Preparo de Materiais em microbiologia,meios de cultura usados no laboratório, técnicas de semeadura e Colorações

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1 Preparo de Materiais em microbiologia,meios de cultura usados no laboratório, técnicas de semeadura e Colorações Prof (a) Dr Luciana Debortoli de Carvalho

2 Preparo de materiais

3 Meios de Cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material Agar sangue (AS) meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos

4 Meios de Cultura Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

5 Meios de Cultura Agar chocolate (AC) meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfa- hemolíticas. À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes.

6 Meios de Cultura ÁGAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus. Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: azul claro. Colônias lactose positiva: cor amarela. Colônias lactose negativa: cor azul.

7 Meios de Cultura Agar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. Lactose positiva coloração avermelhada Lactose negativa coloração inalterada Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus

8 Meios de Cultura Ágar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos.

9 Meio de Rugai Este meio é utilizado para identificação presuntiva das principais espécies de Enterobactérias. Sua finalidade principal é a triagem bioquímica de colônias isoladas nos meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidasenegativa. Em um único tubo a leitura é possível verificar 9 reações: motilidade da bactéria indicado pela turvação da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentação da glicose em profundidade e da sacarose na superfície do meio, produção de gás sulfídrico (H2S), gás em glicose, utilização do aminoácido L-triptofano (desaminação), hidrólise da uréia e no tampão do tubo, um desenvolvimento de coloração avermelhada que indica a formação de indol.

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11 Meio IAL (Pessoa e Silva) Identificação presuntiva

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13 LÖWENSTEIN JENSEN A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis). INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: verde claro Positivo: Crescimento de colônias amarelas Negativo: ausência de crescimento.

14 TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura (colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material). Finalidades do isolamento: Identificação de um microrganismo. A simples observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos microrganismos. Para isto, lançamos mão da análise de uma série de características destes, como: características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar. Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer. Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro.

15 TÉCNICAS DE SEMEADURA Métodos de Isolamento e Identificação A identificação da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrição de suas características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e antigênicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado faz parte de uma população mista, é indispensável o seu isolamento, no sentido de obtenção de cultura pura.

16 1. Semeadura em Meio Sólidos Métodos de Inoculação 1.1. Semeadura em Tubos de Ensaio (em meios inclinados) Esgotamento de alça Técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano e/ou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo (pode também ser chamada de estriamento). Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica do esgotamento (Ex. meio de cultura: TSI)

17 Métodos de Inoculação A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Esta técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como poderemos utilizá-la para observar funções metabólicas de algumas bactérias. + - Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons)

18 Métodos de Inoculação Em Picada: Esta técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos (bactérias) que são submetidas a análise microbiológica. Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a técnica em picada. No tubo à esquerda, observamos o momento da picada que é realizada com o auxílio de uma agulha de semeadura e à direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de cultura: SIM).

19 Métodos de Inoculação 1.2. Semeadura em Placas de Petri (em superfície): O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada.

20 Métodos de Inoculação Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a técnica de estrias múltiplas, onde a alça deverá ser deslizada sobre a região onde há um inóculo bacteriano e logo depois deve ser passada na superfície da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG, visando o isolamento bacteriano.

21 Métodos de Inoculação Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou colônias isoladas (após diluição) utiliza-se o método de espalhamento em placa. Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nesta técnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a placa. Alça de drigalski

22 Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos): O inóculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluição da cultura em meio sólido é feito da seguinte maneira: Retiramos o inóculo do tubo com a alça já flambada e fria. Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa. Colocamos o inóculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir através de estriamento (que poderá ser contínuo ou descontínuo). O estriamento poderá se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a alça duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na alça. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactérias, o que dificultará o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, após termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a alça, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a alça na última estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levandoa a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo. Flambar a alça utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.

23 Técnica para semeadura em meios líquidos: Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador). Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A ROLHA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO. Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria. Flambar novamente a boca do tubo e fechar. Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.

24 Técnica para semeadura em meios semi-sólidos Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquido com o auxílio de uma alça em agulha já flambada e fria. Abrir o tubo que contém o meio semi-sólido e semear o microrganismo através de picada até mais ou menos 1/3 ou ½ do tubo. Fechar o tubo, identificar e levar para incubação. Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.

25 Coloração de GRAM Alça Fixação do esfregaço pelo calor Passar a lamina c/ esfregaço por 3x sob a chama. Bactérias isolada Esfregaço Técnica de GRAM 1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min. 2. Escorrer excesso do corante e lavar. 3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min. 4. Escorrer excesso do corante e lavar. Proceder a coloração de GRAM 5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s. 6. Escorrer excesso do corante e lavar. 7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s. 8. Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar. Fucsina

26 Coloração de Ziehl-Neelsen Colônias de Micobactérias Usar capela de fluxo laminar. Passar a lamina c/ esfregaço por 3x sob a chama. Meio de cultura para Micobactérias Resultado Esfregaço Fixação do esfregaço pelo calor a) Cobrir os esfregaço com fucsina de Ziehl. Aquecer até a emissão de vapores (Não deixar o corante secar). Esperar 5 minutos; b) Lavar com água corrente; c) Descorar com álcool (97%), ácido clorídrico (1%); d) Lavar em água corrente; e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; f) Lavar e secar; g) Observar ao microscópio as lâminas coradas; h) Como se apresentam os BAAR. Proceder a coloração de Ziehl-Neelsen

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