A Electroforese Capilar num

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1 A Electroforese Capilar num Laboratório rio de Genética Instituto de Genética Médica M Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Luís Mesquita

2 A Electroforese Capilar num Laboratório rio de Genética

3 Objectivos: A Electroforese Capilar num Laboratório rio de Genética Conhecer os princípios pios laboratoriais da electroforese capilar. Descrever a técnica t de Sequenciação pelo método m de Sanger - Técnica - Análise - Aplicações - Outras metodologias de sequenciação Descrever a técnica t de Análise de fragmentos - Técnica - Aplicações

4 Princípios laboratoriais da electroforese capilar ELECTROFORESE CAPILAR Electroforese é separação de partículas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. O capilar é o suporte sólido, s com 25 a 100µm m de diâmetro interno, que contém m a fase estacionária (polímero) A separação depende: - Tempo de migração - Temperatura - Força a iónica i do tampão - Intensidade do campo eléctrico - Viscosidade do meio

5 Princípios laboratoriais da electroforese capilar Os ácidos nucleicos migram para o ânodo porque a ph neutro têm carga negativa. A velocidade de migração é inversamente proporcional ao tamanho dos fragmentos gerados.

6 Sequenciação pelo método m de Sanger: : TécnicaT Terminadores: ddntp ddntp marcados fluorimetricamente onde na posição 3 3 da desoxirribose um grupo OH é substituído por um H, impossibilitando o formação de uma ligação fosfodiester e a continuação da reacção de polimerização. ddctp

7 Sequenciação pelo método m de Sanger: : TécnicaT 1 -Fazendo uma reacção para cada terminador Direcção da migração na electroforese - 1 A C G T Uma só reacção com os 4 terminadores marcados com diferentes fluorocromos

8 Sequenciação pelo método m de Sanger: : TécnicaT

9 Sequenciação pelo método m de Sanger: : TécnicaT Amplificação da sequência alvo por PCR Purificação do produto PCR Eliminação de primers Eliminação de sais Protocolo de sequenciação Purificação da PCR de sequenciação Eliminação de primers Eliminação de terminadores (ddntps)) não incorporados Electroforese capilar Interpretação dos dados

10 Sequenciação pelo método m de Sanger: : TécnicaT Após s a amplificação da sequência alvo por PCR Controlo da amplificação com electroforese em gel de agarose a 2 3% Purificação Isolar a banda

11 Sequenciação pelo método m de Sanger: Técnica Protocolo de sequenciação Adequar a quantidade de produto PCR ao nº n de pb Isolar bandas se necessário Purificação

12 Sequenciação pelo método m de Sanger: : Técnica T Protocolo de sequenciação Protocolos de sequenciação Protocolo normal: Produtos PCR Plasmídeos Sequências difíceis: Estruturas secundárias shrna Conteúdo em G e C Regiões homopoliméricas Regiões repetitivas Normal 96º 96º 1min 10seg 50º 5seg 25x Sequências difíceis 98º 98º 1min 25seg 50º 10seg 35x 60º 4min 60º 4min - PCR enhancer: DMSO a 5% - Terminadores: Aumento

13 Sequenciação pelo método m de Sanger: : Análise computacional dos resultados Raw data

14 Sequenciação ão: : Análise computacional dos resultados Sequenciação de um plasmídeo

15 Sequenciação ão: : Análise computacional dos resultados Correcção dos dados obtidos - Sequencing analysis (AppBio) Gerar uma sequencia consenso, entre a sequencia F e R. - SeqScape (AppBio) - NCBI (alinhamento de 2 seq) - Outros softwares

16 Sequenciação ão: : Análise computacional dos resultados Comparar a sequência obtida, com outras publicadas NCBI Blast Manual SeqScape (AppBio) Links to other GenBank pages showing matching accessions. Links to subsequent sections on the current results page.

17 Sequenciação ão: : Análise manual dos resultados

18 Sequenciação pelo método m de Sanger: : Análise computacional dos resultados Formato GenBank Formatos (Sequencing( file formats) - Uma sequência no formato GenBank pode conter várias sequências. - Uma sequência no formato GenBank começa com uma linha contendo a palavra LOCUS. - O início da sequência, está marcado com a palavra "ORIGIN" - O fim da sequência está marcado está marcado com duas barras "//. - Tem 60 nucleotidos por linha em grupos de 10. Exemplo: LOCUS AB bp mrna linear PRI 05-FEB-1999 DEFINITION Homo sapiens mrna for prepro cortistatin like peptide, complete cds. ACCESSION AB ORIGIN 1 acaagatgcc attgtccccc ggcctcctgc tgctgctgct ctccggggcc acggccaccg 61 ctgccctgcc cctggagggt ggccccaccg gccgagacag cgagcatatg caggaagcgg 121 caggaataag gaaaagcagc ctcctgactt tcctcgcttg gtggtttgag tggacctccc 181 aggccagtgc cgggcccctc ataggagagg aagctcggga ggtggccagg cggcaggaag 241 gcgcaccccc ccagcaatcc gcgcgccggg acagaatgcc ctgcaggaac ttcttctgga 301 agaccttctc ctcctgcaaa taaaacctca cccatgaatg ctcacgcaag tttaattaca 361 gacctgaa //

19 Sequenciação pelo método m de Sanger: : Análise computacional dos resultados Formatos (Sequencing( file formats) Formato FASTA - Uma sequência no formato FASTA pode conter várias sequências. - Cada sequência começa, com uma linha descritiva e dados informativos. - O formato FASTA começa sempre com o sinal ">" na primeira coluna. Exemplo: >AB acc=ab descr=homo sapiens mrna for prepro cortistatin like peptide, complete cds. len=368 ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCC CCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGC CTCCTGACTTTCCTCGCTTGGTGGTTTGAGTGGACCTCCCAGGCCAGTGCCGGGCCCCTCATAGGAGAGG AAGCTCGGGAGGTGGCCAGGCGGCAGGAAGGCGCACCCCCCCAGCAATCCGCGCGCCGGGACAGAATGCC CTGCAGGAACTTCTTCTGGAAGACCTTCTCCTCCTGCAAATAAAACCTCACCCATGAATGCTCACGCAAG TTTAATTACAGACCTGAA

20 Sequenciação ão: : Aplicações - Sequenciação do genoma humano; - Sequenciação de outros genomas com aplicação na biologia, filogenia, alimentação, zootécnia e outros. - Controlo de PCR, RFLPs, etc (confirmação de outras metodologias) - Identificação de microorganismos (vírus, bactérias e fungos) É o único método que descreve a sequência nucleotídica completa

21 Sequenciação ão: : Aplicações - Farmacogenética (NAT2 e a acetilação da Isoniazida,, resistência a antiretrovirais na SIDA) - Tipagem HLA de alta resolução para transplantes - Pesquisa de mutações em DNA de doentes/possíveis portadores - particularmente útil nas situações heterogeneidade alélica lica (BRCA1/2; HNPCC, ; HNPCC, ) monogénicas nicas com - Identificação de mutações em tumores: para avaliação prognóstica e selecção terapêutica (ex( ex: : mutações do EGFR e kras e cancro do pulmão) - Identificação de alterações epigenéticas ticas: : metilação das regiões promotoras

22 Sequenciação ão: : Aplicações Metilação - Metilação de C em resíduos CpG nas regiões promotoras - Silenciamento transcricional - Conversão da citosina metiladas a uracil com bissulfito Antes do bisulfito Após bisulfito

23 Sequenciação ão: : Outros métodos m de sequenciação Outros métodos de sequenciação: - Maxam Gilbert Life Sciences/Roche - Illumina - Solid/Applied Biosystems Massively parallel sequencing

24 Análise de fragmentos: TécnicaT Gerar produtos marcados fluorimetricamente PCR de amplificação, com um dos primers marcados. Sondas específicas para a região em estudo.

25 Análise de fragmentos: Aplicações Rastreio de mutações Análise de STRs (Short Tandem Repeats) Pesquisa de Indels (Insertions/Delections) Multiplex Ligantion-dependent Probe Amplification (MLPA) Estudo de RNA de proteínas inflamatórias Cancro hereditário rio Farmacogenómica mica Cromossomopatias; OLA (Oligonucleotide( Ligation Assay)

26 Análise de fragmentos: Aplicações Métodos de rastreio de mutações Indicações: heterogeneidade alélica lica e genética Análise conformacional HA-CAE (Heteroduplex( analysis-capillary array electrophoresis) SSCP (Single( strand conformation polymorphism etc Desvantagens: - nº de amostras muito grande - Polímero Conformation Analysis Polymer (CAP)

27 Análise de fragmentos: Aplicações Métodos de rastreio de mutações Cancro hereditário da mama Normal PCR Fragmentos génicos correspondentes aos exões Métodos de rastreio: DGGE, SSCP, HA-CAE Para identificar o segmento suspeito Sequenciação do segmento suspeito

28 Métodos de rastreio de mutações: HA-CAE Seq. normais Identificação de um perfil de migração anómalo

29 Métodos de rastreio de mutações: SSCP Método mais usado

30 Análise de fragmentos: Aplicações Caracterização de STRs...AGCATTATCC primer GTA GTA GTA ACTGTTA... primer (GTA)n, n=3...agcattatcc primer GTA GTA GTA GTA GTA ACTGTTA... primer (GTA)n, n=5 PCR com um primer marcado Electroforese capilar em condições desnaturantes: - Diluição da amostra em água - Diluição da amostra em formamida - Desnaturação 96ºC 3min - 4ºC sobre gêlo 3min

31 Análise de fragmentos: Caracterização de STRs (TTTA)n 266 pb + nx4 STRs (Short Tandem Repeats) CYP19 (TTTA)n (intrão 4) identificado por electroforese capilar, em sequenciador automático, tico, de produtos de PCR obtidos utilizando o primer proximal marcado com 6FAM. Amostra de heterozigoto,, sendo visíveis veis a azul dois picos de 302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repetições, respectivamente. Utilizou-se o marcador de peso molecular 500 LIZ (picos a laranja). Sequenciação que confirma a existência de 12 repetições TTTA correspondendo a um fragmento de 314pb de um indivíduo duo homozigoto.

32 Análise de fragmentos: STRs Aplicações Estudos de associação Medicina Forense Controlo de transplantes medulares Controlo de linhas celulares Identifiler

33 Análise de fragmentos: Pesquisa de Indels Aplicação: Pesquisa de delecções (9 a 24pb) do exão 19 do EGFR em carcinoma epidermóide do pulmão Tecido tumoral del15 pb Tecido normal

34 Análise de fragmentos: Pesquisa de Indels Delecções no exão 19 do EGFR de NSCLCs sensíveis aos ITKs, gefitinib ou erlotinib Pao W et al. PNAS 2004;101:

35 Análise de fragmentos: MLPA Estudo quantitativo do nº n de cópias c múltiplas sequências (DNA ou RNA) em simultâneo Baseia-se na utilização de sondas específicas para cada sequência, com prolongamentos comuns a todas as sondas, desenhados de modo a criar sequências de dimensões diferentes; Os primers são universais e vão ligar-se aos prolongamentos das sondas As sequências são identificadas pelo seu comprimento específico; A intensidade do sinal vai ser proporcional ao nº n de cópias c da sequência alvo

36 Análise de fragmentos: MLPA /cdna Electroforese capilar em condições desnaturantes: - Diluição da amostra em formamida - Desnaturação 96ºC 3min - 4ºC sobre gêlo 3min

37 Análise de fragmentos: MLPA Aplicações Estudo de expressão génica (RNA) ex: : proteínas inflamatórias Identificação de delecções e duplicações em genes responsáveis por doenças hereditárias rias ex: : cancro da mama hereditário, rio, neurofibromatose; - Identificação de delecções metabolismo ex: farmacogenómica mica e duplicações em genes de Identificação de delecções e duplicações cromossómicas micas ex. atraso mental de causa desconhecida

38 Análise de fragmentos: MLPA Reacção multiplex: - cdna de 45 proteínas inflamatórias

39 Análise de fragmentos MLPA: aplicação ao cancro da mama hereditário rio Análise do BRCA1 por MLPA A diminuição da altura dos picos identifica delecções

40 Análise de fragmentos : MLPA Diagnóstico de microdeleção de novo em 1p Com sonda marcada e primers específicos de sequências de regiões subteloméricas de vários cromossomas

41 Análise de fragmentos: Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)

42 Determinação das 31 mutações mais frequentes do gene CFTR, presentes na mucoviscidose,, por OLA Mutação em heterozigotia em local de splicing É realizada uma PCR multiplex a que se segue a ligação de sondas. As sondas são desenhadas de modo a que as sequências mutadas e não mutadas se distingam por diferentes comprimentos e diferentes fluorescências.

43 A Electroforese Capilar num Laboratório rio de Genética Objectivos: Analisar electroferogramas Identificar mutações

44 Analisar electroferogramas Troubleshooting Dyeblobs Regiões difíceis

45 Analisar electroferogramas Troubleshooting Pouca descriminação perto dos primers Múltipla ligação de primer

46 Analisar electroferogramas Troubleshooting Pouco DNA, DNAses, primer ineficaz

47 Analisar electroferogramas Sobreposição de múltiplos picos: dois produtos PCR não detectáveis em gel de agarose a 1,5%

48 Identificar mutações: Casos práticos NAT2 Genotipagem DNA NAT2 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase) Genebank accession: NT_ tacctataat tagtcacacg aggaaatcaa atgctaaagt atgatatgtt tttatgtttt gtttttcttg cttag[gggat catggacatt gaagcatatt ttgaaagaat tggctataag aactctagga acaaattgga cttggaaaca ttaactgaca ttcttgagca ccagatccgg gctgttccct ttgagaacct taacatgcat tgtgggcaag ccatggagtt gggcttagag gctatttttg atcacattgt aagaagaaac cggggtgggt ggtgtctcca ggtcaatcaa cttctgtact gggctctgac cacaatcggt tttcagacca caatgttagg agggtatttt tacatccctc cagttaacaa atacagcact ggcatggttc accttctcct gcaggtgacc attgacggca ggaattacat tgtcgatgct gggtctggaa gctcctccca gatgtggcag cctctagaat taatttctgg gaaggatcag cctcaggtgc cttgcatttt ctgcttgaca gaagagagag gaatctggta cctggaccaa atcaggagag agcagtatat tacaaacaaa gaatttctta attctcatct cctgccaaag aagaaacacc aaaaaatata cttatttacg cttgaacctc gaacaattga agattttgag tctatgaata catacctgca gacgtctcca acatcttcat ttataaccac atcattttgt tccttgcaga ccccagaagg ggtttactgt ttggtgggct tcatcctcac ctatagaaaa ttcaattata aagacaatac agatctggtc gagtttaaaa ctctcactga ggaagaggtt gaagaagtgc tgaaaaatat atttaagatt tccttgggga gaaatctcgt gcccaaacct ggtgatggat cccttactat ttagaataag gaacaaaata aacccttgtg tatgtatcac ccaactcact aattatcaac ttatgtgcta tcagatatcc tctctaccct cacgttattt tgaagaaaat cctaaacatc aaatactttc atccataaaa atgtcagcat ttattaaaaa acaataactt tttaaagaaa cataaggaca cattttcaaa ttaataaaaa taaaggcatt ttaaggatgg cctgtgatta tcttgggaag cagagtgatt catgctagaa aacatttaat attgatttat gttgaattc] Segmento 1 Segmento 2 111T>C 191G>A 282C>T 341T>C 434A>C 481C>T 590G>A 803A>G 845A>C 857G>A Base nº 1 [DNA=RNA]

49 Identificar mutações: Casos práticos Polimorfismo/Mutação em homozigotia

50 DUPLICADO Sequenciação - casos práticos Polimorfismo/Mutação em heterozigotia

51 Identificar mutações: Casos práticos Wild-type aaaatt cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga Escreva qual o alelo mutado.

52 Identificar mutações: Casos práticos Del15pb Mutant aaaatt cccgtcgcta tcaagacatctccga

53 Identificar mutações: Casos práticos Wild type aatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat Escreva qual o alelo mutado.

54 Identificar mutações: Casos práticos c.2231_2259dup20. Frameshift Mutant aatgcacctggttcttttactatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat

55 Identificar mutações: Casos práticos Wild-type agaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgtatgaaaata attcaaacag tactatagct Escreva qual o alelo mutado.

56 Identificar mutações: Casos práticos c.5374_5377deltatg. Frameshift Mutant agaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgaaaata attcaaacag tactatagct

57 Identificar mutações: Casos práticos Como classifica a mutação? BRCA2 - c.2624a>g. p.k1132k. Wild type: ttt gaa ttt act cag ttt aga aaa cca agc tac ata ttg cag aag agt F E F T Q F R K P S Y I L Q K S Mutada: ttt gaa ttt act cag ttt aga aag cca agc tac ata ttg cag aag agt F E F T Q F R K P S Y I L Q K S

58 Mutação em local de splicing no gene LCA5 associada à amaurose congénita nita de Leber Doente Pai saudável Causa frequente de défice visual grave congénito. Situação monogénica com heterogeneidade genética, com mutações descritas em mais de 13 genes. Qual é a mutação? A doença é dominante ou recessiva? A mutação localiza-se na última base do exão 6. Como poderemos verificar se interfere com o splicing?

59 RT-PCR para caracterização do mrna (continuação) Exão 6 Exão 7 Exão 6 Exão 7 A sequenciação do produto de RT-PCR mostrou que a mutação levou à utilização de um segundo local de splicing, localizado no intrão 6, do que resultou a inserção de 5 bases (GTATG) do intrão 6, efeito de frameshift e a criação de um codão stop prematuro.