Fabiana G. S. Pinto SEQÜENCIAMENTO. ENCIAMENTO GENÔMICO Técnicas e Aplicações

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1 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO GENÔMICO Técnicas e Aplicações

2 Ácidos Nucléicos Fabiana G. S. Pinto * 2 tipos de ácidos nucléicos: DNA -Ácido desoxirribonucléico RNA- Ácido ribonucléico * Constituição dos Nucleotideos: Base nitrogenada - Pentose - Grupo fosfato * * Bases Nitrogenadas: * Púricas: Adenina (A) ; Guanina (G) e Pirimídicas: Timina (T), Citosina (C) Uracil (U) DNA: A, G, C, e T e RNA: A, G, C, e U DNA X RNA

3 Organização do DNA nos organismos vivos? * Seqüências não codificadoras e Seqüências codificadoras (proteinas, rrna, trna) GENES Organização do Genoma nos organismos vivos? Repertório total de genes do organismo vivo GENOMA

4 Conceitos Básicos Fabiana G. S. Pinto GENOMA: todo DNA existente num organismo GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional (proteínas ou RNAs) GENÔMICA: - Elucidar o genoma de um organismo e o papel dos genes que o compõem desde o ponto de vista estrutural e funcional 1- GENÔMICA ESTRUTURAL: - Identificar, isolar, localizar e caracterizar o conjunto de genes de um organismo. (GENOMA) 2- GENÔMICA FUNCIONAL: -Descrever a função biológica dos genes mediante o conhecimento de como eles interacionam, para definir um fenótipo determindo 2.1- GENÔMICA COMPARATIVA - Comparação e estudos da evolução dos genomas

5 OS NÍVEIS N DA PESQUISA GENÔMICA Fabiana G. S. Pinto Mapeamento de genes Genômica Estrutural Seqüênciamento de DNA Anotação das seqüências Genômica Funcional Expressão Transcriptoma Proteoma Análise de mutantes Genômica Comparativa

6 Metabólitos METABOLOMA Proteínas mrna PROTEOMA TRANSCRIPTOMA GENÔMICA FUNCIONAL mrna Pré-mRNA DNA GENÔMICA ESTRUTURAL

7 Análise do fluxo da informação celular pela pesquisa genômica Fabiana G. S. Pinto Mapeamento Seqüênciamento Anotação Genômica Estrutural DNA (Genoma) núcleo Microarranjos de DNA Hibridização citoplasma Regulação Pré-mRNA mrna mrna (Transcriptoma) Proteína (Proteoma) Metabólitos (Metaboloma) Eletroforese em Gel 2D Espectrometria de massa Seqüênciamento de proteínas Cromatografia Espectrometria Genômica Funcional

8 Histórico da Genética e a Corrida pelo Projeto Genoma 1866 Gregor Mendel estabelece as leis da hereditariedade 1903 Walter Sutton - Cromossomos são unidades hereditárias 1913 Thomas Morgan - Cromossomos arranjos lineares de gene 1944 Avery, McCarty, McLeaod, Griffith s - O DNA é o material genético. Harshey, Chase (1950) 1945 Beadle, Tatum - Um gene codifica uma proteína 1953 Franklin, Wilkins, Watson, Crick - O DNA é uma dupla hélice 1958 Meselson, Stahl - O DNA replica semicoservativamente

9 1961 Marshall Nirenberg - O código genético é formado por um códon de três bases RNA mensageiro 1972 Paul Berg produz a 1ª molécula de DNA recombinante, um grande passo para experimentos entre organismos diferentes, 1978 GENENTECH, americana, produz insulina humana recombinante 1983 Kary Mullis cria a técnica do PCR 1988 Início Projeto Genoma Humano Estatal-PGH (NIH-USA) 1995 Haemophilus influenzae 1º genoma completo sequenciado - TIGR 1998 Craig Venter CELERA GENOMICS- sequenciar genoma humano 2003 Grupo PGH finalização sequenciamento: 3,2 bilhões pb U$ 4 bilhões

10 GENOMAS NO MUNDO Fabiana G. S. Pinto

11 GENOMAS NO BRASIL Fabiana G. S. Pinto 1997: ONSA criada pela FAPESP Rede 30 laboratórios 2000: Publicado 1º genoma patógeno vegetal: Xylela fastidiosa (CVC) U$12 milhões

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13 2000: REDE PROJETO GENOMA BRASILEIRO BRGENE - 25 centros em todo o país - CNPq e MCT 2001 : Chromobacterium violaceum - R$26 milhões

14 GENOMAS REGIONAIS BRASILEIROS Fabiana G. S. Pinto Área de Agricultura Crinipellis perniciosa Rhizobium tropici Gluconacetobacter diazotrophicus Herbaspirillum seropedicae

15 Seqüênciamento de Genomas Complexidade de Genomas Tamanho Seqüências Codificantes (%) Número de genes Escherichia coli 4,6 Mb Chromoacterium violaceum Saccharomyces cereviciae Caenorhabditis elegans Drosophila melanogster 4,7 Mb 12 Mb 98 Mb 180 Mb Arabidopsis thaliana 125 Mb Genoma Humano 3200 Mb

16 Seqüênciamento de DNA Definição : - Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA Importância: * No caso do Projeto Genoma Homem, foi determinada a ordem exata dos 3 bilhões de pares de bases que constituem o DNA dos 24 cromossomos - O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes)

17 Etapas para Seqüênciamento Genômico Fabiana G. S. Pinto * Isolamento DNA organismo Biblioteca Genômica * Fragmentar DNA: métodos químicos ou físicos * Separação DNA tamanho de interesse (gel) e Reparo do DNA * Clonagem: fragmento DNA interesse + Vetor (plasmídeo) - Transformação: Escherichia coli * Seleção dos transformantes em meio seletivo e crescimento colônias * Extração de plasmídeo+inserto : PCR seqüênciamento com marcação fluorocromos * Injeção amostras no Sequenciador Automático: Leituras fragmentos (READS) * Obtenção grande nº seqüências: BIOINFORMÁTICA * Processamento e Montagem das seqüências e Anotação do Genoma

18 ESTRATÉGIAS DE SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO DE GENOMAS Fabiana G. S. Pinto Construção de mapas de clones (BAC) e seleção dos clones mapeados Geração de milhões de fragmentos a serem seqüenciados Geração de centenas de fragmentos a serem seqüenciados Montagem Montagem shotgun Hierárquico shotgun genoma inteiro

19 Seqüênciamento shotgun do genoma inteiro Fabiana G. S. Pinto DNA Genômico Clones Shotgun (Plasmideos ou Cosmídeos) Seqüência Shotgun Montagem Clones para conectar Montagem final Gap Virtual Gap real Desenho de primer PCR

20 Seqüênciamento shotgun Hierárquico Fabiana G. S. Pinto DNA Genômico Biblioteca BAC Contigs dos clones organizados e mapeados Seqüênciamento dos BAC Clones Shotgun Seqüência Shotgun Montagem Montagem final Clones para conectar

21 Seqüênciamento shotgun do genoma inteiro Cobertura rápida do genoma Dificuldades para finalizar e fechar o genoma Seqüênciamento shotgun hierárquico Construção de clones de fragmentos maiores e mapas genéticos e físicos permite verificação da montagem das seqüências. Ambos casos, o número de seqüências geradas deverá ter uma cobertura de > 8 vezes o tamanho do genoma total

22 Seqüênciamento shotgun Hierárquico Mapa genético marcadores morfológicos clássicos, bioquímicos, genéticos, moleculares. Mapa físico clonagem de grandes regiões genômicas: 1000 Kb YACs: Cromossomo Artificial Levedura Kb BACs: Cromossomos Artificial Bacterias PACs: Cromossomo Artificial Fago 45 Kb Cosmídios: Híbridos fagos e plasmidios Seqüênciamento plasmídios ou fagos 4 kb

23 Seqüênciamento final dos clones para ambas estratégias Eletroferograma

24 Clonagem de DNA em vetores para seqüênciamento * Clonagem de fragmentos randômicos de DNA de um genoma completo. * Clonagem de DNA de um gene de interesse. * Diversos tipos de Vetores PCU18/19 para insertos 4 kb Inserto DNA no plasmídio vetor * Diversos tipos de Vetores PCU18/19 para insertos 4 kb

25 Inserto de DNA e Vetor cortados com a mesma endonuclease de restrição EcoRI

26 Seleção de clones recombinantes, contendo inserto DNA Inserto de fragementos DNA que queremos sequenciar interrompe a expressão do gene LacZ. Portanto, o fenótipo resultante de uma célula de E. coli transformada com um plasmideo recombinate com DNA exógeno é uma enzima β Galactosidase inativa β X-Gal = Substrato cromogênico. β Galactosidase funcional usa X-Gal colônias azuis β Galactosidase inativa colônias brancas

27 Construção de Bibliotecas Genômicas para seqüênciamento 1- Fragmentos randômicos de DNA DNA genômico total: 500 ug. DNA fragmentado: Método físico, Nebulização. Sonicação. Enzimático, Sau3AI, DNaseI.

28 2- Reparo das pontas dos fragmentos DNA GGTA CTTTACG*** * CATGAAATGCAAT SmaI 1 único sítio de clonagem no polylinker Blunt * GTACTTTACG ** TGAAATGC GTACTTTACG CATGAAATGCAAT Fragmento klenow da DNA Polimerase I GTACTTTACG blunt CATGAAATGC DNA Polimerase I Fago T4

29 2- Reparo das pontas dos fragmentos: fosforilação 5 pgtactttacg blunt CATGAAATGCp 5 5 monofosfato Polinucleotídeo quinase do fago T4 PNK Função do vetor usado para clonagem: - Kit utilizam sistema TOPO topoisomerase II ( desfosforilar os fragmentos em função do vetor fosforilado) -Vetor puc 18(inverso do Kit TOPO)

30 3-Seleção dos fragmentos de DNA do tamanho desejado KB 3 KB Low Melting Agarose Cortar fragmentos entre 1 3 Kb 1 KB

31 4-Ligação dos fragmentos no vetor puc18 e transformação Seleção Ampicilina e colônias brancas

32 Seleção de clones: Ampicilina (250 μg/ml) e colônias brancas Colônias azuis sem inserto Colônias brancas contém inserto serão picadas para placas

33 Crescimento de clones para extração do DNA plasmidial: mini-prep. Placas deep well para crescimento dos clones de E. coli. Meio LB Ampicilina. 12 a 16 h. 37 C. 150 rpm. Mini-prep Lise alcalina Placa de fundo U Placa Millipore filtro para purificar DNA plasmidial na ultima etapa da mini-prep

34 Crescimento de clones para extração do DNA plasmidial: mini-prep. Ressuspensão. Tampão Tris-HCl. EDTA. Glicose. RNAse. Lise NaOH/SDS. Solubilizar componentes de membranas celulares e lise celular.dna cromossomal e plasmidial e proteinas desnaturados. RNA degradado. Neutralização. Acetato de potássio. Precipitação proteína, restos celulares e DNA cromossomal em complexo saldetergente insolúvel. DNA plasmidial re-natura corretamente em sobrenadante. Purificação DNA plasmidial. Centrifugação. Filtração (millipore). Sobrenadante DNA plasmidial precipita Isopropanol/Etanol.

35 Eletroforese em gel de agarose Gel de Mini-prep em placa de 96 poços

36 Seqüênciamento de DNA Fabiana G. S. Pinto

37 Seqüênciamento de DNA Duas técnicas de seqüênciamento. MAXAM-GILBERT Método Químico. FREDERICK SANGER Método Enzimático. Gilbert Fred Sanger

38 MAXAM-GILBERT: alteração química das bases Walter Gilbert

39 Método de Maxam-Gilbert Fabiana G. S. Pinto Preparações de DNA. Marcação com fosforo radiativo ( 32 P) no extremo 5. Alteração química das bases. Remoção e clivagem. Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de poliacrilamida.

40 Método Didesóxi/ Enzimático ou Terminadores de Cadeia Frederick Sanger

41 Seqüênciamento de DNA Método de Sanger 4 dntps desoxinucleotídeos trifosfatos 4 ddntps di-desoxinucleotídeos trifosfatos ddntps Terminadores marcados ddg, dda, ddt, ddc ( fluorescência)

42 Método de Sanger Fabiana G. S. Pinto Química de terminação da cadeia com di-desoxinucleotídeos. ddntp.

43 Seqüênciamento de DNA Manual : Método de Sanger 3 5 A T T T A A C C G C T T T A T C C DNA molde 5 T A A A T T G G C G A A A 3 3 A T T T A A C C G C T T T A T C C 5 5 T A A A T T G G C 3 3 A T T T A A C C G C T T T A T C C T A A A T 3 A T T T A A C C G C T T T A T C C 5 5 T A A A T T G G C G 3 Video: Sequenciamento Manual

44 Seqüênciamento de DNA Auto-radiografia de Gel de seqüênciamento clássico para ambos métodos Maxam- Gilbert e Sanger. Gel desnaturante. Formamida ou Uréia. ddntps marcados com 32 P

45 Seqüênciamento de DNA Automatizado Seqüênciamento automatizado ABI 377 ABI 377 Sistema de eletroforese gel de poliacrilamida. Capacidade para 48 leituras em 5 a 6 horas. Seqüências de boa qualidade > 400 pb.

46 Seqüênciamento de DNA Automatizado Seqüênciamento automatizado MegaBace 1000 MegaBace Sistema de eletroforese capilar. Capacidade para 96 leituras em 1 a 3 horas. Seqüências de boa qualidade > 400 pb. Vídeo Sequenciamento Automático

47 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Fabiana G. S. Pinto Seqüênciamento de insertos em vetores (plasmídeos ou cosmídeos) Kit de seqüênciamento: DyeET Mix. Mistura contendo enzima de seqüênciamento, Thermo Sequenase (DNA Polimerase com alta processividade e afinidade para dntp). ddntp, Dye terminators com duas marcas de fluorescência. Reação Seqüênciamento: Primer: Universal ou Reverso para plasmídeos ou cosmídeos. * DNA: ng plasmídeo (+/-4 kb) > 800ng cosmídeo (+/-40 kb) * Dye ET Mix Placa de 96 well Termociclador: Ciclos de PCR

48 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Após Reação de seqüênciamento: * Precipitação dos produtos de PCR. Eliminar os dntp, ddntp não incorporados, enzimas Preparação para injeção das amostras Matriz Poliacrilamida Placa com Tampão Placa com amostras * Ajustar parâmetros de injeção. * Eletro-injeção. Voltagem (Kv) e tempo de injeção (s).

49 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Compartimentos internos de cátodo e anodo cátodo anodo

50 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Interior da câmara contendo 6 conjunto de 16 Capilares c/u (96)

51 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Fabiana G. S. Pinto Sistema de detecção e identificação de terminators ddntp Cada um dos quatros dideoxy terminators ddg, dda, ddc, ddt estão marcados com dois tipos de dye fluoresceína e rodomina. A fluoresceína alto coeficiente de extinção (488nm) no laser de argon. Atua como um dye doador absorve a energia da luz do laser incidente e a transfere para o dye aceptor (rodomina) A rodomina emite a luz em um comprimento de onda característico para a identificação dos 4 nucleotídeos que terminam a fita de DNA.

52 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Detecção de fluorescência no sequenciador automático Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000

53 Seqüênciamento em MegaBace 1000 Fabiana G. S. Pinto Eletroferograma e seqüência em nucleotídeos A = verde G= preto C= azul T= vermelho Tamanho da seqüência= bp

54 Eletroferograma completo Fabiana G. S. Pinto

55 Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000 Fabiana G. S. Pinto Score Card Vídeo Sequenciamento Automático 2

56 Obtenção de Seqüências geradas pelo MegaBace 1000 Dados brutos (medidas analógicas) de saída do seqüênciamento Base calling BIOINFORMÁTICA * PHRED: - Transforma os dados brutos em seqüências de bases, atribuí valores de qualidade a cada base na seqüência e gera arquivos de saída FASTA e PHD * PHRAP: - Leitura Montagem dos pequenos fragmentos de DNA seqüenciados em seqüências maiores: CONTIG * CONSED: - Visualização e edição das montagens das seqüências de alta qualidade

57 Valores de qualidade gerados pelo PHRED Quando arquivos de seqüências de DNA são analisados pelo phred a cada base é assinada um valor de qualidade, o qual é uma estimativa da probabilidade de erro para essa base. Bases com um valor de qualidade de 20 são consideradas com um alto valor de qualidade. q = -10 log 10 (pe) onde pe= erro estimado q20 = 1/100 probabilidade de erro q30= 1/1000 probabilidade de erro q40= 1/10000 probabilidade de erro

58 Regiões genômicas que podem ser melhoradas re-seqüênciamento.

59 Análise e Montagem das Seqüências Fabiana G. S. Pinto Seqüências shotgun analisadas Phred, Phrap e Consed Resultado Seqüências ordenadas com consenso formam um CONTIG

60 Evolução do seqüênciamento shotgun Fabiana G. S. Pinto Projeto genoma depositar as seqüências para a central de Bioinformática Evolução dos contigs com a submissão das seqüências shotgun. Finalização 40% a 50% do tempo total do projeto

61 MUITO OBRIGADA!!!!!!! Animações PCR