Desenvolvimento de marcadores moleculares relacionados a resistência celular após terapia fotodinâmica em carcinomas mamários
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- Baltazar Frade Estrada
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1 Desenvolvimento de marcadores moleculares relacionados a resistência celular após terapia fotodinâmica em carcinomas mamários Joze Barbosa Galioti Orientadora: Profª Drª Renata A. Canevari
2 Introdução O câncer de mama é uma doença extremamente complexa e clinicamente heterogênea, caracterizado por prognósticos muito diferentes entre as pacientes
3 O principal problema clínico dessa doença é a recorrência/recidiva observada após a terapia (quimioterapia e radioterapia)
4 A resistência celular após as diferentes terapias utilizadas é um fator crítico no tratamento do câncer de mama Vários estudos atribuíram que a resistência celular encontrada nas células neoplásicas surge devido a alterações genéticas específicas (PUSZTAI, et al., 2006, DOBBE, et al., 2008, SUN, et al., 2009)
5 Recidivas da mama tendem a ocorrer em aproximadamente 5% a 10% das pacientes, num intervalo de cinco anos, nos casos em que foram realizadas cirurgias conservadoras em qualquer quadrante da mama, com ou sem tratamento adjuvante (BIRDWELL, 2003)
6 Uma vez retirado o tumor, cirurgicamente, a recidiva da doença pode ocorrer através de possível micro metástases ocultas. Portanto, a finalidade do tratamento por meio da quimioterapia adjuvante é erradicar as micro-metástases, diminuindo a chance de recidiva e aumentando a sobrevida (JAO, GARCIA, 2006)
7 A quimioterapia ou terapia hormonal reduzem somente em um terço o risco de recidiva ou metástases Atualmente... muitas pacientes ainda sofrem recidiva e a predição de quais pacientes irão sofrer recidiva tumoral é ineficaz (Sun et al., 2007)
8 Terapia Fotodinâmica (TFD) Uma nova opção de tratamento Paciente apresenta um determinado tumor É administrado um fotossensibilizador por via endovenosa Depois de +/- 24 hrs o fotossensibilizador se concentra no tumor O fotossensibilizador é ativado pela luz O tumor é seletivamente destruído (morte celular) (Bagnato, 2002)
9 Alterações genéticas, resistência celular e terapia fotodinâmica Vários estudos foram realizados tentando esclarecer os mecanismos celulares e genéticos envolvidos através das características citotóxicas induzidas pela TFD. Belickova, M., et al., 2000, Verwanger, T., et al., 2002, Crescenzi, E., et al., 2004, Crescenzi, E., et al., 2009, Wang, H.P., et al.,2002. Contudo há poucos relatos in vivo tanto em tumores humanos quanto utilizando um modelo animal.
10 Alterações genéticas, resistência celular e terapia fotodinâmica Em um estudo com tumores de mama (adenocarcinoma) em cultura celular foi observado que após vários ciclos da TFD, ocorreu um aumento da resistência celular a terapia fotodinâmica acompanhado com um aumento do volume celular, aumento de fibroblasto, diferenças na adesão celular e na capacidade da célula de sofrer metástase (CASAS, 2006)
11 Portanto, pelo fato da TFD induzir altos níveis de citotoxidade, é esperado que ela também tenha um significativo impacto no padrão da expressão gênica. Atualmente, pouco é conhecido a respeito da atividade gênica global, particularmente quando stress oxidativo torna-se excessivo, como no caso da TFD.
12 Análise de Expressão Gênica Todas as células em um organismo têm o mesmo DNA genômico Identidades celulares distintas ocorrem por causa de diferenças na expressão gênica (= transcrição & tradução) A transcrição ou não de um gene é, em geral, determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (especialmente proteínas) WATSON, et al., 2007
13 Análise de Expressão Gênica
14 Célula sanguínea Célula nervosa Célula epitelial Gene A Gene B Gene C
15 Para que estudar a expressão gênica? As células e tecidos tem suas funções normais quando os genes são expressos de forma regulada. A expressão alterada de um gene altera a homeostase do organismo, podendo gerar diferentes tipos de cânceres.
16 Análise de Expressão Gênica Portanto vários estudos de análise de expressão gênica no câncer de mama estão sendo realizados com o objetivo de aumentar o entendimento da interação de genes e vias envolvidas em su a progressão. (Van t Veer, et al., 2002, Wang, et al., 2005, Liu, et al., 2008)
17 Análise de Expressão Gênica Até o presente, as vias metabólicas influenciadas pela TFD não foram totalmente elucidadas, algumas vias foram comprovadas estarem envolvidas. A apoptose celular foi o principal evento encontrado em todas os tecidos tumorais tratados pela TFD, sugerindo que a habilidade desta terapia em induzir rapidamente a morte celular por apoptose pode explicar em parte a rápida eliminação tumoral que ocorre após a terapia. Makowski, M., et al., 2003, Oleinick, N.L., H.H. Evans, 1998
18 Análise de Expressão Gênica A terapia fotodinâmica também sido demonstrada regular moléculas de adesão, e provavelmente desempenham um papel crucial na indução de uma resposta imune após a TFD. Runnels, J.M., et al., TFD mediada por stress oxidativo também pode agir como um estímulo angiogênico levando a neovasculariação e recorrência tumoral.
19 Objetivos Gerais Induzir, em modelo animal, tumores de mama afim de se estabelecer bases para diagnóstico e terapêutica; Pesquisar alterações na expressão de genes/proteínas críticas pertencentes a vias metabólicas específicas nos tecidos submetidos a TFD com intuito de descobrir marcadores relacionados com recidiva tumoral;
20 Objetivos Gerais Estudar os mecanismos celulares TFD pela associação das técnicas PCRquantitativo em tempo real, imunohistoquímica e análise morfológica do tecido.
21 Objetivos Específicos Analisar o padrão de expressão gênica após TFD em amostras de tumores mamários de ratas e compará-los com tecidos de mama normais e tumores mamários não submetidos a TFD; Determinar os efeitos da TFD no transcriptoma de vias metabólicas específicas selecionadas previamente para o estudo;
22 Objetivos Específicos Comparar a expressão relativa de genes e proteínas em amostras de tumores de ratas em que foi observada a redução do tumor e tumores em que não foi observado a redução tumoral;
23 Material e Métodos Serão utilizadas 50 ratas da linha Sprague- Dawley. A neoplasia mamária será induzida em 45 ratas com o 7,12- dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) onde posteriormente será realizado a Terapia Fotodinâmica.
24 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array Serão utilizados 50 amostras de mama de ratas sendo: - G1- animais com mama normal; - G2- animais com tumor de mama não tratado; - G3 E G4- animais submetidos a TFD (photogem e PDZ) morto após 48 horas; - G5 e G6- animais submetidos a TFD acompanhados até a eliminação ou recidiva.
25 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array A extração e purificação do RNA utilizando o protocolo estabelecido para Rneasy Mini Kit (Qiagen). A quantificação e a qualidade do RNA serão avaliadas utilizando-se o NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade) e eletroforese em gel de agarose.
26 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array A detecção de alterações quantitativas da expressão gênica (qrt PCR) será realizada no equipamento ABI Prism 7500 (Applied BioSystems, USA) e na plataforma Cancer Pathway Finder PCR Array (Super-Array, USA).
27 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array Esta plataforma possibilita a análise da expressão de 84 genes representativos de vias biológicas envolvidas na transformação e tumorigênese. Este array inclui genes representativos das seguintes vias biológicas: adesão celular, angiogênese, apoptose, controle do ciclo celular, senescência celular, reparo do DNA, invasão, metástase, moléculas de transdução de sinal e fatores de transcrição.
28 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array qrt PCR tumor Coleta do tumor Pulverização do tecido (adição de nitrogênio líquido) Extração do RNA total
29 Análise de Expressão Gênica por Real-Time PCR array Dnase I M 1 2 Verificação da qualidade do RNA total (gel de agarose 2%) DNA genômico RNAr 28S RNAr 18S Digestão TºC ambiente - 15 min Inativação 70ºC - 10 min. Digestão do DNA
30 Tampão dntp Oligo (dt) DTT Transcriptase Reversa PCR em tempo real Hibridizar com caudas poli (A) Estudo da Expressão Gênica Transcriptase reversa Degradação do RNA com Rnase H Segunda fita de cdna usando a DNA polimerase
31 Análise de Expressão protéica por imunohistoquímica Seleção dos genes diferencialmente expressos para a realização da validação por imuno-histoquímica (IHC).
32 Resultados Esperados Espera-se contribuir significativamente para a elucidação dos mecanismos de resistência tumoral observada nas neoplasias mamárias após PDT e para a detecção das alterações moleculares (expressão gênica e protéica diferencial) Contribuir para um maior conhecimento da biologia tumoral e para o melhor entendimento dos mecanismos de atuação da TFD potencializando sua efetividade antitumoral em modelo experimental de tumor de mama
33 Referências Bibliográficas INCA, M.d.S.S.d.A.à.S.I.N.d.C., Câncer no Brasil: dados dos registros de base populacional. Rio de Janeiro: Brasil, PUSZTAI, L., et al., Molecular classification of breast cancer: limitations and potential. Oncologist, (8): p DOBBE, E., et al., Gene-expression assays: new tools to individualize treatment of early-stage breast cancer. Am J Health Syst Pharm, (1): p Bagnato, V.S.J.F.C.K.L.G.M.G.A.C.F.J.C.M., Guia Prático de Terapia Fotodinâmica para o Tratamento de Tumores SUN, W., et al., Integrated study of copy number states and genotype calls using high-density SNP arrays. Nucleic Acids Res, (16): p CASAS, A., et al., Tumor cell lines resistant to ALA-mediated photodynamic therapy and possible tools to target surviving cells. Int J Oncol, (2): p VAN 'T VEER, L.J., et al., Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, (6871): p
34 Referências Bibliográficas WANG, Y., et al., Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet, (9460): p LIU, J., et al., Identification of a gene signature in cell cycle pathway for breast cancer prognosis using gene expression profiling data. BMC Med Genomics, : p. 39. BIRDWELL RL. Pocket radiologist. Breast top 100 diagnoses. 1st ed. Salt Lake City: Amirsys; Filho JAO, GARCIA, AHR.,Câncer colorretal: tratamento quimioterápico adjuvante e na doença metastática. In: Guimarães JRQ. Manual de Oncologia. 2ª ed. São Paulo (SP): BBS Editora; 2006 WATSON, D. James, et al., DNA recombinante Genes e Genomas, 3ª edição, Artmed, São Paulo, e.html
35 PESQUISADORES ENVOLVIDOS Profa. Dra Juliana Ferreira LEVB - Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos - SP Prof. Dr Airton Abrahão Martin LEVB - Universidade do vale do Paraíba, São José dos Campos - SP Profa. Dra. Mônica Fernandes Gomes Universidade Estadual Paulista, UNESP, São José dos Campos - SP Prof. Dr Leandro José Raniero LEVB- Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos SP Joze Barbosa Galioti Bolsista treinamento técnico LEVB / UNIVAP, São José dos Campos - SP Auxílio Financeiro:
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