BIOLOGIA MOLECULAR AULAS PRÁTICAS. 3º ano, 1º semestre

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1 BIOLOGIA MOLECULAR AULAS PRÁTICAS 3º ano, 1º semestre

2 EXERCÍCIO Nº 1 Considere que fez uma electroforese em gel de agarose, para verificar o mapa de restrição do plasmídeo pvu1, abaixo desenhado. Desgraçadamente, estava distraído (a) e não registou que enzima(s) utilizou em cada uma das misturas de reacção que foram analisadas (1 a 6). Consulte o mapa de restrição do plasmídeo e o esquema da separação electroforética realizada apresentados, e indique qual ou quais foram as enzimas utilizadas em cada um dos ensaios de restrição (1 a 6). BamHI: PvuI: PvuI/ BamHI: BamHI/ HindIII: HindIII/ PvuI: Bam HI/ HindIII/ PvuI:

3 EXERCÍCIO Nº2 As enzimas de restrição BanI, HaeII e SacI foram usadas na construção do mapa de restrição do plasmídeo ptsu. Efectuaram-se digestões simples e múltiplas, e os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose. Os resultados obtidos estão representados no esquema seguinte: Construa o mapa de restrição do plasmídeo ptsu para as enzimas BanI, HaeII e SacI, indicando no esquema a posição relativa dos diferentes sítios de restrição.

4 EXERCÍCIO Nº3 Na Figura está esquematizado um ensaio de sequenciação de um fragmento de DNA, segundo o método enzimático ou de Sanger. DNA 5 - TGC CCA ACG GGT 5 (429) (460) primer ENZIMA (E): reacção A reacção C reacção G reacção T α- 32 P datp ddatp dgtp dctp dttp α- 32 P datp ddctp dgtp dctp dttp α- 32 P datp ddgtp dgtp dctp dttp α- 32 P datp ddttp dgtp dctp dttp ntd 460 ntd 429 A C G T

5 3.1. Identifique a enzima (E) utilizada Por que razão se utilizaram os nucleótidos dideoxi (ddntp) para definir a posição do nucleótido correspondente na sequência de DNA? 3.3. Faça a leitura do gel de sequenciação, apresentado no esquema da Fig.1, entre os nucleótidos 430 e 440, indicando a orientação da sequência lida Escreva a estrutura nucleotídica do fragmento correspondente.

6 EXERCÍCIO Nº4 A tecnologia do DNA recombinante, baseada em avanços essenciais da Biologia Molecular de diversos tipos de organismos vivos, tornou possível, de modo insubstituível, o aprofundamento do conhecimento da estrutura e funcionamento de genomas complexos. A Figura 4 corresponde ao esquema de um cdna full-length (A) e de um vector de clonagem (B) utilizado na clonagem molecular do mesmo: A. E B S ATG H P X B 5 3 B. KpnI BstXI SmaI ClaI ApaI NotI XbaI ScaI XhoI HindII EcoRI BamHI SpeI PstI BssHII SacI Figura 4 - A. Mapa de Restrição do cdna full-length. Sítios de restrição: E- EcoRI; B- BamHI; S- SmaI; H- HindIII; P- PstI; X- XhoI. B. Vector de Clonagem: pbk-cmv. MCS multiple cloning site; P CMV promotor de citomegalovírus; P Lac promotor lac; Lac Z β- galactosidase; P SV-40 promotor SV-40; SV-40 pa SV-40 polia; neo/kan gene de resistência a neomicina/ kanamicina.

7 4.1. Quais os critérios que utilizaria para seleccionar as enzimas de restrição a utilizar na clonagem direccional do cdna no vector pbk-cmv? Especifique o sistema escolhido Refira o método que utilizaria na selecção de clones positivos eventualmente obtidos no ensaio de clonagem. Justifique.

8 EXERCÍCIO Nº5 Imagine que está a tentar clonar o cdna que codifica para a proteína X, num vector de expressão eucariótico (pbm). Começou por ligar um fragmento de 2Kb de DNA com extremidades EcoRI, que corresponde ao quadro de leitura da proteína, com o vector de expressão pbm, que anteriormente tinha sido linearizado com EcoRI. Após transformação de células E. coli foram obtidas 5 colónias (A, B, C, D e E). O DNA plasmídico for extraído a partir de cada uma destas colónias, e foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SalI. Os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose, e os resultados do gel estão representados no diagrama seguinte:

9 5.1. Explique os vários padrões de restrição obtidos, e escolha o clone que usaria (A, B, C, D e/ou E), se quisesse exprimir a proteína X numa linha celular eucariótica.

10 EXERCÍCIO Nº6 Considere o fragmento HindIII de 1,6 kb (A) e o vector plasmídico hipotético de 2,7 kb (B), representados na Figura 1 abaixo indicada. A. B. Hind III Hind III 1,6 Kb fragmento Hind III 2,7 Kb Hind III 0,3 Kb Eco RI vector plasmídico Quando se digere o referido fragmento A com BamHI originam-se dois fragmentos, de 1,2 kb e 0,4 kb. Admita que clonou o fragmento representado em A no sítio HindIII do vector representado em B. Como procederia para determinar a orientação do fragmento num dos clones recombinantes?

11 EXERCÍCIO Nº7 O gene biomol exprime-se no fígado de rato e a sua expressão é regulada pelos glucocorticóides. Foram tratados ratos com 30 mg /Kg de dexametasona, e sacrificados a diferentes tempos após administração do indutor. Foi extraído RNA total a partir dos fígados de ratos controlo e de ratos tratados, e foi efectuada uma experiência de Northern blot. Na Figura seguinte está esquematizado o resultado da experiência de Northern blot. Tempo (h) mrna gene biomol X mrna? β - actina 7.1. Analise o esquema anterior e descreva os resultados obtidos, referindo-se aos tempos de indução do gene biomol pelos glucocorticóides. Justifique a sua resposta.

12 O esquema seguinte representa os resultados de um outro ensaio de Northern blot, em que se analisaram os níveis de expressão de três factores de transcrição potencialmente envolvidos na regulação do gene biomol. Tempo (h) mrna TF1 mrna TF2 mrna TF3 mrna β-actina 7.2. Comparando a relação cronológica entre a expressão dos vários factores de transcrição (TF1, TF2 e TF3) e a activação da transcrição do gene biomol, diga qual destes factores estará potencialmente envolvido a expressão do gene biomol. Justifique a sua resposta.

13 EXERCÍCIO Nº8 A figura 8-A representa um clone genómico, que comporta a sequência nucleotídica que codifica para um factor de transcrição de Drosophila melanogaster. As setas indicam o sítio de iniciação da transcrição (seta 1), bem como a região 3 do último exão (seta 2). Dois fragmentos de restrição obtidos a partir deste clone foram marcados com 32 P e usados como sondas (sonda 1 e sonda 2), num ensaio de Northern blot. As amostras de mrna que se utilizaram foram obtidas a partir de diferentes estadios de desenvolvimento: embrião (E), larva (L) e adulto (A). O resultado da análise de Northern blot está esquematizado na fig. 5-B. Fig. 8 - A Clone genómico 1 sonda 1 sonda 2 2 Fig. 8 B E L A E L A Resultados obtidos com a sonda 1 Resultados obtidos com a sonda 2

14 8.1. Interprete os resultados obtidos através da análise de Northern blot, com ambas as sondas Imagine que quer clonar o cdna que codifica para este factor de transcrição: a) Que estadio de desenvolvimento (E, L ou A) utilizaria para gerar a sua biblioteca de cdna? Porquê? b) Que sonda utilizaria para fazer o screening de uma biblioteca de cdna. Porquê?

15 Depois de ter clonado com sucesso o cdna que codifica para o factor de transcrição em estudo, utilizou dois fragmentos do cdna como novas sondas (sonda 3 e sonda 4), em novos ensaios de Northern blot Desenhe no diagrama abaixo representado, os resultados que esperaria obter após hibridação de dois novos blots, com as sondas 3 e sonda 4. Justifique a sua resposta. Sequência do cdna: 5 ACGTATGATACTGGTACGTCTGTAATGCGAAAAAAAAAAAAAA 3 sonda 3 sonda 4 E L A E L A Resultados esperados para a sonda 3 Resultados esperados para a sonda 4

16 EXERCÍCIO Nº9 Resultados experimentais demonstraram que factor de transcrição FT1 tem capacidade de heterodimerizar com outros dois factores de transcrição (FT2 e FT3), e que alguns destes heterodímeros são importantes na regulação da transcrição do gene X. Imagine que está interessado em caracterizar os diferentes domínios da proteína FT1. Para tal, construiu uma série de mutantes de deleção e co-transfectou cada um destes mutantes com um plasmídeo reporter que contém o promotor próximo do gene X. Foram também efectuados ensaios em que adicionalmente se co-transfectaram os vectores de expressão que codificam para as proteínas FT2 ou FT3 selvagens. Na tabela seguinte encontram-se os níveis de activação da transcrição do gene X pelos diferentes mutantes do factor FT1, na presença ou ausência de FT2 ou FT3: Domínio mutado de FT1 FT1 FT1 + FT2 FT1 + FT3 1 Wt Por outro lado foram efectuados ensaios de EMSA em que se utilizou como sonda o elemento de resposta do factor FT1 no promotor do gene X e extractos nucleares de células COS-7 que tinham sido transfectadas com cada um dos mutantes de deleção. Os resultados obtidos estão representados no diagrama seguinte: wt shift sonda livre

17 9.1. Qual o domínio de ligação ao DNA da proteina FT1? Justifique a sua resposta Qual o domínio de transactivação da proteina FT1? Justifique a sua resposta Será que FT1 heterodimeriza com FT2 e FT3 através do mesmo domínio? Justifique a sua resposta.

18 EXERCÍCIO Nº10 O gene isca é um gene de expressão hepática, importante nos processos de destoxificação do organismo. Num artigo recente, investigadores testaram o papel do factor de transcrição FEL (FTY) na indução da transcrição do gene isca. Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de iniciação da transcrição deste gene SV Luc SV Luc SV Luc Luc Luc Luc Actividade Luc (x de indução) Controlo FTY Figura 10: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em culturas de células CV1 (fibroblastos de rim de macaco). Co-transfecção do vector de expressão para o factor de transcrição fel (FTY) com os vários recombinantes contendo a região reguladora do gene isca. Luc gene reporter luciferase; SV promotor SV-40.

19 10.1. Existe uma diferença fundamental ao nível do promotor utilizado na construção dos vectores recombinantes 1,2 e 3, e dos 4,5 e 6. Diga qual é essa diferença De acordo com a análise dos resultados indique qual é a região responsável pela activação da transcrição do gene isca pelo factor FEL. Justifique a sua resposta.

20 EXERCÍCIO Nº11 O gene isca é um gene de expressão hepática induzido pelos glucocorticóides. Num artigo recente, investigadores tentaram identificar o elemento de resposta aos glucocorticóides na região reguladora do gene isca. Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de iniciação da transcrição do gene SV Luc -790 SV -790 SV Luc Luc Luc Luc Luc Actividade Luc (x de indução) Controlo 10uM DEX Figura 11: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células HuH7 (hepatoma humano). Transfecção de vários recombinantes contendo a região reguladora do gene X. As células foram tratados com veículo ou com 10µM de dexametasona (DEX). Luc luciferase; SV promotor SV-40.

21 Pela análise dos resultados podemos identificar duas regiões reguladoras no gene isca: uma das regiões é importante para a expressão basal do gene, enquanto a outra é responsável pela resposta aos glucocorticóides Identifique essas duas regiões, justificando a sua resposta.

22 EXERCÍCIO Nº12 Trabalhos recentes de investigação laboratorial conduziram à clonagem de um novo receptor nuclear denominado WINTER-FARMO (WF), tendo sido identificadas uma série de moléculas capazes de activar este novo factor de transcrição. Uma consulta bibliográfica detalhada permitiu verificar que os ligandos identificados são igualmente conhecidos como sendo indutores do gene student. Na tentativa de identificar o elemento de resposta do factor de transcrição WF no promotor do gene student foram construídos vários recombinantes contendo deleções da região reguladora do gene tendo estes mutantes sido cotransfectados com o vector de expressão do factor WF, em culturas da linha celular COS-1. Na Figura 12 encontram-se representados os níveis de activação dos diferentes mutantes de deleção do gene student pelo factor WF. Xho I BamH I Sph I BamH I Bgl I Kpn I +1 LUC wt Actividade Luc + LUC LUC LUC LUC m1 m2 m3 m Figura 12 - Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células eucariotas da linha COS-1. Co-transfecção de vários recombinantes contendo a região reguladora do gene student, com o vector de expressão do receptor nuclear WF. Luc luciferase; wt - wild type ou selvagem; m mutante.

23 12.1. De acordo com a análise destes resultados indique qual é a região responsável pela activação da transcrição do gene student pelo factor de transcrição WF. Justifique a sua resposta.

24 EXERCÍCIO Nº13 Na Figura 13 está esquematizado o resultado de uma experiência de EMSA. Extractos nucleares preparados a partir de vários tecidos animais foram incubados com o fragmento de restrição da região promotora do gene student que contém o elemento de resposta do factor WF, e que foi marcada radioctivamente com 32 P. De modo a testar a especificidade da ligação foram efectuados ensaios de competição com um excesso molar de competidor que contém a sequência de consenso de ligação do factor WF. Sonda Competidor Extracto nuclear - F F C C I I R R Figura 13 - F: fígado; C: cérebro; I: intestino; R: rim.

25 13.1. O que é que pode concluir analisando esta auto-radiografia? Refira-se especificamente à capacidade de ligação do factor WF nos diferentes tecidos animais Que experiência(s) é que deveria fazer para determinar se o receptor WF se encontra nos complexos formados?

26 EXERCÍCIO Nº14 O gene REGABOFE (RGB) codifica para uma proteína de expressão hepática. A expressão basal do gene é regulada positivamente pelo factor de transcrição SEF (Sempre Em Festa), no entanto ainda não tinha sido identificado o elemento de resposta para este factor. Dados recentes (ver Figura 14.1 A, B e C), vieram não só identificar a região do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF, bem como o tipo de interacções que se estabelecem, a nível da região 5 - adjacente, entre este factor e os receptores nucleares PXR (Paródia X Receptor) e CAR (Comemoração Anual Receptor). A RGB RGB / SV40 CAR/PXRRE GRE EcoRV EcoRI AvrII AvrII SmaI SV40 LUC LUC RGB -1874? -1357/-362 LUC RGB -1874? -250/-114 LUC Figura 14.1 Transactivação do promotor RGB pelos factores de transcrição SEF, PXR e CAR. Co-transfecção de plasmídeos reporter wild-type e mutantes contendo a região 5 - adjacente do gene RGB, com os vectores de expressão que codificam para as formas humanas dos factores de transcrição SEF, CAR e PXR.

27 Analise a Figura 14.1 e responda às seguintes perguntas: Que enzima(s) de restrição foram utilizada para construir o mutante de deleção RGB /-362? Qual a diferença entre os mutantes RGB/SV40 e RGB /- 362? Justifique a sua resposta Qual a região do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF? Justifique a sua resposta.

28 Tendo em conta que o fenobarbital é um activador do receptor CAR e que a rifampicina e o 4-hidroxitamoxifeno são agonistas do receptor PXR, e que ambos os receptores estabelecem interacções proteína-proteína com o receptor SEF, analise as Figuras 14.1 e 14.2, e responda à pergunta seguinte: PB RIF 4OHT DMSO RGB β-actina Figura 14.2 Efeito do tratamento com agonistas dos receptores nucleares PXR e CAR nos níveis de mrna do gene RGB em células HepG2. Análise por RT-PCR do RNA total (20µg) de células HepG2 tratadas durante 24 h com veículo (DMSO), com fenobarbital (PB), com rifampicina (RIF) ou com 4- hidroxitamoxifeno (4OHT), utilizando primers específicos para o RGB e para a β-actina Qual é o efeito da interacção entre os receptores nucleares CAR e PXR e o factor SEF, na regulação da transcrição do gene RGB? Justifique a sua resposta.

29 Uma análise bioinformática identificou um potencial elemento de resposta ao factor SEF na região -362 a +34. Foi efectuado um ensaio de EMSA, para verificar se o factor SEF tinha capacidade de se ligar a esta sequência. Analise a Figura 14.3 e responda às questões seguintes: RGB CYP-152wt EN Competidor Anticorpo anticorpoanti-sef anti-hnf4 Figura 14.3 Caracterização da actividade de ligação de proteínas presentes nos extractos nucleares das células HepG2, ao oligonucleótido RGB-152 wt. Ensaio de EMSA foi efectuado utilizando um oligonucleótido em cadeia dupla marcado radioactivamente que corresponde ao potencial elemento de resposta ao SEF no promotor do gene RGB como sonda (RGB-152 wt). Os ensaios de competição foram efectuados adicionando oligonucleótidos mutados em cadeia dupla não marcados, numa concentração 100 vezes superior à da sonda. O ensaio de supershift foi efectuado utilizando um anticorpo anti-sef.

30 14.5. O factor SEF tem capacidade de se ligar à sonda? Existirão mais proteínas nucleares capazes de se ligarem a esta região? Justifique a sua resposta Qual das mutações (-152mut1 ou -152mut2) introduzidas nos oligonucleotidos competidores impede a ligação das proteínas nucleares à sonda? Justifique a sua resposta.

31 EXERCÍCIO Nº15 Um grupo de investigadores estudou o papel da proteína PXR na regulação da expressão do gene CYP2B6. O CYP2B6 está envolvido no metabolismo de numerosos fármacos, e a sua expressão é induzida por compostos que são ligandos do PXR (por exemplo, rifampicina, fenobarbital e dexametasona). Resultados de estudos anteriores identificaram uma sequência reguladora localizada numa região enhancer, denominada CYP2B6-PBREM. Este módulo regulador contém 2 elementos cis DR4 (NR1 e NR2) que funcionam como sítios de ligação para heterodímeros CAR-RXRα. Os recombinantes contendo o gene repórter Luciferase (Luc) foram preparados inserindo as estruturas oligonucleotídicas (fig A) correspondentes às sequências wild-type e mutadas do CYP2B6-PBREM no vector de expressão pgl3-tk-luc.

32 Fig Regulação do PBREM do CYP2B6 pelo PXR e CAR. (A) Estrutura da sequência reguladora CYP2B6-PBREM. Os elementos DR4 (NR-1 e NR-2) estão assinalados por setas, e as bases mutadas estão em letra minúscula. Ensaios de transactivação dos recombinantes selvagem e mutantes do CYP2B6- PBREM pelo PXR (B) e CAR (C) foram feitos através da transfecção transitória de células HuH7 (hepatoma humano). A activação mediada pelo PXR foi caracterizada pelo tratamento das células transfectadas com rifampicina ou DMSO (veículo) por 24 horas. A capacidade de ligação das proteínas PXR e CAR aos sítios NR1 e NR2 foi avaliada por EMSA (fig.15.2). Fig Ligação das proteínas reguladoras aos elementos de resposta NR1 e NR2. (A) EMSA com sondas oligonucleotídicas de dsdna correspondentes às sequências de ligação NR1 e NR2 (ver Fig.2-A). Nas reacções de binding foram usadas proteínas RXRα, CAR e PXR traduzidas in vitro.

33 15.1. Sabendo que o PXR é um receptor nuclear, diga quais os domínios estruturais que poderão fazer parte desta proteína, e qual o papel desempenhado por eles na regulação da expressão genética.

34 15.2. Com base nos resultados apresentados nas figuras anteriores, responda às perguntas seguintes: a) O PXR é um activador ou um repressor da transcrição do gene CYP2B6? Justifique a sua resposta. b) Qual é a informação mais evidente que retira da análise do resultado do EMSA? Justifique a sua resposta.