Gene é um segmento de DNA que contém informações para codificar uma ou mais funções

Transcrição

1 Gene é um segmento de DNA que contém informações para codificar uma ou mais funções

2 Espécie Espécie = mesma carga genética

3 Biodiversidade espécies Ecossistema várias espécies vivendo em um mesmo lugar Energia flui de um ecossistema para outro Há uma perda de a sp/ano Muitos de nossos medicamentos provém de ecossistemas

4 Engenharia genética Tecnologia do DNA recombinante produzindo novos organismos, ou seja, organismos geneticamente modificados Pode sre realizada de várias maneiras como Inserindo um gene de uma espécie em outra, criandose um organismo transgênico Alterando um gene existente Modificar a expressão de um determinado gene

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6 Descoberta da estrutura química do DNA Watson & Crick

7 DNA Se todos ACGT substituíssem números e nomes de listas telefônicas de SP teríamos 140

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9 Ectoderma (Camada externa) Gástrula Céls. germinativas Zigoto Blastocisto Mesoderma (Camada média) Endoderma (Camada interna)

10 Músculo liso Estômago Tecido conjuntivo Tecido nervoso Sangue Epitélio

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15 Nucleotídeo = base + açúcar + fosfato

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17 Transcrição Transcrição Tradução Tradução

18 Passos da engenharia genética 1. Isolar o gene 2. Inserir o gene em um hospedeiro - vetor 3. Produzir o máximo de cópias possíveis 4. Separar e purificar o produto do gene

19 Extração do DNA genômico

20 Cuidados Cuidados comparáveis aos utilizados no trabalho com patógenos. Risco é a contaminação do DNA (amostra) e não do operador (pesquisador). Ambiente limpo, DNA-free

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22 Área física: 1) Preparação das amostras (extração RNA e DNA) 2) Sala de pré-pcr (preparação do mix da reação) 3) Pós- PCR (eletroforese)

23 Descontaminação de superfícies (luz ultravioleta-uv) Ação limitada. Não destrói todos os contaminantes (ação reduzida se o DNA for menor que 300 pb).

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33 DNA - BANANAS Material - 1 banana - 2 copos - Banho-maria (60ºC) - Água destilada - Sal de cozinha - Detergente para louça - Álcool etílico a 95% gelado (-10ºC) - Bastão fino de vidro - Filtro de papel e gelo moído

34 Procedimento Corte e amasse a banana. Coloque 4 colheres (sopa) de detergente e 1 (chá) de sal em meio copo de água. Mexa até a total dissolução, depois adicione a banana e leve em banho-maria por cerca de 15 minutos. Retire a mistura do banho-maria e resfrie-a rapidamente, colocando o copo no gelo durante cerca de 5 minutos. Coe a mistura, adicione ao filtrado cerca de meio copo de álcool gelado, deixando-o escorrer vagarosamente pela borda. Observe o que ocorre até aqui e anote. Em seguida, com o bastão de vidro, faça movimentos circulares misturando as fases. Observe o resultado final.

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36 DNA Genômico

37 PCR

38 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.

39 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA

40 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

41 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

42 Taq DNA polimerase O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

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45 Taq DNA polimerase Termoestabilidade limitada Temperatura T 1/2 (minuto) 92,5 o C ,0 o C 40 97,5 o C 5

46 Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95 C. Taq DNA polimerase Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nm de dntp em cerca de 30 min a 72 C. Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U (0,5 l) de enzima em volume final de 100 l. É importante deixar claro que o excesso de enzima também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibila.

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48 Seqüências dos primers Os primers (forward e reverse) devem ser construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.

49 Problemas comuns no Desenho de Primers Auto-complementariedade Complementariedade entre primers

50 Auto Complementariedade Formação de alça GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT HO TGACTTC ACTGAA T m = 71 o C

51 Complementariedade entre Primers Formação de primer dimer 5 GAACTACCATAGACACACTGAAGG OH 3 5 CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGT OH 3 3 OH TGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC GAACTACCATAGACACACTGAAGG OH 3

52 Desoxinucleotídios trifosfatados (dntp) São as bases nitrogenadas que constituirão as novas cadeias de DNA. Sua concentração numa reação pode variar de 20 a 200 um sendo importante que as quatro devam variar em concentrações equivalentes. Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou todos) podem ocorrer erros de incorporação de bases, gerando cópias alteradas

53 Íon magnésio O íon magnésio (Mg ++ ) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase. Sua concentração em torno de 1,5 mm é aplicável a maioria das necessidades. - Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto - Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou smear.

54 Smear

55 PCR Requerimentos Cloreto de Magnésio:.5-2.5mM Tampão: ph dntps: µM Primers: µM DNA Polimerase: units DNA Alvo: 1 µg

56 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)

57 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC DENATURAÇÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)

58 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC 57ºC DENATURAÇÃOANELAMENTO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)

59 ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC 57ºC 72ºC DENATURAÇÃOANELAMENTO EXTENSÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) (35) CICLOS

60 Enzimas de restrição Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

61 Isolar o gene

62 Tesouras moleculares

63 Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

64 94ºC DENATURAÇÃO

65 57ºC Primer forward Primer reverse NELAMENTO

66 72ºC Taq DNA polimerase EXTENSÃO

67 Temperatura média (Tm) de Anelamento Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C e G, de modo que quanto maior for o Ponte de Hidrogênio número dessas bases, a temperatura de hibridização tende a fosfato pentose aumentar. Citosina Guanina Timidina Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios Adenina contendo 50 a 60% de G + C são adequados. Para se calcular a TM (temperatura média de hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplicase a seguinte formula: 4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM

68 Tempo de extensão dos primers Esse fator depende do comprimento do segmento a ser amplificado e da concentração DNA molde utilizado na reação. do A temperatura ótima de extensão dos primers é de 72 C (temperatura ótima de atividade da polimerase) e o tempo de extensão de 1 minuto é considerado suficiente para estender produtos de aproximadamente pb (em condições ideais).

69 Tempo e temperatura de denaturação As condições de desnaturação utilizadas normalmente são de 95 C por 5 minutos (desnaturação inicial) e por 30 segundos (desnaturação na ciclagem), sendo que temperaturas mais altas podem ser utilizadas quando se trabalha com seqüências moldes ricas em G+C. Temperaturas muito altas e tempos longos de desnaturação levam a perda de atividade da enzima

70 Amplificação de DNA (exponencial) Linear Plateau Gel EtBr Log [DNA] Geométrica X ciclos y = 2 X

71 Amplificação de DNA (Platô)

72 Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000

73 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados

74 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador

75 Reação de PCR + Tampão Corado Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador

76 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Termociclador Reação de PCR + Tampão Corado Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo

77 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análise dos dados Luz Ultraviolet Fotodocumentação Termociclador Reação de PCR + Tampão Corado Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo

78 Eletroforese em gel de agarose

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82 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2% REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO COM LUZ ULTRAVIOLETA

83 Visualização do DNA em luz ultravioleta

84 FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb Marcador de pares de base

85 FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb Marcador de pares de base TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE DNA AMPLIFICADOS

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87 Variações da técnica de PCR - Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm, construindo cópias complementares de DNA (cdna). - Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação de carga viral. - Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).

88 Aplicações do PCR A alta sensibilidade do método de PCR, bem como a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para a pesquisa básica mas também para a pesquisa aplicada.

89 Aplicações do PCR Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicações: 1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho. 2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

90 Aplicações do PCR 3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas). 4. Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo para HLA). 5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças. 6. Na medicina forense (DNA fingerprint). 7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos

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92 Transciptase reversa Transcriptase reversa mrna - cdna Banda complementar utilizando DNA polimerase Vantagem: mais mrna na célula do que DNA

93 SEQUENCIAMENTO DO DNA

94 AF GACAACGGTTTC TGCTCACCCAAGATA CTCCGATGTGCTCCT GAACCAGATGCTTTT AATCCCTGTGAAGAT ATTATGGGCTATAA CTTCCTTAGGGTACT GATTTGGCTGATTAA TATCCTAGCCATCGT GGGAAATGTGACTGT TCTCTTTGTTCTCCT GACTAGTCGTTATAA ACTGACAGTACCCCG TTTTCTCATGTGCAA TCTCTCTTTTGCAGA CTTTTGCATGGGGCT CTATCTGCTGCTCAT TGCCTCAGTTGATTC CCAAACCAAAGGCCA GTATTATAACCATGC CATAGACTGGCAGAC AGGGAGTGGGTGTAG TGCAGCTGGCTTTTT CACTGTATTTTCAAG TGAGCTTTCTGTCTA CACCCTCACAGTCAT CACACTAGAAAGATG GCACACCATCACCTA TGCTCTTCAGCTGGA CCAAAAGCTGCGTTT AAGACATGCCATTCC AATTATGCTTGGGGG ATGGCTCTTTTCCAC TCTTATCGCCATGTT GCCCCTTGTGGGTGT CAGCAATTACATGAA AGTCAGCATTTGCCT CCCCATGGATGTAGA AACCACTCTCTCACA AGTATACATATTAAC CATCCTGATACTCAA TGTGGTGGCCTTCAT CATCATTTGTGCTTG CTACATTAAAATTTA TTTTGCAGTTCAAAA TCCAGAGCTGATGGC TACCAACAAAGATAC AAAGATTGCTAAGAA AATGGCGGTCCTTAT CTTCACTGATTTCAC CTGCATGGCACCAAT CTCTTTTTTTGCCAT CTCAGCTGCCTTCAA AATGCCCCTCATCA CAGTAACCAACTCT AAAGTTTTACTGGTT CTTTTTTATCCTGTC AATTCTTGTGCCAAT CCATTTCTGTATGCT

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96 Enzimas de restrição Escaneiam o DNA Encontram sequência de nucleotídeos Fazem um corte específico

97 A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita: BamHI - reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

98 Nomenclatura BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 5 G/GATCC 3 EcoRI - Escherichia coli R 5 G/AATTC 3 HaeIII - Haemophilus aegyptius 5 GG/CC 3 PstI - Providencia stuartii 5 CTGCA/G 3

99 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

100 5 TGACGGGTTCGAGGCCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5 5 TGACGGGTTCGAGG CCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5

101 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5

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103 Inserir o gene em um vetor Vetor Molécula de DNA que é utilizada para carrear o gene na célula hospedeira

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106 Inserindo o vetor no hospedeiro

107 Replica plating

108 Multiplicação das células hospedeiras Larga escala São todas geneticamente iguais por causa da reprodução assexuada

109 Extração do produto desejado

110 Técnica do DNA Recombinante Manipulação do genoma para produção de uma característica desejável

111 Conteúdo 1. DNA recombinante 2. Enzimas de restrição 3. Vetores de clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de clonagem molecular 5. Aplicações

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114 TIPOS DE VETORES

115 Vetores TIPOS DE VETORES Hospedeiros Utilização Plasmídeos Cosmídeos Bactérias / leveduras clonagem Bacteriófagos

116 VETORES PLASMIDIAIS Plasmídios Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras puc18 pbr322 pup310

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118 VETORES PLASMIDIAIS Vetor de Expressão em Procarioto rca nam ic ina orie orim pus pb HindIII XbaI RBS hsp6 0 MT19

119 VETORES PLASMIDIAIS ram pic ilina P rom otor CM V Intron EcoRI (1251) ptarget 5670 bp BamHI (1257) EcoRI (1319) HindIII (1326) P oly A rne om icina Vetor de Expressão em Eucariotos

120 Vacina Vetorizada (rbcg) rca na m icina rca nam ic ina orie orie pus bp HindIII XbaI RBS pus pb HindIII XbaI RBS hsp6 0 orim P rom otor hsp6 0 orim MT19 rca nam ic ina Kan(R) oric orie pus bp HindIII XbaI RBS HindII I pus pb orim P rom otor pan XbaI p18kda OriM

121 Vetor de Expressão em Eucariotos VETORES PLASMIDIAIS

122 BACTERIÓFAGO - Vírus que infectam bactérias; - Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

123 BACTERIÓFAGO Ciclo Lítico Ciclo Lisogênico

124 COSMÍDEOS Cosmídeos - São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

125 VETORES DE CLONAGEM Características essenciais Replicação autônoma Marcador de seleção (antibiótico) Sítio único de clonagem

126 VETORES DE EXPRESSÃO Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Promotores induzíveis Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras

127 CLONAGEM MOLECULAR

128 CLONAGEM MOLECULAR É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA

129 3.Preparação do vetor Digestão Purificação Plasmídeo Circular Plasmídeo linear Digestão com Enzimas de restrição

130 4. Ligação Extremidades coesivas DNA plasmidial - vetor Fragmento de DNA - inserto LIGASE

131 5.Transformação da bactéria

132 5.Transformação da bactéria

133 ELETROPORAÇÃO 5.Transformação da bactéria

134 6.Seleção dos clones recombinantes

135 Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

136 A B Figure 3 Chromosomal G-bands were identified (A). FISH - Canine LHCGR was located on chromossome CFA 10 (B).

137 Extração de DNA de L. interrogans Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA PCR 94ºC 5 min Primer F Primer R 94ºC 1 min 50ºC 1 min 72ºC 1 min 72ºC 7 min 30 ciclos lipl pb

138 Construção dos Vetores PCR Clonagem em Vetores de expressão Transformação E. coli lipl pb Seleção dos Clones recombinantes Triagem Extração Digestão 768 pb

139 Expressão de Proteínas Recombinantes P rom otor T7 XbaI (59) 6 X His BamHI (137) HindIII (178) Transformação da E. coli orie pae 2831 bp f1 ori ram pic ilina Cultura de Células Purificação da Proteína

140 Purificação de proteínas recombinantes puc ori Ligação pt7 Xba I (59) 6x His Xho I (131) Bam H I (468) Transformação por Eletroporação Extração de DNA plasmidial LipL32 pae /LipL bp Eco R I (887) Hin d III (894) E. Coli DH5 AmpR f1 ori plyss Transformação por Choque Térmico E. coli (BL21) codon pluss SI DE3 Cepas de E. coli para expressão de proteínas

141 SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas) SDS-PAGE

142 Expressão de Proteínas Recombinantes Expressão em diferentes cepas de E.coli

143 Purificação de Proteínas Recombinantes Akta Prime Gel de poliacrilamida 15% kDa 1. BENCHMARK TM Protein Ladder em kda 2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).

144 APLICAÇÕES

145 Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial Vetor Plasmidial VACINAS RECOMBINANTES 1. PCR PRIMER F Xba I (4) Primer R Bam HI (342) LipL Hin diii (761) L. interrogans lipl bp lipl32 2. Clonagens pae ptarget pus973 pus974 pus Multiplicação E.coli (BL21) E.coli TOP10 E.coli TOP10 4. Vacinação Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Vetor Plasmidi al Proteína Recombinante Vacina de DNA BCGr

146 ANIMAIS TRANSGÊNICOS

147 PLANTAS TRANSGÊNICAS

148 Enzyme Organism Recognition Blunt or Sticky Sequence End EcoRI Escherichia Coli GAATTC Sticky BamHI Bacillus amyloliquefaciens GFATCC Sticky BglII Bacillus globigii AGATCT Sticky PvuI Proteus vulgaris CGATCG Sticky PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Blunt HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT Sticky Hinfl Haemophilus influenzae Rf GANTC Sticky Sau3A Staphylococcus aureus GATC Sticky AluI Arthrobacter luteus AGCT Blunt TaqI Thermus aquaticus TCGA Sticky HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC Blunt NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Sticky

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