Hemoglobinúria Paroxística Noturna.» Dra. Nydia Strachman Bacal» Hematologista e Patologista Clínica» MBA em Economia e Gestão na Saúde
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- Mauro Jerónimo Henriques Beppler
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1 Hemoglobinúria Paroxística Noturna Diagnóstico e Tratamento t» Dra. Nydia Strachman Bacal» Hematologista e Patologista Clínica» MBA em Economia e Gestão na Saúde
2 Dra. Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica
3 Hemoglobinúria Paroxística Noturna Diagnóstico por Citometria de Fluxo Doença HPN HAM x Citometria de Fluxo Antígenos envolvidos Tamanhos de clones HPN na HPN Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica) Clones HPN em Desordens medulares: MDS (Anemia Refratária), Mielopatias (Mielofibrose/ LMC) Experiência do HIAE e Conclusão
4 A Doença: Hemoglobinúria Paroxística Noturna Expansão clonal adquirida, não maligna de células-tronco hematopoéticas Hemoglobinúria noturna, icterícia, hemosiderinúria Mutação somática adquirida do gene PIG-A Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de proteínas de superfície Para diagnóstico os antígenos mais estudados são: CD55 e CD59, ambas proteínas inibidoras do complemento e, associadas à patogênese da doença clínica.
5 A Doença: Hemoglobinúria Paroxística Noturna Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia Prevalência: < 1/ (rara) Sobrevida: 10 a 15 anos Morte: trombose ou citopenias progressivas raramente transformação leucêmica (<5%) Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e alguns evoluem para remissão espontânea. Hemólise intravascular crônica com exacerbações. Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de ferro. A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas (S.Budd Chiari). Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem menor probabilidade de trombose.
6 Quadro laboratorial Sangue Periférico Anemia, Reticulocitose ose Leucopenia e granulocitopenia Deficiência de ferro Medula óssea hiperplasia eritróide aplasia Ui Urina Hemoglobinúria Hemossiderinúria
7 Teste de HAM GV com HPN são susceptíveis à lise com complemento 37 C / HCL / ph Medida colorimétrica da Hb livre HPN: lise de 5% a 80% dos G.V. Scottish Charles (cirurgião) Strübing Paul (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose. Defeito no G.V.) Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegalia e hemoglobinúria e hemosiderinúria) Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects of the haemolytic mechanism with special reference to serum complement. J Clin Invest 1939;18:
8 Teste de HAM Não existe Falso (-) Existe Falso (+) Diseritropoese congênita tipo II, mas não se o soro do paciente for utilizado ou se os globulos vermelhos do paciente já foram lisados com anticorpo à frio. Portanto o Teste de Coombs deve ser realizado em paralelo e se (+) invalida o teste de Ham. AHAI > HPN
9 Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol GPI âncora através da qual um peptídeo se fixa à superfície das células C-terminal NH 2 proteína ancorada etanolamina âncora GPI glican fosfato glucosamina inositol 1,2 diacilglicerol membrana celular Low et cols.
10 Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol Normal camada bilipídica HPN A deficiência da âncora GPI resulta na perda de várias proteínas da superfície da célula. Mutação de gene PIG-A defeito na acetilglucosa minil transferase
11 Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPI Enzimas Acetilcolinesterase Fosfatase Alcalina Leucocitária ADP-ribosil transferase Moléculas de adesão Antígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58 CD66b Proteínas de superfície reguladoras de complemento Decay accelerating factor - DAF - ou CD55 Homologous Restriction Factor HRF Membrance inhibitor of reactive lysis MIRL ou CD59
12 Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPI Receptores Fc-γγ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16) Antígeno de diferenciação monocitária (CD14) Antígenos eritrocitários Yt antigens (AchE) Holley Gregory antigen Antígenos neutrofílicos NB1/NB2 Outras proteínas de superfície de função desconhecida CAMPATH-1 antigen (CDw52) CD24 GP500
13 CD55 - DAF Decay Accelerating Factor Participa i do controle da ativação do Complemento na superfície da célula Reduz a ação do complexo C4bC2a impedindo a ativação de C3 Sua deficiência isoladamente não justifica o quadro clínico
14 CD59- MIRL Membrane Inhibitor of Reactive Lysis Inibe a formação de C9 cujo complexo resulta na lise da célula Inibe a interação com C8 e C9 Sua inibição resulta em hemólise Sua reintrodução restaura a resistência ao Sua reintrodução restaura a resistência ao Complemento
15 CD14 - Receptor da proteina que se liga à endotoxina O LPS (lipopolissacaride da parede bacteriana) ligada à uma proteina sérica específica se liga à superfície de monócitos e macrófagos através deste receptor. Este complexo resulta na liberação de citoquinas TNF-α, IL-4 e IL-6 6.
16 Reguladoras Complemento MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA G.V. PMN Monocitos Plts Linfocitos HSC CD 55 (DAF) (+) (+) (+) (+) (+) CD 59 (MIRL) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Moléculas de Adesão CD 48 (+) (+) (+) CD 58 (LFA-3) (+) CD66b e CD66c (+) Enzimas Acetilcolinesterase (+) Fosfatase Alc.Leucocitária (+) CD 157 (+) (+) Receptores CD 14 (+) CD 16 (FcγRIII) γ (+) (+) - linf B CD 87 (u-par) (+) (+) (+) - linf T Outros CD 52 (+) (+) CD 90 (+) - linf T (+) Proteina Prion (+) (+) (+) (+) (+) Hoffbrand A. V.;Catovsky D.; Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology a Ed. Blackwell Publishing
17 Citometria de Fluxo Eitó Eritrócitos Granulócitos Monócitos Linfócitos Plaquetas CD55 DAF CD59 MIRL Van der Schoot, 1990
18 Citometria de Fluxo Modos de Apresentação LASER Detectores FL1 FL2 FSC SSC FL3 Foto multiplicadores Impulsos Elétricos Injeção da amostra Sistema Hidrodinâmico Digitalizaçãoit
19 Citometria de Fluxo de células HPN com anti CD59 em eritrócitos Número de Eventos Células HPN Tipo II Tipo I : Normal Células HPN Tipo III Intensidade de fluorescência
20 anti-cd59 Eritrócitos Controle isotipo (b) Células de HPN l e HPN III (c) Discreta população de Células HPN I, HPN II e HPN III (d) Discreta população de Células HPN I e HPN II (transição indistinta) (e) Células HPN III (f) Células HPN II indistintas das Células HPN I e HPN III Hall e Rosse, 1996
21 CD55 e CD59 em Granulócitos Amostra Controle Paciente Controle isotipo CD 59 CD 55
22 CD55 e CD59 em Eritrócitos Amostra Controle Paciente Controle isotipo CD 59 CD 55
23 CD14 em Monócitos Amostra Controle Atenção! Paciente Controle isotipo
24 Interessante Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitos CD55/CD59 negativos devido à hemólise. Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida média maior do que os eritrócitos com CD 59 negativos. A severidade d da anemia por hemólise e hipoplasia i não está correlacionada com o percentual de CD59 positivos Fujioka 1994
25 Diagnóstico por Citometria de Gold Standart Praticidade Fluxo Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal) Eritrócitos: interferentes na avaliação do clone meia-vida diminuída transfusões Detecção de pequenos clones
26 Células HPN na HPN Expressão variável de antígenos ligados através do GPI em 3 linhagens celulares CD59 eritrócitos CD59 granulócitos CD14 monócitos Controle normal Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Sharon 1996
27 Interessante Pacientes com menos de 20% de células anormais raramente apresentam hemoglobinúria mas podem ter hemólise e hemossiderinúria. Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5% de glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia hemolítica. Clone de células HPN III maior que 60%, apresentam hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por razões desconhecidas
28 Indicação de Pesquisa de células HPN Pancitopenias sem causa definida,principalmente se apresentar reticulocitose Tromboses de repetição sem causa definida id Hemólise intravascular sem causa definida
29 Clone de células HPN em síndromes de Anemia Aplastica falência medular HPN Mielodisplasia 11/29 pacientes com Anemia Aplástica (38%) com presença de células HPN. Schubert J, 1994 Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%) AR HPN (+) AR HPN (-) Anormalidades cariotípicas (%) 1 / 21 (4.8) 21 / 64 (32.8).01 Contagem de plaquetas (x 10 3 /μl) 31 (4-121) 91 (9-126).01 Resposta terapêutica a ciclosporina (%) 7 / 9 (77.8) 0 / 8 (0).002 Progressão para SMD avançada ou LMA (%) 0 / 21 (0) 4 / 65 (6.2).57 Pesquisar células l HPN em todos os pacientes com falência de medula óssea antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica. P Wang H, 2002 Blood
30 Clone de células HPN em sindromes de falência medular Relação entre HPN e AAA Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode evoluir para AA AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC HPN-Expansão de clone de célula T anormal Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao stem cell e mutação somática do gene PIG-A Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população normal em 10/
31 Pesquisa de HPN Exames realizados desde 19/01/2004; Até 29/03/2007: 107 solicitações; 5 casos positivos (4,7%). Técnica CD 55 PE/ CD59 FITC (Immunotech) CD 14 (clone My4) PE (Coulter) CD 64 FITC (Immunotech) CD13 PE (B.D.) Glicoforina A (CD235) PE (Dako) Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: : Aug 15, 2000 Pratical Haematology Dacie JV., Lewis SM
32 Controle de Qualidade Proficiência através dos interlaboratoriais CAP- desde Abril/2006; - média de 51 laboratórios participantes. CD55/CD59 UKNEQAS - desde Novembro/2004; média de 65 laboratórios participantes CD55/CD59/CD14 CD16 / CD24 / CD66b
33 LEFS, 56 anos 08/03/ Hemácias Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5% Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células l identificadas por Glicoforina A
34 LEFS, 56 anos 08/03/ Neutrófilos Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
35 LEFS, 56 anos 08/03/ Neutrófilos Controle normal: CD59 (+) = 100,0% 0% Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.
36 LEFS, 56 anos 08/03/ Monócitos Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)
37 RTS, 16 anos 16/05/2006 Hemácias -não realizado, pois recebeu transfusão. Neutrófilos: Controle normal: CD55(+) = 99,0% Ausência de expressão de CD55 em 5,7% dos neutrófilos
38 RTS, 16 anos 16/05/ Neutrófilos Controle normal: CD59(+) = 99,3% Ausência de expressão do CD59 em 61%das 6,1% células CD13 (+).
39 RTS, 16 anos 16/05/2006 Monócitos Controle normal: CD14(+) = 99,0% Ausência de expressão do CD14 em 14,3% das células CD64+.
40 HPN Acompanhamento e Terapêutica Tratamento de suporte: Ácido fólico, ferro suplementar se necessário Transfusão Corticóide controverso profilaxia com anticoagulante em caso de trombose terapia trombolítica (tpa) Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina Eculizumab inibe a ativação do complemento (C5) reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e diminui a necessidade de transfusão Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): Hillmen P., Hall C., Marsh JC. New England Journal of Medicine 350:
41 Conclusões O estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico de HPN devido à maior sensibilidade. As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos. A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de células com deficiência parcial ou total das proteínas dependentes de GPI, M ó i h líti d li Mesmo após crises hemolíticas severas, pode-se analisar a ausência de expressão na população de leucócitos.
42 EQUIPE Ana Claudia M. Brito João Carlos C Guerra Nydia Strachman Bacal Alexandra M.Cavalcante Ruth Hissae Kanayama Sonia Tsukasa Nozawa Obrigada! nsbacal@einstein.br hemato@chsp.org
43 Gene PIG-A Localizado no braço curto do cromossomo X Xp22 Miyata, 1993 Science
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