Diagnóstico Molecular em Transplantação. Paulo Santos Laboratório de Genómica Funcional Centro de Histocompatibilidade do Centro

Transcrição

1 Diagnóstico Molecular em Transplantação Paulo Santos Laboratório de Genómica Funcional Centro de Histocompatibilidade do Centro

2 Histocompatibilidade Serologia Genética Molecular Virologia Bioquímica Genómica Funcional Imunidade celular Genética de populações Hematologia Biologia celular Criobiologia

3 Polimorfismo HLA

4 Chemokine gene expression and acute rejection in kidney transplantation relative gene expression IL-8 IP-1 MCP1 MIP1beta RANTES D D LPS D7 D7 LPS D1 D19 Biopsy D21 D28

5 IL IL IL IL1B IL1B IL1B IL1A IL1A IL1A IL1 IL1 IL1 TNFB TNFB TNFB IFNg IFNG IFNG IL4 IL4 L4 TNFA TNFA TNFA IL2 IL2 IL2 TGFB TGFB TGFB Expressão génica em transplantação hepática Infecção Rejeição Controlo Infecção Rejeição Controlo Grupo com infecção Grupo com rejeição Grupo sem complicações Grupo com infecção Grupo com rejeição Grupo sem complicações 3 3, 3, IL TGF-b 2 1 2, 1, 2, 1, Grupo com infecção Grupo com rejeição Intervalo Grupo diasem complicações 2, Grupo com infecção 1, Grupo com rejeição 1, Grupo sem complicações 1, IL Grupo com infecção Grupo com rejeição 4 1, 1,,, Grupo sem complicações TNF-a , 12, 1, 8,, 4, 2,, , 3, Grupo com infecção 12 Grupo com rejeição 12, Grupo sem complicações 12, IFN-g Grupo com infecção Grupo com rejeição 7 2, 1,, Grupo sem complicações 7 TNF-b , 8,, 4, 2,, , 8,, 4, 2,, Grupo com infecção 4 Grupo com rejeição 4 Grupo sem complicações IL IL-1a Grupo com infecção 2 Grupo com rejeição 2 Grupo sem complicações 14 Grupo com infecção 14 Grupo com rejeição 14, Grupo sem complicações , IL-1b IL , 8,, 4, 2,, S Balseiro, S Vale-Pereira et al 2

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7 Quality of RNA It must be of the highest quality if quantitative results are to be relevant. It should be free of DNA, especially if the target is an intronless gene. There must be no copurification of inhibitors of the RT-step. It must be free of nucleases for extended storage.

8 Preservation solutions PaxGene RNA tubes (blood samples) RNAlater (tissue and culture cells)

9 Integridade do RNA

10 Electroforese Capilar: Lab on Chip Bioanalyser 21 Experion Caliper Life Sciences

11 RIN: RNA Integrity Number

12 RIN: RNA Integrity Number

13 Importance of assaying high-quality RNA (Bustin SA and Nolan T. J Biomol Techniques 24; 1:1-1) T Nolan & S. Bustin

14 RNA: conservação de amostras

15 TNF-ALPHA IFNg IL-12p3 IL-12p4 IL-1 IL-1 IL-8 IL- IL-1 ALPHA IL-1 BETA IL-4 IL-2 Quantitation Relative to Calibrator Sample Perfil de expressão génica Relative Quantitation Cytokine Gene Expression Plate Results ,1,1,1,1 Cytokine Gene Expression Target D calibrator F H Sample

16 1 fold difference between A and B if normalized by only one gene (ACTB or HMBS) Jo Vandesompele

17 Real-time PCR cycle threshold values in blood samples Blood samples PBMC Culture cells Dheda et al. BioTechniques 24

18 Impact of reference genes in final results GAPDH HuPO Dheda et al. BioTechniques 24

19 Real-time PCR efficiency

20 Factores críticos do RT-PCR em tempo real Extracção de RNA Transcrição reversa Métodos de detecção Aparelhos de PCR em tempo real Estratégias de quantificação Quantificação absoluta vs relativa Eficiência da amplificação Avaliação de dados Normalização Tratamento estatístico

21 Variabilidade em expressão génica

22 mrna levels of perforin, granzyme B, and fas-ligand in kidney tissue, peripheral blood leukocytes, and urinary cells according to the histological diagnosis Legend: AR, acute rejection; ATN, acute tubular necrosis; CIN, calcineurin inhibitor-induced nephrotoxicity; CAN, chronic graft nephropathy; NOR, normal. EC Equino-Dias et al. Kidney Int. 28;73(7):

23 mrna levels of PI-9 and FOXP3 in kidney tissue, peripheral blood leukocytes, and urinary cells according to the histological diagnosis EC Equino-Dias et al. Kidney Int. 28;73(7):

24 Spearman's Correlation Coefficients of Gene Quantifications at the Different Compartments EC Equino-Dias et al. Kidney Int. 28;73(7):

25 Molecular Quantifications to the AR Diagnosis in Peripheral Blood of Patients with DGF EC Equino-Dias et al. Kidney Int. 28;73(7):

26 Molecular Quantifications for the AR Diagnosis in Urinary Cells of Patients with Early Graft Function EC Equino-Dias et al. Kidney Int. 28;73(7):

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28 Fluxo analítico AlloMap

29 AlloMAp: Boletim de resultados

30 Microscopia de Microdissecção Laser Biópsia de transplante hepático

31 Apoptosis in experimental hydronephrosis (Almeida et al: 27) Fas Male obstructed Fasl Male obstructed Male contralateral Tgfb Male obstructed Male contralateral Male contralateral 2, 2, 2, 1, 1, 1,,,, -1, -1, -1, -2, -2, -2, 2, 2, 2, 1, 1, 1,,,, -1, -1, -1, -2, -2, -2, LD4 LD8 LD21 LD4 LD8 LD21 Female obstructed Female contralateral LD4 LD8 LD21 LD4 LD8 LD21 LD4 LD8 LD21 LD4 LD8 LD21 Female obstructedfemale contralateral Female obstructedfemale contralateral

32 Lindsay 28

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34 Terapia baseada em microrna

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36 Amostras em parafina

37 Comparar o comparável

38 Mahajan 28

39 Mahajan 28

40 Lindsay 28

41 Lindsay 28

42 MicroRNA em Transplantação

43 2 mirna com expressão diferente na rejeição aguda em TRX renal

44 Validação por qrt-pcr

45 mirna e função em Transplantação Renal

46 mirna e função em Transplantação Renal Anglicheau et al. PNAS 29 1:33-33.

47 mirna e função em Transplantação Renal Anglicheau et al. PNAS 29 1:33-33.

48 mirna e função em Transplantação Renal Anglicheau et al. PNAS 29 1:33-33.

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