A presença de IPTG nos meios de cultura para rastreio de colonias azuis/brancas tem como função:

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1 MANIPULAÇÃO MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA EXAME TEÓRICO EM O DNA complemantar (cdna) de um gene contém: a) Sequencia correspondente aos intrões b) A Sequencia correspondente à região promotora c) As sequencias correspondentes aos codões d) Uracilo em vez de Timina e) Um local múltiplo de clonagem O rastreio de colónias azuis/brancas baseia-se num fenómeno chamada alfa complementação. Para se poder usar este sistema de rastreio é necessário deispor de uma estirpe especial de E. coli que: a) Expresse o fragmento C-terminal da B-galactosidase b) Expresse o fragmento N-terminal da B-galactosidase c) Possua o gene lacz num plasmidio F + d) Degrade o substrato X-Gal de modo espontâneo e) Possua o gene CcdB funcional A presença de IPTG nos meios de cultura para rastreio de colonias azuis/brancas tem como função: a) Inativar o operão lac b) Inativar a proteína repressora do operão lac c) Produzir uma cor azul ao ser hidrolisado pela B-galactosidase d) Substituir a função do X-Gal e) Inibir a expressão do fragmento N-terminal da B-galactosidase A técnica de clonagem conhecida por TA cloning baseia-se: a) Na utilização de enzimas de restrição mais ligase b) Na propriedade natural dos promotores TATA sofrerem recombinação c) Na propriedade especial da Taq DNA polimerase, que deixa extremidades protuberantes 3 -A nos amplificados d) No facto de sequencias ricas em AT poderem ser mais facilmente amplificadas e) Em plasmídeos linearizados que possuem uma timina protuberante numa extremidade e uma adenina protuberante na outra extremidade A tecnologia de DNA microarrays a) Permite detecção e quantificação simultânea de milhares de mrnas numa amostra b) Só é aplicável a detecção de sequencias especificas de DNA genómico da amostra c) Faz uso de um só tipo de fluorocromos d) Baseia-se no uso da Taq DNA polimerase e) É utilizada para transfectar células estaminais embrionárias

2 A mutagénese dirigida sitio especifica pode ser efectuada por PCR. Para isso: a) O programa do termociclador deve ser terminado num período de 95ºC para se obter DNA em cadeia simples b) Os primers incorporam a mutação pretendida c) O resutado da amplificação é um produto circular d) Durante a reação de PCR o DNA amplificado tem que sofrer metilação e) A reacção deve conter 3 primers em vez de dois A técnica mais habitual para introduzir DNA estranho em plantas é baseada em: a) Electroporação b) Aceleração de partículas c) Infecçao via plasmidio TI d) Microinjecção e) Lipossomas Uma biblioteca genómica contém a) Todos os genes do organismo b) Apenas genes expressos c) Fragmentos do genoma cortados com varias enzimas de restrição d) Fragmentos do genoma que resulta de uma digestão parcial com uma enzima de restrição e) Vetores de clonagem que são somente fagos como por exemplo fago EMBL Clonagem posicional é um método que permite a) Clonar regiões distantes de um cromossoma por ciclos sucessivos de hibridação b) Clonar regiões homologas de dois cromossomas por ciclos sucessivos de hibridação c) Clonar regiões próximas num cromossoma utilizando fragmentos de DNA sobreponíveis em ciclos sucessivos de hibridação d) Clonar regiões trans de um cromossoma por hibridação utilizando sondas de cdna sobreponíveis e) Clonar genes relacionados funcionalmente através de hibridações com sondas de fragmentos de DNA distantes no cromossoma Na síntese de cdna a partir de mrna utiliza-se: a) Terminal transferase b) Transcriptase reversa c) DNA polimerase I de E. coli d) T4 DNA ligase e) RNA polimerase

3 Uma reação de sequenciação de DNA pela técnica de cycle sequencing envolva a presença de: a) DNA polimerase I b) Dois primers por reação c) Um primer por reação d) Quatro tipos de ddntps marcados radioactivamente por reação e) Quatro tipos de ddntps marcados com um fluorocromo por reação As cadeias de DNA obtidas numa reação de sequenciação são separadas: a) Em gel desnaturante de agarose b) Em gel não desnaturante de agarose c) Em gel desnaturante de poliacrilamida d) Em gel não desnaturante de poliacrilamida e) Em gel de agarose de concontração mínima Quais são as moléculas de DNA que apresentao uma maior temperatura de desnaturação, Tm? a) As moléculas com um conteúdo mais rico nos pares de bases AT b) As moléculas com um conteúdo mais rico nos pares CG c) As moléculas com menor quantidade de GA d) As moléculas com menor quantidade de CT e) As moléculas com igual conteúdo de GA e CT FISH é um processo de hibridação que designa a) Hibridação in situ com fluorescência b) Hibridação intra cadeias de DNA com genes da mesma família c) Hibridação livre (free) in solution d) Hibridação in state com fluorocromos específicos e) Todas as alíneas estão erradas A hibridação Northern a) Inclui o uso de anticorpos como sonda b) Permite a determinação do tamanho de um intrão c) Permite a identificação de DNA especifico d) O tamanho do genoma e) Permite a determinação do tamanho dum mrna Duas cadeias de DNA podem-se manter emparelhadas apesar de pertenceram a organismos diferentes e apresentarem uma percentagem de identidade de sequencia 80%. Isso acontece se as duas cadeias estiverem sobre baixas condições de restringência. Estas condições de baixa restringência, relativamente a restringência elevada, implicam:

4 a) Uma temperatura dde hibridação maior b) Uma concentração maior de um agente desnaturante na solução de hibridação c) Ausência de agente desnaturante na solução de hibridação d) Uma menor concentração de sal na solução de hibridação e) Um ph mais básico na solução de hibridação A extração e purificação de DNA genómico de organismos eucariontes parte sempre de a) Homogeneização das células e isolamento dos núcleos b) Fixação das células com glutaraldeido c) Isolamento dos cloroplastos e mitocôndrias d) Cristalização do DNA e) Precipitação com etanol do DNA No procedimento de purificação com DNA é por vezes necessário extrair o DNA com fenol ou com uma mistura de fenol clorofórmio. A preparação é submetida a uma centrifugação para se retirar da solução a) O RNA que se encontra na fase aquosa superior b) As proteínas que se encontram na fase superior fenólica c) As proteínas que estão precipitadas no limite entre a fase fenólica e a fase aquosa d) O RNA que se encontra na fase inferior fenólica e) Os glicolípidos que se encontram na fase aquosa Uma técnica que permite determinar o tamanho de moléculas de DNA especificas é: a) Western blot b) Northern blot c) Eastern blot d) Southern blot e) Zoo blot

5 1"questão*8*das*fichas*em*inglês* 2"*calculo*da*eficiencia*e*do*rendimento* Perguntas*que*o*pessoal*se*lembra* 3"*tb*acho*eu*para*que*serve*o*Nothern*blotting** 4"Como*se*chama*à*manipulação*de*extractos,*desde*DNA,*proteínas,*etc:** a)transgenia*b)biotecnologia*...** 5"No*cycle*sequencing..* a) usam"se*2*primers*por*reacção**b)*usa"se*1*primer*por*reacção**c)tal*e*tal*dna*polimerase** 6"As*bibliotecas*genómicas** a) contém*todos*os*genes*de*um*organismo*b)fragmentos*de*dna*cortados*com*enzimas*de* restrição*c)*fragmentos*de*dna*digeridos*parcialmente*com*uma*enzima*de** 7"saiu*uma*imagem*do*ciclo*de*PCR,*e*tinhamos*de*dizer*o*nome*de*cada*fase*do*ciclo*e*o*que* podia*melhorar*em*cada*fase*para*aumentar*o*rendimeno*deste** 8"clonagem*posicional/*separaçao*de*proteinas*por*fenol/*mutagene*dirigida/*1o*passo* extracao*dna*eucariotico/*cloning*ta/*para*que*serve*microaaray//vantagem*qpcr//*separacao* para*sequenciacao*em*que*gel/*baixar*a*restringencia*como/*transcriptase*reversa*para*fazer* cdna/** 9"fazer*primer*degenerado*a*partir*de*sequencias*de*varios*organismos/*fazer*primers*de*uma* sequencio*(como*exame*modelo)/* * * Correção*das*perguntas*do*exame*de*época*normal*2013"MMB*EM*teórica* 1.c); 2.a); 3.b); 4.c); 5.a); 6.b); 7.c); 8.c); 9.c); 10.b); 11.c); 12.c); 13.b); 14.a); 15.e); 16.c); 17.a); 18.c); 19.d);* *

6 Manipulação Molecular e Biotecnologia NOME: CURSO: 1 Na experiência esquematizada na figura, bacteriófagos com elevada frequência de infecção (e.o.p. =1) na estirpe original X, foram usados para re infectar quer a estirpe X novamente, quer a estirpe Y. Em cada círculo representando uma placa de Petri, indique a frequência de infecção (e.o.p. efficiency of plating) esperada: 1 para e.o.p elevada. 2 X 10 4 para e.o.p. baixa Porque razão, para o mesmo bacteriófago, a eficiência de infecção não é sempre igual para as mesma estirpes? Se um DNA for propagado numa estirpe de E. coli com fenótipo (r, m + ) poderá, uma vez clonado nesta estirpe e após extraído e purificado, ser propagado numa outra estirpe sem mutações nos 3 genes hsd? Justifique.

7 5 Relativamente à Sau3A1 ( GATC) diga, das seguintes enzimas qual ou quais a) são isoesquizómeros; b)têm extremidades compatíveis: 1. XhoII R GATCY 2. PsuI R GATCY 3. FbaI T AGATCA 4. NdeII GATC 5. BamHI G GATCC 6. DpnI GA TC Symbol [1] Description Bases represented W weak A T S strong C G M amino A C K keto G T R purine A G Y pyrimidine C T B not A C G T D not C A G T H not G A C T V not T A C G any base (not a N gap) A C G T 2 Foi obtido um fragmento de restrição por digestão de gdna de Arabidopsis com a enzima BglII, e clonado no local BamHI do plasmídeo puc57. Para recuperar este importante fragmento de DNA, porque é que não foi possível usar nem a BamHI nem a BglII? Explique a sua resposta (se preferir, recorrendo a um esquema). Locais de reconhecimento das enzimas BamHI: G/GATCC e BglII: A/GATCT. Na imagem abaixo está representado o resultado da separação, por electroforese em gel de agarose de: 1 plasmídio puc extraido de E. coli e não cortado; 2 plasmídio puc digerido com enzima HindIII; 3 Marcador DNA de lambda digerido com HindIII. A enzima HindIII possui apenas um local de reconhecimento no plasmídio puc. (Ao lado encontramse os fragmentos obtidos por restrição de DNA de lambda com HindIII e respectivos tamanhos) a) A que configuração corresponde a banda mais forte do plasmídio puc na pista 1? b Porque razão a banda da pista 2, que corresponde ao mesmo plasmídio, se encontra numa posição correspondente a um tamanho molecular mais elevado? 3 Por comparação com o marcador molecular na pista 3 (Lambda/HindIII) qual é o tamanho aproximado do plasmídio? Justifique

8 6 Messing e colaboradores desenvolveram uma classe de vectores (puc) que permitem a identificação histoquímica dos clones recombinantes. Para isso a)incorporaram no vector o gene que codifica a beta lactamase b)incorporaram no vector o gene completo da beta galactosidase c)introduziram um local de clonagem múltipla no gene parcial da beta galactosidase d) introduziram um local de clonagem múltipla no gene resistência à ampicilina e)introduziram no vector a mutação lacz M15 (corresponde a uma delecção na porção que codifica a região N terminal da beta galactosidase) 7 O rastreio de colónias azuis/brancas baseia se num fenómeno chamado de alfa complementação. Para se poder usar este sistema de rastreio é necessário dispor de uma estirpe especial de E. coli que (assinalar opção correcta): a) Expresse o fragmento C terminal da b galactosidase b) Expresse o fragmento N terminal da b galactosidase c) Possua o gene lacz num plasmídeo F d) Degrade o substrato X Gal de modo espontâneo e) Possua o gene CcdB funcional Na síntese de cdna a partir de mrna utiliza se (assinalar a opção correcta) a) terminal transferase b) DNA polimerase I de E. coli c) T4 DNA ligase d) RNA polimerase e) transcriptase reversa Na síntese de mrna a partir de cdna utiliza se (assinalar a opção correcta) a) terminal transferase b) DNA polimerase I de E. coli c) T4 DNA ligase d) RNA polimerase e) transcriptase reversa Um cdna possui uma extremidade NotI a 5' e uma extremidade EcoRI a 3' (poli A) e está inserido no vector pbluescript SK II (ver mapa em anexo). A partir do referido cdna clonado pretende se obter uma SONDA de RNA por transcrição in vitro para detectar os respectivos mrnas em técnicas de "Northern blotting". Para isso, após linearização do plasmídio com enzima de restrição adequada adiciona se a)ribonucleotídeos e a RNA polimerase específica para o promotor T3 b) ribonucleotídeos e a RNA polimerase específica para o promotor T7 c) desoxirobonucletídeos e uma transcriptase reversa d) um iniciador (poli dt) que emparelhasse com a sequência poli A do cdna e transcriptase reversa e) um iniciador que emparelhasse com a sequência do promotor T7 e a respectiva RNA polimerase Justifique a resposta anterior A enzima Taq DNA polimerase (assinalar com V ou F, respectivamente para verdadeiro e falso ) apresenta actividade de exonuclease de 5 para 3 apresenta actividade de exonuclease de 3 para 5 apresenta actividade de proofreading

9 7 Faça a legenda da figura. 8 Caracterize, justificando, os 3 pares de primers relativamente a a) eficiência b) especificidade 20 Com o objectivo de expressar a proteína em E. coli e após ser conhecida a sequência de cdna de cardosina A foram desenhados dois primers com adaptadores NheI. Pretendia amplificar se a zona de 76 a 1515 da sequência abaixo. A sequência de reconhecimento da NheI é G^C T A G C Assinale na sequência da ficha abaixo a zona de emparelhamento dos primers Primer F Pro NheIe e Primer R NheI (Reverse). Indique abaixo, a sequência nucleotídica do Primer R NheI (Reverse) Primer F Pro NheI, GCTAGCTCCGATGACGGATTGATTCGA e Primer R NheI, Qual é o tamanho do amplificado com os primers referidos contendo o local NheI? Porque razões foram acrescentadas aos primers sequências de reconhecimento para a enzima NheI? FICHA DO GENEBANK: LOCUS CCA bp mrna PLN 30-SEP-1999 DEFINITION Cynara cardunculus mrna for preprocardosin A. ACCESSION AJ VERSION AJ GI: KEYWORDS carda gene; cardosin A; preprocardosin A.

10 SOURCE Cynara cardunculus. ORGANISM Cynara cardunculus REFERENCE 1 (bases 1 to 1515) AUTHORS Faro,C., Ramalho-Santos,M., Vieira,M., Mendes,A., Simoes,I., Andrade,R., Verissimo,P., Lin,X., Tang,J. and Pires,E. TITLE Cloning and characterization of cdna encoding cardosin A, an RGD-containing plant aspartic proteinase JOURNAL J. Biol. Chem. 274 (40), (1999) MEDLINE REFERENCE 2 (bases 1 to 1515) AUTHORS Faro,C.J. TITLE JOURNAL FEATURES Direct Submission Submitted (25-MAR-1999) Faro C.J., Biologia Molecular e Biotecnologia, Centro de Neurociencias de Coimbra, Universidade de Coimbra, Edificio IBILI, Azinhaga de Sta Comba, 3000 Coimbra, PORTUGAL Location/Qualifiers source /organism="cynara cardunculus" /db_xref="taxon:4265" /dev_stage="young flower buds" /country="portugal:centro" gene /gene="carda" CDS /gene="carda" /note="during maturation of the protein a propeptide (from nucleotide 76 to 204) and an internal peptide (from nucleotide 931 to 1242) known as PSI are removed." /codon_start=1 /product="preprocardosin A" /protein_id="cab " /db_xref="gi: " /translation="mgtsikanvlalflfyllsptvfsvsddgliriglkkrkvdrid QLRGRRALMEGNARKDFGFRGTVRDSGSAVVALTNDRDTSYFGEIGIGTPPQKFTVIF DTGSSVLWVPSSKCINSKACRAHSMYESSDSSTYKENGTFGAIIYGTGSITGFFSQDS VTIGDLVVKEQDFIEATDEADNVFLHRLFDGILGLSFQTISVPVWYNMLNQGLVKERR FSFWLNRNVDEEEGGELVFGGLDPNHFRGDHTYVPVTYQYYWQFGIGDVLIGDKSTGF CAPGCQAFADSGTSLLSGPTAIVTQINHAIGANGVMNQQCKTVVSRYGRDIIEMLRSK IQPDKICSHMKLCTFDGARDVSSIIESVVDKNNDKSSGGIHDEMCTFCEMAVVWMQNE IKQSETEDNIINYANELCEHLSTSSEELQVDCNTLSSMPNVSFTIGGKKFGLTPEQYI LKVGKGEATQCISGFTAMDATLLGPLWILGDVFMRPYHTVFDYGNLLVGFAEAA" BASE COUNT 400 a 298 c 368 g 449 t ORIGIN 1 atgggtacct caatcaaagc aaacgtgctt gccttgttct tgttttatct tctatcacct 61 actgtatttt cggtctccga tgacggattg attcgaattg gacttaaaaa gaggaaggtg 121 gaccgaatcg accaacttcg tggacgtcgt gcgttaatgg aaggaaatgc tcgaaaagat 181 ttcggcttcc gtggtacagt tagggactcg ggtagtgccg ttgttgcact aacgaacgat 241 agggatactt cgtattttgg tgagattggt atcggaactc cacctcagaa gttcacagtg 301 attttcgata ccggaagttc tgttctatgg gtgccttctt caaagtgcat caattcaaaa 361 gcttgtcgtg cgcactcaat gtatgagtcg agcgattcaa gtacctacaa ggaaaatggg 421 acatttggcg ctattatata tggaaccgga tcaatcacgg gtttttttag ccaagactct 481 gtcacgatcg gtgatcttgt tgttaaagag caggatttta tagaggcaac cgatgaggcc 541 gacaatgttt tcttgcatag gttgtttgac ggtatactcg gcctttcatt tcaaacgatc 601 tccgttcctg tctggtacaa catgcttaat caaggtcttg ttaaagaacg gaggttttcc 661 ttttggttga atcgcaatgt tgatgaggaa gaaggtggcg aactcgtgtt tggtgggctt 721 gaccctaatc attttagggg tgaccacact tatgtccctg tgacttatca gtactattgg 781 cagtttggaa tcggtgacgt tcttattgga gataaaagta ccggattttg cgcccctggt 841 tgtcaagcat ttgccgactc tggaacctct ttgttgtcag gtccaacggc tattgttact 901 caaatcaatc atgcaattgg cgctaacggg gtcatgaacc agcaatgcaa gacagtggtt 961 agtcgttatg gaagggatat aattgagatg ctccgatcta agatacaacc tgataaaatc 1021 tgttcgcaca tgaagttatg cacttttgac ggtgctcgcg atgttagttc aatcattgag 1081 agcgtggttg acaagaataa cgacaagtct tctggtggca tacatgatga gatgtgcacc 1141 ttctgtgaga tggcggtcgt ttggatgcaa aacgaaatca aacaaagcga gactgaagat 1201 aacataatca actatgccaa cgagttgtgt gaacacttat ccacttcatc tgaagaatta 1261 caagtagatt gcaacactct ttcctccatg cccaatgttt cctttacaat tggtggcaaa 1321 aaatttgggc tcaccccaga gcagtacatc ttgaaagtcg gtaagggaga agcaacacaa 1381 tgcatcagtg gattcactgc gatggatgcg actcttcttg gacctctgtg gatcctcgga 1441 gatgttttca tgcgtccata tcacacagtg tttgattatg gcaatttact agttggattt 1501 gcagaagcag cttga

11 Para optimizar uma reacção de qpcr para detecção de RNA específico, foi obtida uma recta padrão a partir de uma série de diluições do molde. C= concentração inicial, C X 10 1 ; C X 10 2 etc. log(1) = 0 log(0,1) = 1 log(0,01) = 2 etc. Para se garantir o rigor quantitativo de qpcr, deve ser demonstrado que o valor de Ct tem uma relação de proporcionalidade com o log da quantidade de molde inicial presente na reacção. Habitualmente isso consegue se a) Analizando o gráfico de Ct vs. diluições sucessivas de quantidade inicial de molde b) Testando previamente a qualidade dos fluorocromos c) Averiguando se as concentrações de cada componente individual da reacção se encontra optimizado d)testar o termociclador e verificar que se encontra em modo optimizado de funcionamento A partir do gráfico podemos afirmar que a) ao Ct de aprox. 35 corresponde a concentração mais elevada b) ao Ct de aprox. 10 corresponde uma diluição de 10 4 c) ao Ct de aprox. 35 corresponde uma diluição de 10 4 d) ao Ct de aprox. 35 corresponde o DNA não diluído A vantagem mais notável de qpcr sobre PCR convencional é: a) Não haver produtos de amplificação inespecíficos b) Permitir amplificar RNA sem necessidade da reacção prévia com a transcriptase reversa c) Ser muito mais rápida na obtenção de resultados d) Poder ser usada para determinar com rigor a quantidade inicial de molde na reacção e) Poder ser usada em grande escala com reagentes mais baratos A recta padrão anterior permite estimar a gama de diluições em que o Ct tem uma relação de proporcionalidade com o log da quantidade de molde inicial presente na reacção. Podemos afirmar que a) existe proporcionalidade em toda a gama de diluições utilizadas b) não se conseguiu determinar o Ct para as duas amostras mais diluídas c) não se observa uma relação linear para as duas amostras mais concentradas d) não se deve diluir a amostra Na utilização da tecnologia GeneChip microarray para estudar a expressão genética de leveduras em meio mínimo quando comparada com a expressão genética em meio rico (V/F) esta tecnologia permite quantificar os níveis de expressão (volume de RNA) de determinados genes em cada situação as sondas correspondem aos RNAs extraídos das células as sondas poderão corresponder a porções de DNA imobilizados num suporte sólido o suporte divide se em posições (features) e cada uma tem apenas uma única molécula de DNA

12 neste tipo de experiência ocorre emparelhamento de cadeias complementares de ácidos nucleicos formando se moléculas de cadeia dupla cada sonda deverá conter uma sequência única representativa de um gene específico 21 Ordene os passos necessários para realizar a experiência acima referida O cdna emparelha apenas com sondas complementares no chip são usados lasers para detectar a presença de fluorescência no chip a presença de fluorescência indica uma correspondência do cdna com a sonda o RNA total é extraído de células nas diferentes condições experimentais o chip com a mistura de cdnas vai a incubar a uma temperatura adequada à hibridação alvo sonda os cdnas marcados são misturados e a mistura é pipetada sobre o chip o RNA sofre transcrição reversa para cdna o chip é submetido a lavagem de modo a remover as moléculas não emparelhadas com a sonda o cdna é marcado com fluorocromos diferentes consoante as condições experimentais das células 22 Na detecção de mutações ou polimorfismos, nomeadamente SNPs por microarrays (escolher opção correcta) a) as sondas imobilizadas são constituídas por RNA mensageiro b) as sondas imobilizadas são constituídas por cdna marcados com fluorocromos c) a amostra é constituída por RNA mensageiro d) a amostra é constituída por cdna marcado com fluorocromos e) a amostra é constituída por DNA genómico O esquema representa o resultado de uma reacção de sequenciação manual realizada pelo método de Sanger. Qual é a sequência nucleotídica lida a partir do gel? Neste esquema cada banda: a) Representa um nucleotídio diferente (G,A, T ou C) b) Representa um didesoxinucleotídio diferente (ddgtp,ddatp, ddttp ou dd CTP) c) Representa um fragmento de DNA de cadeia simples que termina numa base conhecida d) Representa um fragmento de DNA de cadeia dupla que termina numa base conhecida 22 A sequenciação pelo método de Sanger é classicamente executada em 4 tubos separados de reacção. Contudo, é possível realizar quatro reacções simultaneamente no mesmo tubo desde que (assinalar opção correcta) a) se use um nucleotídeo radioactivo incorporado no iniciador b) os ddntps sejam marcados radioactivamente c) os oligonucleotídeos iniciadores sejam marcados com fluorocromos emitindo diferentes cores d) cada ddntp seja marcado com um fluorocromo diferente e) cada um dos 4 dntps normais deve ser marcado com um fluorocromo de cor diferente dos outros Assinale com V/F as seguintes afirmações relativas à pirosequenciação: este processo envolve as enzimas DNA polimerase, sulfurilase e luciferase

13 não é necessário usar oligonucleotídeos iniciadores é necessário utilizar di desoxinucleotídeos é necessário usar primes marcados com um fluorocromo um só tipo de dntp é adicionado de cada vez á reacção cada vez que um nucleotídeo é incorporado, há libertação de há uma relação entre o PPi libertado durante a incorporação de um nucleotídeo e a luz detectada no final da reacção