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1 Declaração de Conflitos de Interesse Nada a declarar.

2 Diagnóstico laboratorial em oncohematologia I DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS Dr. João Carlos de Campos Guerra Departamento de Patologia Clínica - HIAE Centro de Hematologia de São Paulo - CHSP

3 CLASSIFICAÇÃO REAL / WHO (98) Revised European Classification of Lymphomas and World Health Organization ENTIDADES (LEUCEMIA / LINFOMA) BASEADAS EM DADOS: CLÍNICOS MORFOLÓGICOS SP, MO, BMO, Biópsia de outros tecidos IMUNOLÓGICOS Imunofenotipagem por citometria de fluxo Imunocitoquímica / Imunohistoquímica CITOGENÉTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR) Anormalidades genéticas com valor prognóstico

4 NEOPLASIAS DE CÉLULA B PRECURSORAS: Leuc. / Linf. Linfoblástico de Célula B Precursora PERIFÉRICAS: LLC cel-b / Linf. de Pequenos Linfócitos Leucemia Pró - Linfocítica de Célula B Linfoma linfoplasmocitóide / Imunocitoma Linfoma de células do manto Linfoma de centro folicular / folicular Linf. B da Z. M. / esplênico / extranodal (tipo MALT) / nodal Tricoleucemia ; Plasmocitoma ; Mieloma Múltiplo Linfoma de Grandes Células B Difuso Subtipos: Mediastinal (tímico) e Intravascular Linfoma de Burkitt

5 NEOPLASIAS DE CÉLULA T e NK- T PRECURSORAS : Leucemia / Linfoma Linfoblástico T precursora T e NK PERIFÉRICAS: LLC de célula T e Leucemia Pró -Linfocítica Leucemia de Linfócitos Grandes Granulares Leucemia Tipo célula T e Tipo célula NK Micose Fungóide e Síndrome de Sézary Linfoma de Célula T periférica Não Especificado Doenças Linfoprolif. Cutâneas Prim. Cell T CD30+ Linfoma de Célula T γ/δ Hepatoesplênico Linfoma de Célula T Tipo Paniculite Subcutânea Linfoma de Célula T Angioimunoblástico Linfoma de Célula T Intest.(assoc.ou não a enteropatia) Leucemia/ Linfoma de Células T do Adulto, HTLV1+ Linf.Grandes Células Anaplásico, CD 30+, Tipos T e Nula Linfoma de Grandes Células Anaplásico, Tipo Hodgkin (REAL: provisório)

6 Geração e maturação de células B Pró-B Pré-B B Imatura B Naïve Centroblasto Centrócito Célula do plasma IgM IgM Memória B IgD D H -J H V H -D H J H V L -J L Mutações somáticas Medula óssea Linfonodo Mudança Adpatado de Félix Reyes durante o EHA 2003 em Lyon, França, de Junho

7 Maturação das células B normais e expressão do CD20 Célula TDT Célula pré-pré B CD 19 Célula pré-b Célula pré-b Célula pré-b Célula B B B Célula Célula Plasmó- CD 20 CD 2 CD 21 CD 38

8 Expressão antigênica na linhagem de células-b doentes LLA LLC, LLPC Burkitt, LF, LDGC, TL MW MM ±CD5 CD19 CD20 Célula tronco Pré-B B precoce B Intermediária B- Madura B Plasmacitóide Plasmócito CD22 CD52???

9 Doenças Linfoproliferativas crônicas CITOMETRIA DE FLUXO Determinação da linhagem das células malignas Detecção de clonalidade Análise da maturação celular e heterogeneidade d dentro das populações celulares malignas Avaliação da expressão antigênica

10 LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA LLC-B é a mais comum leucemia nos EUA. Incidência : 27 casos por hab./ano 40% leucemia > 65 anos Ásia e Japão a incidência é mais baixa, sendo inexplicável essa observação. É de 20-30x mais comum na Europa, Austrália e Norte América Os pacientes com LLC comumente tem mais de 50 anos, com idade média de 65 anos. Rara <30 anos % ~ 55 anos Incidência homem/mulher de 2:1, No estadiamento de Raí : Bom prognóstico: score 0, Intermediário :I e II e Pobre prognóstico :III e IV.

11 CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO DA LLC-B Linfocitose periférica > 5.000/mm 3 Linfocitose >30% na medula óssea Imunoglobulina de superfície monoclonal de intensidade baixa comumente IgM e Kappa (62%), Lambda (2%), CD19 (70%), CD20 (71%), HLA-DR (70%). CD19 ou CD20 / CD5 e CD23 (+). Marcadores T: CD3 (24%), CD5 (93%), CD7(28%). Marcador de monócitos: CD14(5%). Resultados negativos para CD10 (Linfoma Folicular) l FMC-7 (LPL), CD25/CD103 (Hairy cell) antígenos de célula T, outros que não CD5 (neoplasia de célula T), CD79B e CD22 Rearranjo gênico de imunoglobulina (+) Estudo citogenético: usualmente normal; trissomia do 12 é relativamente específica.

12 Figura 1: LLC-B (Linfócitos maduros, Sombras celulares de Gun Precht e Prolinfócito)

13 LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA-SP

14 LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA

15 Figura 3: Histogramas característicos da LLC-B: Células linfóides B com restrição de cadeia kappa (baixa expressão) e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ (baixa expressão). 76,9% de células CD19 (+) CD19/Kappa + Kappa de B.Ex CD19/CD5 +

16 Sistema de Escore para diagnóstico i da LLC Marcados 1 ponto 0 ponto SmgI fraca forte CD5 positivo negativo CD23 positivo negativo FMC7 negativo positivo CD22 ou CD79b fraco forte Escores em LLC são geralmente >3, nas outras doenças células B são geralmente <3.

17 Fatores prognósticos em LLC Fator Baixo risco Alto risco Gênero F M Estágio clínico Binet A/Rai 0-1 Binet B/C Rai II/III/IV morfologia típico atípico BMO Não-difusa difusa Tempo de duplicação linfócito > 12 meses < 12 meses Marcadores séricos normais aumentados Expressão CD38 <20-30% > 20-30% citogenética Ausente/del13q Del 11q23 perda/mutação p53 trissomia do 12 e alteração 14q IgVH mutação mutado Não mutado

18 Figura : LLC com anormalidade citogenética: Trissomia do 12 por cariótipo convencional e hibridização in situ por fluorescência (FISH).

19 Figura 2: A Síndrome de Richter (5-10%) é a transformação da LLC em um Linfoma difuso de grandes células. Histologia da medula óssea Infiltrado intersticial e nodular de células linfóides maduras, intermediadas por células hematopoéticas normais. No caso de infiltração difusa maciça associa-se o quadro com um pior prognóstico. A infiltração paratrabecular não é normalmente observada na LLC.

20 LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA LPL pode ser de novo ou secundária a LLC. A definição de LPL: > 55% de prólinfocitos no S.P. LLC/LPL : 10% a 55% LLC < 10% A freqüência de LPL é de 10% em relação as LLCs. Média de idade: 70 anos Presença de esplenomegalia volumosa, raramente hepatomegalia e adenomegalia. Na LPL-T a linfoadenomegalia é vista em 50% dos casos e hepatomegalia em 40%, infiltração de pele em 27% dos pacientes. A meningite leucêmica tem sido relatada, com tratamento intratecal eficaz. É comum a doença em estágio avançado (Raí IV ou Binet C). A média de sobrevida da LPL é de 2 a 3 anos, comparado com 8 anos de LLC. Curso clínico variável. Anemia e trombocitopenia Relacionado com sobrevida curta. Pacientes com LPL-T apresentam média de sobrevida de 7 a 7,5 meses, e raramente sobrevivem por 2 anos.

21 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA 1. Leucometria > /mm 3 2. Prólinfócitos >55% no sangue periférico 3. Em Citometria de Fluxo linfócitos grandes com fluorescência intensa 4. Ig de superfície monoclonal, mais comum IgM - kappa 5. LPL-B: Positivo: CD19,CD20,CD22,FMC-7,HLA-DR,,, e Negativo: TdT,CD10,CD5 (2/3) 6. LPL-T: TdT-,CD2+,CD3+,CD5+,CD7+,CD4+/CD8- (55-64%) CD4+/CD8+ (21-30%), CD4-/CD8+ (10-13%) 7. Rearranjo gênico de imunoglobulina na LPL-B 8. Rearranjo gênico de receptor de célula T na LPL-T 9. Anormalidades citogenéticas: 14q+ para LPL-B, inv(14)(q11q32), 11 t(14;14)(q11;q32) 14)( 11 e trissomia i 8q para LPL-T. 25% do pct t(11;14)(q13;q32) Linfoma do manto- evolução leucêmica nestes pacientes?

22 Figura 6: LPL: O nucléolo único e proeminente é característico do prólinfocito.

23 COMPARAÇÃO ENTRE LLC, LLC/LPL, LPL LLC LLC/LPL LPL Leucócitos (x10 9 ) intermediário >100 Pro linfócitos (%) < >55 Infiltração esplênica infreq. intermediário presente Adenomegalias freq intermediário raro Ig de superfície fraca bifásica intensa CD 5 (+) pres. bifásica <30% FMC-7 (+) <20% <20% presente Anorm.Citogenéticas trissomia 12 trissomia 12 14q+

24 LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRONICA DE LINHAGEM T LLC-T é rara, sendo 1% a 2% das LLC. A Leucemia de células T é um grupo heterogêneo de doenças: - Leucemia/Linfoma a da célula céuat do Adulto (LLTA) - Doença de Linfócitos Grandes Granulares (LGLD) ou também chamada de Doença Linfoproliferativa T- Gamma - Leucemia Prólinfocítica de célula T (LPL-T) O grupo britânico acredita que a LLC-T é uma variante da LPL-T pela similaridade clínica, genética e pela microscopia eletrônica (nucléolo). O grupo da Clínica Mayo classifica junto com a LLC-B pela morfologia. Na classificação Americana/Européia de Linfoma está em estudo e na Organização Mundial da Saúde (WHO) foi excluída, como entidade separada.

25 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LLC-T Linfocitose > 5.000/mm 3 Células leucêmicas: predomínio de linfócitos maduros Linfocitose de medula óssea > 30% Expressão de um ou mais antígenos T: CD2, CD3, CD5, CD7 Fenótipo mais freqüente : CD4(+) Rearranjo gênico: TCR Citogenética: t(14:14)(q11;q32), inv (14;14)(q11;32) TdT e CD1 : negativos

26 Figura 5: LLC-T / LPL-T: Linfócitos pequenos com alta relação N/C, núcleo redondo, nucléolo pequeno ou ausente. Ausência de grânulos no citoplasma.

27 LEUCEMIA DE CÉLULAS CABELUDAS - (HAIRY CELL LEUKEMIA) A incidência de HCL é de 2% do total das leucemias Seu diagnóstico é essencial pela possibilidadae de cura Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e três punções Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e três punções secas. Anemia 85%, trombocitopenia 60-80% e leucopenia 60%

28 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE HAIRY CELL LEUKEMIA 1. Células leucêmicas com projeções citoplasmáticas finas 2. Pancitopenia com monocitopenia 3. TRAP positivo 4. Imunofenótipo Positivo para: CD11c, CD22, CD25, FMC-7 e CD Imunohistoquimica: DBA-44 (+) 2. Imunoglobulina de superfície monoclonal 3. Características histológicas: Medula óssea com aspecto de ovo frito, favo de mel Formação de pseudosinus em baço Lesão angiomatosa em fígado 8. Microscopia Eletrônica : Projeções citoplasmáticas finas e complexo ribossomo-lamela 9. Rearranjo gênico de imunoglobulina

29 Leucemia das Células Cabeludas / Tricoleucemia: Células de hairy cell com as delicadas projeções citoplasmáticas em toda superfície celular.

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32 Análise da Hairy cell Leukemia por Citometria de Fluxo Histograma Volume x Granularidade Histograma CD19 x Granularidade Hairy cell Hairy cell Linfocitos it B Linfocitos B

33 SISTEMA DE ESCORE PARA LLC Diferente do anterior em relação Ao CD22(-) / CD79b = 1 ponto Doença CD5 CD23 CD79b FMC7 sig escores LLC (escore) LPL-B HCL LCM LF LEZM -/w (1) + +/ (1) - -/+ +/- -/+ -/+ -/w (1) (1) +/ W (1) CD79b - parte do receptor de antígeno da célula B; CD22 pode ser usado FMC7 - liga-se a um epitopo na conformação do CD20. CD20 de baixa intensidade na LLC, porém FMC7 é melhor para o sistema de escore Catovsky D. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:

34 LINFOMA E LEUCEMIA DA CÉLULA T DO ADULTO O HTLV-1 pode ser transmitido sexualmente, transfusão sanguínea e aleitamento materno. A transmissão requer a transferência das células infectadas, não se transmitindo o vírus livre. CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS DO ATCL: Presença de anticorpos contra o HTVL - I Fenótipo de células T monoclonais Positivo para CD2, CD3, CD4, CD5 e CD25 Negativo para TdT, CD7, CD8 e CD1 Identificação da presença do genoma pró-viral do HTLV-I por Southern blotting ou PCR Isolamento do vírus HTLV-1 Hipercalcemia

35 Linfoma/Leucemia da Célula T do Adulto: Células polilobuladas (flower cell) com citoplasma fracamente basofílico. A cromatina nuclear é pouco condensada, raramente nucléolos. p, O citoplasma é moderadamente basofílico. Na forma aguda é comum um grande número de linfócitos atípicos no S.P. e as células variam de tamanho e forma. Na forma crônica as células tumorais são uniformes em tamanho, tendo menor porcentual do que a forma aguda.

36 LINFOMA NÃO - HODGKIN gg linfáticos adenomegalia proliferação clonal T, B, cells retics LNH-B são os mais freqüentes sintomas B: 20% dos casos freqüentemente extranodal

37 AGENTES ETIOLÓGICOS Predisposição individual Imunodeficiência ou estimulação Radiações ionizantes / subst tóxicas Infecção viral Alteração citogenética Transplante de órgãos

38 AGENTES INFECCIOSOS ENVOLVIDOS COM OS LNH Burkitt...EBV e MALÁRIA L. T/NK nasal...vírus Epstein-Barr L. MALT gástrico...h.pylori L. / Leucemia cel -T...HTLV-I I( (adulto)

39 DIAGNÓSTICO CLÍNICO Adenomegalia superficial ou Cadeias ganglionares profundas Hepato e esplenomegalia (freq) Tumorações em outros órgãos e tecidos (ossos, pele, glândulas, SNC (extranodais)

40 DIAGNÓSTICO CLÍNICO Fraqueza, febre Emagrecimento e palidez Hemorragias não são freqüentes tumoral em ossos e nervos sintomas neurológicos Infiltração do tecido cutâneo

41 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL HEMOGRAMA Citopenias: I.M.O. Leucocitose (LLBDD ~ LLC) Grandes células (leucossarcoma) BIÓPSIA GG Do o maior ao gângliog Cervical e axilar Inguinal só se bem patológico MIELOGRAMA Pode ser normal Freqüente q infiltração BIÓPSIA M.O. Células agrupadas (como nódulos normais) Infiltração pode ser de forma difusa no parênquima medular

42 IMUNOFENOTIPAGEM Citometria de Fluxo: SP,MO,gg Clone de células B: CD10, CD19, CD20,CD22, CD23 Clone de células T: CD2, CD3, CD5,CD7, CD7 CD4, CD8

43 TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICAS neoplasias de célula B NEOPLASIA Transloc. Gene Envolv. Conseq. Burkitt t(8;14) c-myc e IgH ativç c-myc MALT t(11;18) AP12 e mlt apoptose t(1;14) bcl-10 + agressiva FOLICULAR t(14;18) IgH e bcl-2 ativç bcl-2 MANTO t(11;14) bcl-1 e IgH ativç bcl-1/cicld1 Gds Cells B Dif. t(3;14) bl6 bcl-6 Dça extranod. Melhor prog.

44 TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICAS neoplasias de célula T NEOPLASIA transloc. Gene Envolv. Conseq. L.linfoblástico t(1;14) tal-1/scl transcrição e a-tcr hematopoiética LGC. Anaplásico t(2;5) ALK e NPM formação de tirosina-quinase NPM-ALK híbrida

45 ESTADIAMENTO CLÍNICO Tratamento, prognóstico, comparação Hemograma, DHL, ß2-microglobulina li Sorologias: HTLV I e II, EBV, HIV B.M.O., biópsia ganglionar Diagnósticos por imagem Cintilografia com Gálio

46 ESTADIAMENTO CLÍNICO DE ANN ARBOR I: 1 região nodal (R.N.):(I); ou de 1 órgão ou local extra-nodal (EN): (I E ). II: 2 R.N., mesmo lado do diafragma (II) ou envolv. localizado de 1 órgão ou local E.N. e 1 ou + R.N. do mesmo lado do diafragma (II E ) III: envolv. R.N. em ambos os lados do diafragma (III) que se podem acompanhar de lesão no baço (III S ), de local E.N. (III E ) ou ambos (III SE ). IV: doença disseminada i d em um ou mais órgãos ou tecidos E.N., com ou sem de gg linfáticos.

47 Índice Prognóstico Internacional A. Pacientes de todas as idades Risco Relativo IDADE < 60 anos x > 60 anos 1.96 DHL < normal x > normal 1.85 Estado Clínico 0.1 x Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 1.47 Envolvimento extra-nodal <1sítio x > B. Pacientes com menos de 60 anos Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV 2.17 DHL < normal x > normal 1.95 Estado Clínico 0.1 x

48 CLASSIFICAÇÃO DOS LNH Baseada na biópsia tecidual Características imunológicas Características citogenéticas - moleculares

49 Freqüência dos LNH LGCBD 30,6% FOLICULAR 22,1% Células B Z. Marginal, MALT 7,6% Células T Periféricas 70% 7,0% Pequenos Linfócitos B 6,7% Célula do Manto 6,0% LGCB do mediastino 2,4% Linfoblástico de cél T Precurs. 1,7% llinfoplasmocitóide l itóid 12% 1,2% Burkitt, Micose Fungóide < 1% Outros tipos 61% 6,1%

50 LINFOMA DE GRANDES CÉLULAS B DIFUSO

51 LGCB CÉLULAS NÃO CLIVADAS

52 LGCBD

53 LINFOMA DE GRANDES CÉLULAS B - SP

54 LINFOMA FOLICULAR, difuso de pequenas células clivadas Adultos com idade superior a 50 anos IFT: CD20+,CD10 +/-, CD23+/-, CD43-, CD5-, ciclina D1- EUA: 40% de todos os linfomas > representante dos indolentes: 70% Kiel: Centrocícito-Centroblástico Padrão de crescimento folicular OMS: I e II (peq. e grandes células)

55 LINFOMA FOLICULAR A estrutura folicular neoplásica contém células dendríticas.

56 LINFOMA FOLICULAR

57 LINFOMA FOLICULAR

58 LINFOMA FOLICULAR PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

59 LINFOMA FOLICULAR

60 Prevalência do rearranjo do gene bcl-2 em LNH L F L de grandes células Le Beau MM. Semin Oncol. 1990;17:20-29 Longo DL, DeVita VT Jr, et al. Cancer Principies & Practice of Oncology. 1993

61 Coloração Bcl-2 Negativo Positivo

62 LNH FOLICULAR DE PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

63 LNH FOLICULAR DE PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS

64 LNH DE PEQUENAS E GRANDES CÉLULAS B

65 LINFOMAS MALT : Associados às mucosas Podem acometer todo o TGI Tireóide Aparelho respiratório e uro-genital De baixo ou alto grau Sempre de linfócitos it B Bom prognóstico (demoram diversos anos para infiltrar outros órgãos)

66 CD 20 + Linfoma MALT Ocular

67 Linfoma MALT Gástrico

68 LINFOMA DE PEQUENAS CÉLULAS DIFUSO

69 LINFOMA LINFOBLÁSTICO Núcleo redondo ou oval e cromatina fina e dispersa. Os nucléolos apresentam-se de 1 à 3 e há pouco citoplasma.

70 LINFOMA LINFOBLÁSTICO - T PADRÃO CELULAR CONVOLUTO

71 LINFOMA DE BURKITT LNH-B de alto grau Relacionado ao EBV Raramente tem início em linfonodos Mitoses abundantes / Padrão celular de céu estrelado Imuno-histoquímica com anticorpo anti EBV mostrando moderada imunorreatividade nuclear

72 LINFOMA DE BURKITT Linfoblastos com membrana nuclear proeminente e macrófagos dando aspecto de céu estrelado.

73 LINFOMA CENTROCÍTICO - CENTROBLÁSTICO LNH mais freqüente LNH-B, de baixo grau Acomete preferencialmente idosos Padrão folicular e/ou difuso Mitoses raras Duas populações linfocitárias

74 LINFOMA CENTROCÍTICO - CENTROBLÁSTICO PEQUENAS E GRANDES CÉLULAS

75 MICOSE FUNGÓIDE LNH cutâneo de células T CD4+ LNH de baixo grau (mitoses raras) Relacionada com o HTLV I e II Leucemização: 25% (S.de Sézary) Padrão difuso de infiltração da derme e epiderme por linfócitos it com núcleo convoluto,cerebriforme

76 Micose Fungóide / Síndrome de Sézary: Núcleo cerebriforme com alta relação N/C. Imunofenótipo As células de Sézary são positivas para CD2, CD3, CD4 e CD5 e As células de Sézary são positivas para CD2, CD3, CD4 e CD5 e caracteristicamente negativas para CD7, CD8, CD1 e TdT.

77 LINFOMA HISTIOCÍTICO Células neoplásicas grandes, com núcleos redondos ou ovais com citoplasma abundante.

78 Linfoma Imunoblástico

79 LINFOMAS DE BAIXO GRAU Evolução lenta, apesar do tto Índice mitótico baixo Sem RC, mesmo com tto precoce e adequado Tratamento: prolongamento e melhoria da qualidade de vida

80 LINFOMAS DE ALTO GRAU Evolução rápida sem tratamento (meses) Índice mitótico alto Bom prognóstico com tto precoce e adequado TTO-alvo: células em proliferação RC ( cura ): cura): pode ser alcançada

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