina Inocular as amostras testes em estrias perpendiculares As estrias devem estar próximas mas não encostar no S. aureus S. agalactiae S. aureus S. pyogenes

55 Hidrólise do Hipurato A enzima hipuricase hidrolisa o hipurato para produzir glicina, que é detectada por oxidação Reação positiva: Cor Azul escura S. agalactiae Hipurato positivo

56 Meio de Bile Esculina Ágar Meio de cultura com 40% de Bile Reação positiva é detectada com a hidrólise da esculina no meio, escurecendo o meio Positivo: Enterococcus spp. e Streptococcus bovis

57 Caldo Hipercloretado (NaCl 6,5%) Avalia a capacidade de crescimento em meio com altas concentrações de sal Positivo: Enterococcus spp. Negativo: Streptococcus bovis

58 COCOS Gram-Positivo Catalase (+) ( - ) Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Morfologia colonial / hemólise ß-hemolítico α-hemolítico Não-hemolítico

59 β-hemolítico Bacitracina PYR Bacitracina (S) PYR (+) S. pyogenes Grupo A Bacitracina (R) PYR (-) Teste do CAMP Hidrólise do Hipurato S. agalactiae Grupo B Teste do CAMP (+) Hidrólise do Hipurato (+) Teste do CAMP (-) Hidrólise do Hipurato (-) Bile Esculina Enterococos PYR (+) / NaCl 6,5% (+) Bile Esculina (+) Bile Esculina (-) PYR / NaCl 6,5% Não Grupo A, B ou D Grupo D PYR (-) / NaCl 6,5% (-)

60 α-hemolítico Optoquina Optoquina (S, >14 mm) Optoquina (I, mm) Optoquina (R, <10 mm) S. pneumoniae Bile Solubilidade S. pneumoniae Bile Solubilidade (+) Bile Solubilidade (-) Bile Esculina Enterococos PYR (+) / NaCl 6,5% (+) Bile Esculina (+) Bile Esculina (-) PYR / NaCl 6,5% Grupo Viridans Grupo D PYR (-) / NaCl 6,5% (-)

61 Não-Hemolítico Bile Esculina Bile Esculina (+) Bile Esculina (-) PYR / NaCl 6,5% Outros Streptococcus não hemolíticos PYR (+) / NaCl 6,5% (+) PYR (-) / NaCl 6,5% (-) Enterococos Grupo D

62 Tratamento Casos de resistência bacteriana a Penicilina são raros Tratamento de Primeira Escolha: Penicilina G Pacientes alérgicos: Eritromicina Cefalosporinas