Sequenciamento de genomas: princípios e métodos clássicos

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1 Sequenciamento de genomas: princípios e métodos clássicos Cesar Martins (cmartins@ibb.unesp.br) Departamento de Morfologia Instituto de Biociências, UNESP Universidade Estadual Paulista Botucatu, SP Sequenciamento de DNA e de genomas: Determinar a sequência de nucleotídeos ao longo da cadeia de DNA...AGCAATTGTGAGTCCCTGACTTTTTGCTTA 1

2 Aplicações Estudo de genes Diagnóstico forense e clínico Identificação de indivíduos Estudos comparativos Evolução, Fisiologia, Ecologia,... Conhecimento do genoma Genomas sequenciados Primeiro genoma sequenciado: Fago X174, pb (9 genes) Sanger et al. 1977, Nature 265: Primeiro eucarionte sequenciado: Saccharomyces cerevisae, 13 milhões pb Goffeau et al. 1996, Science 274: 546, Primeiro animal sequenciado: Caenorhabditis elegans, 100 milhões pb C elegans Sequencing Consortium 1998, Science 282: Primeira planta sequenciada: Arabidopsis thaliana, 157 milhões pb Arabidopsis Genome Initiative 2000, Nature 408: Genoma humano: 3 bilhões pb International Human Genome Sequencing Consortium 2001, Nature: 409: ; Venter et al. 2001, Science 291:

3 Genomas sequenciados 1000 genomes available Source: NCBI, May 07/2013 Princípios e Métodos Clássicos Método químico Maxam & Gilbert 1977 Método dideoxi ou de terminalização Sanger et al

4 Método químico Método químico Walter Gilbert Prêmio Nobel em Bioquímica (1980) 4

5 Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico fosfato Base Nucleotídeo açúcar Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico 5

6 Clivagem preferencial do DNA em nucleotídeos específicos Clivagem preferencial do DNA em nucleotídeos específicos Dimetilfulfato Piperidina 6

7 Marcar os finais da dupla fita de DNA com 32 P Desnaturar o DNA para separar as fitas 7

8 Método químico Método químico 8

9 Método químico Método químico 9

10 eletroforese Método químico A>G G>A C C+T Método químico 10

11 Método químico Método dideoxi ou de terminalização 11

12 Método dideoxi ou de terminalização *Método dideoxi de sequenciamento *Sequenciamento Shotgun Frederick Sanger Dois prêmios Nobel em Bioquímica Sanger Institute, Cambridge, England Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico fosfato base açúcar Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Nucleotídeo 12

13 Duplicação do DNA Fita contínua Fita descontínua Primers Duplicação do DNA DNA polimerase requer adicionar próximo nucleotídeo 13

14 Método dideoxi ou de terminalização Nucleotídeo normal Deoxinucleotídeo Nucleotídeo sem grupo OH no carbono 3 do açucar Dideoxinucleotídeo Método dideoxi ou de terminalização T G C A Deoxinucleotídeos normais T G C A Dideoxinucleotídeos (nucleotídeos alterados) 14

15 Método dideoxi ou de terminalização Seqüenciamento manual ** IMPORTANTE!! primer ou um dos nucleotídeos marcados radioativamente! Método dideoxi ou de terminalização Seqüenciamento manual 15

16 Método dideoxi ou de terminalização Seqüenciamento manual by C Martins (1999) Gilbert X Sanger Gilbert Requer grande quantidade de DNA purificado e muitos passos de purificação; Digestões enzimáticas; Produz curtas leituras; Encontrou aplicação em footprinting Não requer clonagem; Automatização não disponível. Sanger Requer clonagem do fragmento de interesse; Requer muito pouco DNA; Não necessita de digestões; Desenvolvimento de automação. 16

17 Método dideoxi ou de terminalização Desenvolvimento de sequenciamento automatizado 1986: Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology announce the first semi-automated DNA sequencing machine. 1987: Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI 370. Seqüenciamento automático versão I A AGCTTA AGCTTACGA AGCTTACGAA AGCTTACGAATGCGTCCA AGCTTACGAATGCGTCCACA AGCTTACGAATGCGTCCACAA AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTA AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACA AG AGCTTACG AGCTTACGAATG AGCTTACGAATGCG AGCTTACGAATGCGTCCACAACG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGTG AGC AGCTTAC AGCTTACGAATGC AGCTTACGAATGCGTC AGCTTACGAATGCGTCC AGCTTACGAATGCGTCCAC AGCTTACGAATGCGTCCACAAC AGCTTACGAATGCGTCCACAACGC AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTAC AGCT AGCTT AGCTTACGAAT AGCTTACGAATGCGT AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCT AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGT A G C T T G C A A G C T T G C A 17

18 Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis 18/ 03/ 12 08:17 nature.com about npg naturejobs natureevents help site index SEARCH JOURNAL Journal Home Current Issue AOP Archive Sequenciamento automático my account e-alerts subscribe register Go Sunday 18 March 2012 Nature 321, (12 June 1986); doi: /321674a0 THIS ARTICLE Download PDF References Export citation Export references Send to a friend More articles like this Table of Contents < Previous Next > Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis LLOYD M. SMITH, JANE Z. SANDERS, ROBERT J. KAISER, PETER HUGHES, CHRIS DODD, CHARLES R. CONNELL *, CHERYL HEINER *, STEPHEN B. H. KENT & LEROY E. HOOD Division of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125, USA * Applied Biosystems, Inc., Foster City, California 94404, USA We have developed a method for the partial automation of DNA sequence analysis. Fluorescence detection of the DNA fragments is accomplished by means of a fluorophore covalently attached to the oligonucleotide primer used in enzymatic DNA sequence analysis. A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific for the bases A, C, G and T. The reaction mixtures are combined and co-electrophoresed down a single polyacrylamide gel tube, the separated fluorescent bands of DNA are detected near the bottom of the tube, and the sequence information is acquired directly by computer. References Leroy Hood 1. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 74, (1977). ChemPort 2. Smith, A. J. H. Meth. Enzym. 65, (1980). Article PubMed ChemPort 3. Maxam, A. M. & Gilbert, W. Meth. Enzym. 65, (1980). Article PubMed ChemPort 4. Smith, L. M., Fung, S., Hunkapiller, M. W., Hunkapiller, T. J. & Hood, L. E. Nucleic Acids Res. 13, (1985). PubMed ISI ChemPort 5. Smith, L. M., Kaiser, R. J., Sanders, J. Z. & Hood, L. E. Meth. Enzym. (in the press). 6. Atkinson, T. & Smith, M. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (ed. Gait, M. J.) (IRL, Oxford, 1984). 7. Forster, A. C., McInnes, J. L., Skingle, D. C. & Symons, R. H. Nucleic Acids Res. 13, (1985). PubMed ISI ChemPort 8. Chuvpilo, S. A. & Kravchenko, V. V. Sov. J. bioorg. Chem. 9, (1983). 9. Rosenthal, A., Schwertner, S., Hahn, V. & Hunger, H. Nucleic Acids Res. 13, (1985). PubMed ISI ChemPort 1986 Nature Publishing Group Privacy Policy Seqüenciamento automático versão II DNA Primer Nucleotídeos normais (A, C, G, T) Dideoxinucleotídeo DNA polimerase tampão A C G T T G C A / nature/ journal/ v321/ n6071/ abs/ a0.html gina 1 de 1 A C G T : dideoxi nucleotídeos marcados com compostos fluorescentes 18

19 Seqüenciamento automático versão II Seqüenciamento automático versão II 19

20 Seqüenciamento automático versão II Seqüenciamento automático versão II Cromatograma 20

21 Seqüenciamento automático versão II Seqüenciamento automático versão III (capilar) 21

22 Seqüenciamento automático versão III (capilar) Seqüenciamento automático versão III (capilar) 22

23 Seqüenciamento automático versão III (capilar) Seq capilar por Sanger 23

24 Seqüenciamento automático Plasmidio AMOSTRAS PARA SEQUENCIAMENTO PCR Seqüenciamento automático Plasmidio AMOSTRAS PARA SEQUENCIAMENTO 24

25 Hierarchical shotgun sequencing Sequenciamento de genomas inteiros Sequenciamento total de genomas Whole genome shotgun sequencing 25

26 Desvendando a complexidade dos genomas Mapa físico da seqüência nucleotídica HGP Celera Sequenciamento clássico por -Vantagens -Limitações 26

27 Curso de Férias de Julho de 2013 Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP 27