Reagentes anti-d na detecção dos D fraco e D parcial

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1 Reagentes anti-d na detecção dos antígenos D fraco e D parcial Implicações para doadores, pacientes e gestantes Lilian Castilho, PhD

2 Porque a tipagem RhD é algumas vezes problemática? Grande número de variáveis nos testes sorológicos 1. Múltiplos Métodos Tubo, Microplaca, Gel Alguns realizam teste da AGH para D fraco, outros não Rotina de doadores- Automação 2. Variedade de Reagentes Contém diferentes clones Podem reagir diferentemente com D fraco e D parcial Maioria reatividades com DIV, DVa, e DVI Discrepâncias na tipagem Rh 3. Variabilidade na expressão da proteína RhD ( ~120 diferentes genes = variações) Ocorrem por alterações na sequência do gene RHD D fraco - 53 mutações diferentes D Parcial ~ 45 D el ~ 8 outras ~ 18

3 Locus Rh RHD SMP1 RHCE RHD-CE(4-7)-D RHCE WAGNER e FLEGEL, 2000

4 RhD-positivo Rh box Rh box SMP1 RHD RHCE WAGNER e FLEGEL, 2000

5 RhD-negativo Caucasianos RHD RHCE Africanos Rh box SMP Rh box Rh box SMP dce s

6 Variação na expressão do antígeno RhD 1. D Fraco - incidência % - diferenças populacionais - requer teste indireto da AGH para ser detectado (depende do reagente utilizado) - mutações de único polimorfismo (SNP) no gene intracelular ou citoplasmática - efeito na quantidade da proteína, mas não nos epítopos de D geralmente não desenvolvem anti-d 2. D el - expressão muito fraca de D- sempre fenotipado como D negativo - adsorve e elui anti-d - encontrado nos raros Asiáticos D negativos (1/3) e são C+

7 Variação na expressão do antígeno RhD 3. D Parcial previamente conhecido como mosaico ou categoria - tipagem D-positivo (alguns requerem teste indireto da AGH para detecção) - SNPs- extracelular - OU muitos genes híbridos- regiões do gene RHD substituídas por RHCE - novos antígenos e epítopos D alterados podem desenvolver anti-d

8 Proteínas RhD and RhCE NH intracellular red blood cell surface 417 COOH Flegel WA: Curr Opin Hematol 2006 in press RhD vs. RhCE (amarelo) C/c (verde) E/e (preto) D fraco (vermelho/laranja) D parcial (azul claro/escuro)

9 Epítopos de D expressos na proteína Rhce D HAR, Crawford RHD GENE RHD AUSENTE RHCE W16C Q233E L245V Crawford Africanos GENE RHD AUSENTE exon D R o HAR D HAR Caucasianos Amino ácido(s) D-especifico(s) na proteína Rhce causam reatividade com alguns anti-d monoclonais Principais causas de discrepâncias na tipagem RhD

10 Diferenças na reatividade de hemácias D Har e Crawford+ com alguns reagentes anti-d REAGENTE Monoclonal IgM IgG D Har Crawford Gammaclone GAMA401 F8D8 monoclonal POS POS Immucor Series 4 MS201 MS26 monoclonal POS NEG Immucor Series 5 Th28 MS26 monoclonal POS NEG Ortho BioClone MAD2 Policlonal-humano NEG NEG Diamed Gel MS201 MS26 monoclonal POS NEG Hemácias D Har e Crawford+ são não-reativas com anti-d policlonal Discrepâncias na tipagem RhD ocorrem mais com os reagentes monoclonais

11 Tipagem RhD Em doadores de sangue: Objetivo: rotular as hemácias que apresentam o antígeno RhD como RhD-positivo Problemas: D Fraco - alguns não são identificados mesmo com o teste da AGH D el - todos são tipados como RhD negativo Estes fenótipos podem estimular a produção de anti-d em pacientes RhD-negativo Importante: todos os D el e a maioria dos D fracos são herdados com C+ ou E+, portanto podem ser removidos do pool de doadores RhD-negativo realizando-se a fenotipagem dos antígenos C e E.

12 Tipagem RhD Em pacientes e gestantes: Objetivo: detectar todos que apresentam risco de desenvolver anti-d Maioria dos D fracos- não apresentam risco de desenvolver anti-d (raras exceções) D parcial risco de desenvolver anti-d, mas os fenotipados como D positivo não são detectados - mulheres em idade fértil e gestantes devem ser consideradas RhD-negativo para fins transfusionais e profilaxia Rh Problemas: Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial Mutações de D fraco também podem alterar epítopos

13 Casos enviados ao nosso laboratório RHD Discrepâncias D fraco tipo 2 D fraco tipo 1 D fraco tipo 4 D el (M295I) DAU-2 D+ com anti-d DAR DIIIa DIVa type 1 DIVb DVI DHMi Número

14 Distribuição dos tipos de D fraco na população brasileira

15 D parcial em doadores fenotipados como D fraco

16 Aloimunização anti-d por doadores classificados como D neg. D fraco tipo 2 1 imunização Transfusion, 2000 D fraco tipo 1 1 imunização Vox Sang, 2004 D fraco tipo 26 1 imunização na gestação Transfusion, 2005 Fenótipo DEL RHD(IVS5-38del4) 1 imunização Transfusion, 2005 RHD (K409K) Tipo DEL mais prevalente 1 imunização secundária Transfusion, 2005 Editorial na Transfusion 45(2005)466

17 Tipos de D fraco entre receptores de sangue com anti-d 31 observações desde 1998 D fraco: auto anti-d n=24 D fraco tipo 4.0: auto anti-d * * * * n=3, baixo título D fraco: alo anti-d n=4 D fraco tipos 4.2, 11 e 15 Blood 95(2000)2699

18 Conduta internacional para a detecção do antígeno D Pacientes e gestantes 2 anticorpos monoclonais IgM que nao detectam DVI Doadores Anticorpo policlonal ou monoclonal IgG DVI+ ou blend (IgM+IgG) teste da AGH em gel

19 Reagentes anti-d na detecção de D fraco e D parcial (Policlonais: tubo/gel) Amostras Tipos de D fraco e D parcial Graus de aglutinação Densidades antigênicas Anti-D/AGH (tubo) Anti-D/AGH (gel) 9 DF DF DF DF DAR 0 (+) DHMi DVI DF1/DHMi (+) DF4/DAR (+)

20 Reagentes anti-d na detecção de D fraco e D parcial (Monoclonais: tubo/gel) Amostras D Fraco/ D parcial Clones de Anti-D IgM Clones de Anti-D IgG/AGH Densidades antigênicas DF DF DF DF DAR DHMi DVI DAU Clones IgM: MS201, P3X61, HM10, BS232, LDM3, MIMA 36 Clones IgG:ESD1, HM16, P3X35, P3X290, MS26, 175-2

21 D parcial Detecção em gel Anticorpos monoclonais IgM que nao detectam DVI DII, DIII, DVa (aglutinação direta) Anticorpos monoclonais IgG que detectam DVI DVI, DFR, DBT, R o HAR (aglutinação indireta) Identificação em gel Painel com 6 soros monoclonais (DII, DIII, DIVa, DIVb, DV, DVII, DFR, DBT, R 0 HAR ) Painel com 12 soros monoclonais (DII, DIII, DIVa, DIVb, DV, DVII, DFR, DBT, R 0 HAR, DAR, DCS, DOL)

22 D cat VI

23 D cat VI tipo I / D cat VI tipo III

24 Proteína RhD e RhD parcial categoria DVI

25 Del

26 Recomendações clínicas para pacientes e gestantes com o fenótipo D fraco Fenótipo D fraco Transfusão Profilaxia Rh D fraco tipo 1 RhD-positivo Não D fraco tipo 2 RhD-positivo Não D fraco tipo 3 RhD-positivo Não D fraco tipo 4.0 RhD-positivo Não D fraco tipo 4.1 RhD-positivo Não D fraco tipo 4.2 RhD-negativo Sim D fraco tipo 5 RhD-negativo Sim D fraco tipo 11 RhD-negativo Sim D fraco tipo 15 RhD-negativo Sim D fraco tipo 19 RhD-negativo Sim D fraco tipo 20 RhD-negativo Sim Outros tipos RhD-negativo Sim

27 Implicações Clínicas Transfusão de sangue RhD+ em pacientes que apresentam os tipos de D fraco mais frequentes (DF1-DF4) DF4) possibilta um melhor aproveitamento dos estoques de sangue RhD- negativo Gestantes com os tipos de D fraco mais frequentes não necessitam de IgRh (melhor utilização o da profilaxia Rh, menor custo) Detecção o da maioria dos D fracos e D parciais em doadores de sangue aumentam a segurança a transfusional e reduzem os risco de aloimunização

28 Futuro genotipagem RHD? Este teste resolveria o problema da tipagem RhD? Mais complexo que mudar a metodologia Dados adicionais são necessários quais alterações es no gene RHD geram novos epítopos? Quais são os objetivos? Não ter produção de anti-d em pacientes? Plataformas de automação são necessárias: Muitas regiões es do gene devem ser analisadas Algorítimo complexo para interpretação

29 Recomendações para a tipagem RhD Pacientes e gestantes 2 anticorpos monoclonais IgM (2 clones) que nao detectam DVI 1 anticorpo monoclonal IgM DVI- 1 anticorpo monoclonal IgG DVI+ Doadores Anticorpo policlonal ou monoclonal IgG DVI+ ou blend (IgM+IgG) teste da AGH em gel

30 O Futuro O futuro não é mais o que era antigamente David Glass CEO Wal-Mart