PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES

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1 PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES WILSON BALEOTTI JR HEMOCENTRO DA FACULDADE DE MEDICINA DA MARÍLIA baleotti@famema.br

2 ALOIMUNIZAÇÃO Diagnóstico de aloimunização Exposição a antígenos eritrocitários 29 sistemas / 257 antígenos (DANIELS, 25)

3 ALOIMUNIZAÇÃO Imunogenicidade do antígeno D > K > c > E > Fy a > Jk a Di a (?!) Origem étnica Freqüência dos antígenos Freqüência das transfusões (MOREIRA et al, 1996; GIBLETT, 1961)

4 CARACTERÍSTICAS DOS ANTÍGENOS E ANTICORPOS Características do anticorpo Temperatura de reatividade in vitro Natureza (natural ou imune) Ativação de C in vitro Classe Ig Autoimune Características do antígeno Sensibilidade a enzimas proteolíticas Efeito de dose Imunogenicidade Forma de conexão e expressão na membrana, ex: Dombrock e Wr b -GPA. Genética, ex: FYB x FY

5 Sistema Rh (4-ISBT) Genes RHD e RHCE (cromossomo 1) 2 Proteína altamente homólogas Proteínas intergrais com 417 aa, 48 antígenos Antígenos mais comuns: D, C, c, E, e Características Anticorpos Naturais, imunes (IgG e IgM) RT / DHRN autoanticorpos T.A., AGH e ENZIMA Efeito de dose C/c 13ser>pro E/e 226pro>ala Antígeno Freqüência % Cauc. africanos D C c 8 96 NH 2 COOH E aa e 98 98

6 Sistema Kell (6-ISBT) Gene KEL (cromossomo 7) Proteína: 732 aa 24 antígenos COOH Características Classe IgG, raramente IgM ativam complemento RT / DHR AGH Imunogenicidade Js a /Js b (Pro/Leu) Kp a /Kp b (Trp/Arg) K/k (Met>Thr) antígenos K Cauc. k 1 Kp a 2 Freqüência% 9 africanos 2 1 <1 NH 2 Kp b Js a 1 <1 Js b

7 Sistema Duffy (8-ISBT) Gene FY (cromossomo 1) Proteína: 338 aa 6 antígenos Características: Classe IgG, raramente IgM ativam complemento RT / DHR AGH NH 2 Fy a /Fy b (Gly/Asp) Anti-Fy 3 Fy a e Fy b (sensíveis à enzimas) antígenos Freqüência% 42 Cauc. africanos COOH Fy a 66 Fy b 83 Fy O fenótipo Fy(a-b-) em africanos é devido a mutação de ponto 33t>c, no sítio GATA1, que impede a expressão eritróide do alelo FYB (gene Fy).

8 Sistema Kidd (9-ISBT) Gene HUT11 (cromossomo 18) Proteína: 391 aa 3 antígenos Características: Efeito de dose (Jk a ) Classe IgG ativam complemento RT / DHR AGH e enzima 28 Jk a /Jk b (Asp/Asn) antígenos Freqüência% Cauc. Afr. Jk a NH 2 COOH Jk b 74 Jk

9 Sistema MNS (2-ISBT) Genes GYPA e GYPB (cromossomo 4) 43 antígenos GPA importante para a expressão de Wr b Tripsina M Ser Ser Thr Thr Gly 65 Glicoforina A N Leu Ser Thr Thr Glu N Leu Ser Thr Thr Glu Met/Thr Papaína S/s 72 U Glicoforina B -quimiotripsina Características: T. A. e AGH. ( IgM e IgG) RT e DHR (rara) Efeito de dose Sensibilidade a enzimas (exceção U) antígenos M N S s Doadores Freqüência% africanos U 1 1 En a 1 1 M k 1 1

10 Sistema Diego (1-ISBT) anticorpos Gene DI (cromossomo 17) Proteína: 911 aa 21 antígenos Classe IgG ativam complemento RT / DHR AGH Wr a /Wr b (658Lys/Glu) Di a /Di b (854Leu/Pro) Imunogenicidade 4-48 NH 2 COOH A expressão Wr b depende da presença de GPA. antígenos Asiáticos Di a 3 13 Di b Freqüência% Doadores 1 1 Wr a 1 1 Wr b 1 1

11 Sistema Dombrock (14-ISBT) gene DO (cromossomo 12) Glicoproteína (GPI): 314 aa 4 antígenos (fenótipo null: Gya-) HPN características Classe IgG RT: imediata / tardia AGH, Enzima NH Hy (Gly) Jo a (Thr) 265 Do a /Do b Asn/Asp antígenos Freqüência% caucasianos afircanos Do a Do b Jo a 1 1 Hy 1 1 Gy a 1 1 Telen et al, 199; Spring et al, 1994 ; Rios et al, 22

12 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES Aloimunização: Risco / freqüência 2,6% - 8,4% receptores eventuais 6% receptores crônicos Persistência do anticorpo (26% / 1 meses) Anticorpos Kidd: < tempo de detecção 3 6% RTH Resposta imune 7 dias após a transfusão Anti-Jk a (4dias) (HEDDLE et al, 1995; REDMAN et al, 1996; ISSIT & ANSTEE, 1998; SCHONEWILLE et al, 2; CHARACHE et al, 199)

13 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES PREVENIR REAÇÕES HEMOLÍTICAS TRANSFUSIONAIS AGUDAS OU TARDIAS Discrepâncias entre a tipagem direta e reversa ABO Acs (anti-a1; anti-i; anti-ih; anti-n e outros) Painel composto por duas ou três células grupo O fenotipadas para os principais antígenos eritrocitários Antígenos com efeito de dose R1R1; R2R2; Jk(ab-) e MN-

14 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES Teste Indireto da Antiglobulina Humana Tubo Gel centrifugação lutinação em coluna Soluções potencializadoras das reações PAI Macromoléculas (proteínas ou polímeros - potencial de repulsão) Ex: Albumina bovina ou Polietileno glicol Soluções de baixa força iônica (LISS) Enzimas proteolíticas ( nuvem iônica)

15 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES Castilho, 1997

16 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES

17 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES PAI POSITIVO PAI (P) auto-controle e CD (N) PAI (P) e auto-controle (P) 1 ou Aloanticorpo(s) alta freqüência Fenótipo Null Efeito de dose

18 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES PAI POSITIVO PAI (P) auto-controle e CD (N) positivo PAI (P) e auto-controle (P) CD negativo Auto frio interferências Auto-anticorpo(s) Auto Aloanticorpo(s) complemento

19 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS

20 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS RECURSOS IMUNOHEMATOLÓGICOS Painel de identificação AGH X Enzimático Fenotipagem / genotipagem Adsorção Seleção células ou técnicas Tratamento enzimático de células selecionadas Painel de células selecionadas R1R1; R2R2; fenótipos raros (Mk, Tj a, k, Rh17, Kp b ) Congelamento de hemácias Nitrogênio líquido

21 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Caso 1 Paciente/doador: nº da amostra: Sistema Rh Kell Duffy Kidd MNS resultado Obs fenótipo D C E c e C w K k Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s LISS ENZ 1 R1 w R1 1 2 R1R1 1 2

22 Caso 1) Identificação em amostras contendo de 1 anticorpo. auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema LISS s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D Obs resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: X X X X X X X X X X X X X OBS: antígeno Fy b é sensível a enzimas proteolíticas. PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS

23 auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema ENZ LISS s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: Caso 1) Identificação em amostras contendo de 1 anticorpo. X X X X X X X X X X X X X X Anticorpos identificados: anti- Fy b, - E PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS

24 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Caso 2 Paciente/doador: nº da amostra: Sistema Rh Kell Duffy Kidd MNS resultado Obs fenótipo D C E c e C w K k Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s Liss ENZ 1 R1 w R1 1 2 R1R1

25 auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema º Liss s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D Obs resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: Caso 2) Efeito de dose. Anticorpo identificado: anti-m PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS

26 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Caso 3 Paciente/doador: nº da amostra: Sistema Rh Kell Duffy Kidd MNS resultado fenótipo D C E c e C w K k Kp a Kp b Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s Liss ENZ 1 R1 w R R1R1 3 4

27 Kp b Kp a auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema ENZ LISS s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: O Rh negativo nº da amostra: Caso 3) antígeno de alta freqüência populacional. Fenotipagem: Kp(ab-) PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS

28 Caso 3) antígeno de alta freqüência populacional alo-adsorção com Anti- Kp b, - D, - C PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Kp b Kp a auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema ENZ LISS s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: O Rh negativo nº da amostra:

29 PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Caso 4 Paciente/doador: nº da amostra: Sistema Rh Kell Duffy Kidd MNS resultado fenótipo D C E c e C w K k Kp a Kp b Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s Liss ENZ 1 R1 w R1 2 2 R1R1 1

30 Caso 4) antígeno de alta freqüência populacional. Fenotipagem:Fy(a-b) M-N-S-s- PRESENÇA DE ALOANTICORPOS PRESENÇA DE ALOANTICORPOS Kp b Kp a auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema W W LISS s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: O Rh negativo nº da amostra:

31 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO-CONTROLE POSITIVO

32 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO- CONTROLE POSITIVO PATOLOGIAS Anemia hemolítica autoimune a quente / frio. Doença hemolítica do recém nascido Reação transfusional hemolítica Anemia induzida por droga Poliaglutinação Incompatibilidade sangüínea materno-fetal Eo técnico Aloanticorpo em baixo título α metildopa Colóides causas IgG / IgM / IgA / Complemento Sistema Rh e outros Reações inflamatórias investigar Caracterizar a Ig e Complemento Identificar o Ac (tipagem e eluato) Identificar o Ac (Eluato e IAI) História clínica História clínica

33 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO- CONTROLE POSITIVO DIFICULDADES Presença de auto-anticorpos e complemento Ampla reatividade Interferem na investigação e identificação de aloanticorpo Investigação AGH monoespecífica (IgG e C) C 32% dos pacientes com AHAI apresentam aloanticorpos

34 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO- CONTROLE POSITIVO O QUE FAZER? Inativação de complemento Dissociação Fenotipagem / Auto-adsorção da amostra de soro Pesquisa e identificação de aloanticorpos Genotipagem

35 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO- CONTROLE POSITIVO Dissociação dos auto-anticorpos Temperatura (Acs frios) Difosfato de cloroquina ZZAP Glicina EDTA Auto-adsorção Necessidade de grandes volumes de hemácias Tempo para realização do procedimento

36 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTO- CONTROLE POSITIVO Caso 5: autocontrole positivo a temperatura ambiente Hemácias I II Auto LI AGH 1 2 W INVESTIGAR HISTÓRIA TRANSFUSIONAL RECENTE REALIZAR C.D. (reação hemolítica transfusional ou auto-imune) REALIZAR AUTO-ADSORÇÃO A FRIO

37 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Caso 5: autocontrole positivo a temperatura ambiente Paciente/doador: nº da amostra: Sistema Rh Kell Duffy Kidd MNS resultado fenótipo D C E c e C w K k Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s LI AGH 1 R1 w R1 3 W 2 R1R R1R R2R r r 3 W 6 r r 3 W W 11 auto 3 W

38 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO

39 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Remoção do auto-anticorpo frio com lavagem das hemácias com Nacl (,9%) a 37ºC

40 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Remoção do auto-anticorpo frio com lavagem das hemácias com Nacl (,9%) a 37ºC

41 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Amostra com auto-anticorpo frio aloanticorpo

42 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Auto-adsorção a frio 4 C

43 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Amostra adsorvida para teste de IAI

44 auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema W W 2 1 AGH LI s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: Anticorpos identificados: anti-s TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO AUTOCONTROLE POSITIVO Caso 5: autocontrole positivo a temperatura ambiente

45 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Caso 6 (auto controle positivo em AGH) Hemácias I II Auto LI AGH INVESTIGAR HISTÓRIA TRANSFUSIONAL RECENTE REALIZAR C.D. (reação hemolítica transfusional ou auto-imune) REALIZAR DISSOCIAÇÃO E AUTO-ADSORÇÃO A 37 C

46 auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema AGH LI s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: CASO 6) Identificação em amostras com auto controle positivo em AGH. TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO AUTOCONTROLE POSITIVO

47 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP CDP Dissociação do auto anticorpo com Difosfato de cloroquina (CDP) 2% em PBS (ph 7,2)

48 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Dissociação do auto anticorpo com Difosfato de cloroquina (CDP) 2% em PBS (ph 7,2)

49 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Amostra com auto-anticorpo frio aloanticorpo

50 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Auto-adsorção a 37 C

51 TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO Amostra adsorvida para teste de IAI

52 auto r r r r R2R2 R1R1 R1R1 R1 w R1 fenótipo Sistema AGH LI s S N M Jk b Jk a Fy b Fy a k K C w e c E C D resultado MNS Kidd Duffy Kell Rh Paciente/doador: nº da amostra: CASO 6) Identificação em amostras com auto controle positivo em AGH. Anticorpos identificados: anti-k TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU TESTE DE COOMBS DIRETO POSITIVO OU AUTOCONTROLE POSITIVO AUTOCONTROLE POSITIVO

53 PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES CONCLUSÃO história transfusional, obstétrica e diagnóstico Painéis de hemácias Fenotipagem é sempre fundamental Técnicas de dissociação Técnicas de adsorção(auto ou alo): Frio / quente/ enzimáticas. Técnicas de congelamento Soros raros e anticorpos contra antígenos públicos Painel de células selecionadas e fenótipos null

54 Referências bibliográficas DANIELS, G. Human Blood Groups. Oxford: Blackwell Science, p. VERGELEN-TYLER, V. (Ed.). Technical Manual. 13. ed. Bethesda: American Association of Blood Banks, p. DANIELS, G & BROMILOW, I. Essential Guide to Blood Groups. Oxford: Blackwell Publishing, p. MOLLISON, P. L.; ENGELFRIET, C. P.; CONTRERAS, M. Blood transfusion in clinical medicine. 1 ed. Oxford: Blackwell Science, 1997.