TESTES IMUNO-HEMATOLÓGICOS. Clécia M. C. Oliveira Farmacêutica

Transcrição

1 TESTES IMUNO-HEMATOLÓGICOS Clécia M. C. Oliveira Farmacêutica 2016

2 Imuno-Hematologia O que é Imuno-hematologia e qual o seu papel em uma unidade de Hemoterapia?

3 Imuno-hematologia é uma ciência complexa que inclui conhecimentos de imunologia, hematologia, genética clássica e molecular, no estudo de antígenos, anticorpos e a interação entre eles.

4 A Imuno-hematologia estuda, mais amplamente, a compatibilidade entre componentes sanguíneos e os receptores destes hemo-componentes, geralmente indivíduos portadores de doenças imuno/onco-hematológicas.

5 Na Unidade de Hemoterapia, o setor de Imuno-hematologia é fundamental para subsidiar as pesquisas pré e pós-transfusionais realizadas entre o sangue do doador e do receptor, a fim de evitar reações indesejadas no momento da transfusão de hemocomponentes.

6 O que fazemos no laboratório de Imuno-hematologia eritrocitária? Laboratório de pacientes: 1. Fenotipagens: identificam a presença ou não dos antígenos: a) Fenotipagens primordiais: pesquisa dos antígenos do sistema ABO e antígeno D (sistema Rh). b) Realização de outras fenotipagens: pesquisa de antígenos dos demais sistemas (EX: Rh, K, Jk, etc), realizadas geralmente em pacientes politransfundidos, que fizeram transplante de medula óssea, mulheres em idade fértil que receberão transfusão de glóbulos vermelhos, entre outros.

7 O que fazemos no laboratório de Imuno-hematologia eritrocitária? 2. Pesquisa de anticorpos irregulares no soro (P.A.I.) e ligados às hemácias (T.A.D.). 3. Identificação de anticorpos irregulares no soro e eluato (painel de hemácias). 4. Investigação de patologias auto-imunes. 5. Compatibilização pré-transfusional (provas cruzadas). 6. Investigação de intercorrências transfusionais.

8 ROTINA DA AGÊNCIA TRANSFUSIONAL 1.. Recebimento da solicitação de transfusão; 2. Coleta de amostra; 3. TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS; 4. Procedimentos especiais em hemocomponentes; 5. Liberação dos hemocomponentes para transfusão

9 ANVISA/MS -PORTARIA N 158/16 -RDC N 34/14 TESTES. PRÉ-TRANSFUSIONAIS OBRIGATÓRIOS: Transfusão de hemocomponentes eritrocitários: Tipagem ABO (direta e reversa) no sangue do receptor; Determinação do fator Rh(D), incluindo pesquisa de D "fraco no sangue do receptor; Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) no sangue do receptor; Prova de compatibilidade, entre as hemácias do doador e o soro ou plasma do receptor; Retipagem ABO e Rh no sangue do doador

10 TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS OBRIGATÓRIOS: Transfusão de hemocomponentes plaquetários: Tipagem ABO (direta e reversa) no sangue do receptor; Determinação do fator RhD; Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) no sangue do receptor.

11 TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS OBRIGATÓRIOS:. Transfusão de hemocomponentes plasmáticos e crioprecipitado: Tipagem ABO (direta e reversa) no sangue do receptor; Determinação do fator RhD no sangue do receptor;

12 Conceitos: Antígenos de grupos sanguíneos. Substâncias presentes na membrana das hemácias, inofensivas ao próprio indivíduo, mas que podem induzir a produção de resposta imune específica em outro organismo, quando reconhecidas como estranhas, em caso de transfusões/ gestações.

13 Antígenos de grupos sanguíneos.

14 Modelo de membrana eritrocitária.

15 Antígenos de grupos sanguíneos São agrupados em sistemas de acordo com algumas de suas características genéticas São descritos 346 antígenos eritrocitários 308 agrupados em 36 sistemas

16 Número Systema ISBT gene (HGM name) No. de Antígenos 001 ABO ABO MNS MNS (GYPA, GYPB, GYPE) P P Rh RHD, RHCE Lutheran LU (B-CAM) Kell KEL Lewis LE (FUT3) Duffy FY Kidd JK (SLC4A14) Diego DI (AE1, SLC4A1) Yt ACHE Xg XG Scianna SC Dombrock DO Colton CO (AQPI) Landsteiner-Wiener LW (ICAM-4) Chido/Rodgers C4A, C4B Hh H (FUT1) Kx XK Gerbich GE (GYPC) Cromer CROM (DAF) Knops KN (CR1) Indian IN (CD44) Ok OK (CD147) Raph RAPH (CD151) JMH JMH (CD18) I I (IGNT) P P (βgalt3) GIL GIL (AQP3) 1

17 Conceitos: ANTICORPOS. São imunoglobulinas produzidas com a função de neutralizar e eliminar o antígeno que estimulou a sua produção. Classificação: Naturais:formam-se sem necessidade de contato prévio com o antígeno. Ex:Anticorpos ABO Imunes:formam-se após ativação do sistema imune. Ex: transfusão, gravidez

18 REAÇÃO ANTÍGENO x ANTICORPO

19 Sistema ABO Histórico Landsteiner Grupo A, B e O 1902 Castello e Sturli Grupo AB Nesses experimentos, verificou-se que ocorria uma aglutinação dos glóbulos vermelhos devido à fixação de anticorpos aos antígenos específicos localizados na membrana.

20 Sistema ABO O. sistema ABO é o mais importante na prática Transfusional. Nunca se deve transfundir sangue contendo antígenos ABO ao receptor que não o possua. A reação entre os anticorpos do receptor e os antígenos do doador pode ter consequências transfusionais hemolíticas graves, que podem levar a morte em um período de 10 a 20 minutos, após a transfusão de apenas 100 ml de concentrados de hemácias.

21 Sistema ABO.Regra transfusional:

22 Sistema ABO A classificação do sistema ABO tem como princípio a pesquisa dos antígenos. ABO fixados na membrana da hemácia e anticorpos Anti- ABO presentes no soro do paciente. Esta classificação define o grupo sanguíneo de um indivíduo, e se dá por 2 provas: Prova Direta: pesquisa dos antígenos fixados nas hemácias do paciente. Deve ser feita com soros comerciais conhecidos Anti-A, Anti-B e Anti-A,B. Prova Reversa: pesquisa do anticorpo no soro do paciente. Deve ser feita com hemácias comerciais A e B A prova reversa é uma contra-prova fundamental para a conclusão do exame.

23 Sistema ABO. Os anticorpos do Sistema ABO aparecem espontaneamente após 3-6 meses de idade, através de estímulos passivos:bactérias do trato gastrointestinal +(Açúcares dominantes semelhantesa/b) Tem pico de produção no período entre 5-10 anos e diminuição progressiva na velhice. Passam a ser Ac Naturais/Regulares

24 TIPAGEM ABO. Métodos: -Lâmina (em desuso) -Tubo -Microplacas -Gel centrifugação -Biologia molecular Automação

25 TIPAGEM ABO (Técnica em tubo).

26 TIPAGEM ABO (Técnica em tubo) reação de hemaglutinação.

27 TIPAGEM ABO (Técnica em tubo). Intensidade das reações de hemaglutinação NEGATIVO: nenhum aglutinado Aglutinados médios/sobrenadante claro Vários aglutinados pequenos/ sobrenadante avermelhado 2+ Alguns aglutinados grandes +/- Aglutinados pequenos/ sobrenadante avermelhado 3+ Botão sólido/nenhuma célula livre 1+ 4+

28 Sistema ABO O. grupo ABO só pode ser definido se existir concordância entre os resultados destas duas provas, que devem ser interpretados da seguinte forma: Prova Direta (antígeno) Anti-A Anti-B Anti-AB Prova Reversa (anticorpo) Hm A Hm B Antígeno Anticorpo Grupo Sanguíneo A Anti-B A B Anti-A B A e B Ausente AB - Anti-A e Anti-B O

29 TIPAGEM ABO (Técnica em Gel). Maior sensibilidade Padronização na intensidade de aglutinação no momento da leitura do resultado Testes estáveis por 2 dias Realização de teste de Coombs sem lavagens de hemácias Menor contato do profissional com o sangue (biossegurança)

30 TIPAGEM ABO (Técnica em Gel).

31 TIPAGEM ABO (Técnica em Gel) Escala de aglutinação.

32 . Automação

33 Sistema RhD Histórico: 1939: Levine e Stetson atribuem uma Doença Hemolítica Perinatal (DHPN) à atividade de anticorpos maternos contra suas hemacias; 1940: Landsteiner e Wiener produziram Anticorpos por meio da imunização de Coelhos com hemácias de macaco Rhesus.

34 Sistema RhD Doença Hemolítica Perinatal

35 Sistema RhD. Do ponto de vista da prática transfusional é o segundo mais importante, depois do ABO, devido à imunogenicidade de seus antígenos.

36 Sistema RhD Os principais antigenos do Sistema Rh são: D, C, c, E, e Determinação Rh: determinação do antígeno D do Sistema Rhesus nas hemácias do paciente.

37 Sistema RhD Método direto Verificação da presença de antígeno Rh nas hemácias do paciente. As técnicas são as mesmas utilizadas para verificação do sistema ABO: tubo, gel, microplacas, biologia molecular A reação de aglutinação positiva indica a presença do antígeno D na membrana. A reação de aglutinação negativa nem sempre indica ausência de antígeno D na membrana presença de D fraco

38 Sistema RhD.Técnicas de tipagem Rh

39 Sistema RhD Controle Rh: é um reativo controle com ausência de anticorpo Anti-D e de qualquer outro tipo de anticorpo para todos os sistemas eritrocitários. Tem por finalidade detectar erros ou patogenias existentes no paciente que resulte numa reação positiva do controle. (Exemplo: casos de hiperproteinemia).

40 Sistema RhD.Interpretação: Maioria das hemácias D positivas: - aglutinação clara macroscópica (botão) após centrifugação c/ anti-d Algumas hemácias D-positivas: demonstração do Ag D requer: - incubação prolongada c/ reagente anti-d ou -adição de soro antiglobulina após incubação c/ anti-d -Estas hemácias são consideradas D-positivas

41 Sistema RhD D-Fraco : Fenótipo D-fraco: número reduzido de antigeno RhD por hemácia Individuo D-fraco deve ser considerado como D positivo e podem determinar aloimunização materno-fetal

42 Sistema RhD Se a tipagem Rh do receptor não puder ser definida e a transfusão for essencial, deve ser administrado sangue Rh negativo.

43 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO) O P.A.I. tem como objetivo pesquisar no soro do paciente a presença de aloanticorpos irregulares voltados contra antígenos clinicamente significantes de importância transfusional e/ou gestacional. Os anticorpos clinicamente significantes são os anticorpos contra antígenos eritrocitários (principalmente contra os sistemas Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNSs

44 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO) A PAI pode impedir de um receptor com um anticorpo clinicamente significante seja transfundido com hemácias que apresentam o antígeno correspondente. Esta técnica deve ser feita no soro de todos os pacientes antes de qualquer transfusão. A detecção de anticorpos é realizada testando o soro do paciente contra 2 e/ou 3 células de hemácias de reagentes de doadores fenotipados para a maioria dos antígenos comuns, preparadas comercialmente.

45 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO). Técnica: liss/coombs, albumina, enzima, frio Métodos: tubo, gel Resultado: Ausença de aglutinação: negativo Presença de aglutinação:positivo

46 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO). Técnica em tubo: Hemácias I e II + soro do paciente 1ª fase: fase salina temperatura ambiente 2ª fase: fase protéica temperatura ambiente - albumina bovina 22% ou uso de potencializador 3ª fase: fase protéica quente - 37ºC 4ª fase: fase de Coombs

47 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO). Reação positiva

48 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO) ẠNTIGRAMA

49 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO) PAI geralmente está positivo em pacientes politransfundidos e multíparas, que sensibilizados, possuem anticorpos contra os antígenos presentes nas hemácias de triagem. Transfusão de hemácias contendo antígeno incompatível em um receptor com baixos níveis de anticorpo pode resultar em uma rápida produção de anticorpos, com consequente destruição das hemácias transfundidas.

50 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO).Técnica em gel: -Cartão Gel Coombs -Hemácias I e II (50 µl) -Soro do paciente (25 µl) -Incubação 37 C 15 min. -Centrifugação 10 min. -Leitura -Resultado: positivo ou negativo

51 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU COOMBS INDIRETO) ATENÇÃO!. Os testes PAI que forem positivos, deverá ser realizado a identificação(s) do(s) anticorpo(s). Neste caso, a transfusão de hemácias deve ser célula antígeno(s) - negativo(s) para o anticorpo identificado.

52 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES (IAI) A IAI tem como princípio a identificação de anticorpos eritrocitários irregulares desenvolvidos pela ausência dos respectivos antígenos correlatos dos sistemas sanguíneos pela utilização de um Painel de Identificação, constituído de várias hemácias fenotipadas e caracterizadas por diagrama com as características de cada anticorpo de importância clínica. Atualmente os kits disponíveis no mercado podem variar a quantidade de hemácias que caracterizam este painel (de 10 a 15 hemácias). Métodos: os mesmos utilizados na PAI: tubo e gel

53 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES (IAI) Os resultados do IAI devem ser interpretados pela análise do diagrama de antígenos específicos do Painel. A caracterização do anticorpo deverá estar de acordo com a coluna vertical do diagrama referente a cada antígeno dos Sistemas Eritrocitários (coluna horizontal). Os resultados do soro pesquisado deverão ser similares à coluna referente ao anticorpo identificado. Esta igualdade dará o resultado do anticorpo presente no respectivo soro. É possível que um mesmo material contenha mais um de anticorpo. Anticorpos clinicamente significantes: ABO, Rh, K, Fy, JK, SsU, Di

54 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES (IAI).ANTIGRAMA Rh Kell Duffy Kidd MNS Resultado FENOTIPO D C E c e C w K k Fy a Fy b Jk a Jk b M N S s Sal 37ºC LISS AGH Pap 1 R 1w R R 1 R R 2 r R 1 R R 2 R r r r r r r r r r r Auto

55 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS IRREGULARES (IAI) Para estas identificações é importante o treinamento do profissional envolvido para a correta correlação dos antígenos presentes e os anticorpos Identificados.

56 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE Finalidade de determinar a presença de anticorpos pré-formados no sangue do receptor contra as células do possível doador Testa os glóbulos vermelhos do doador contra o soro do receptor

57 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE Técnicas: Tubo Gel Técnica em tubo: TUBO DE HEMÓLISE HEMÁCIAS DO DOADOR 1 GOTA DE SUSPENSÃO 5% SORO DO RECEPTOR 2 GOTAS

58 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE Técnica em tubo: Temperatura ambiente Meio protéico 37ºC Coombs Resultado: Ausência de aglutinação: compatível Presença de aglutinação: incompatível

59 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE. Técnica em Gel: GEL COOMBS HEMÁCIAS DO DOADOR 50 µl DE SUSPENSÃO 1% SORO DO RECEPTOR 25 µl Incubação: 37 C 15 minutos Centrifugação 10 minutos Leitura Resultado: -Ausência de aglutinação: compatível -Presença de aglutinação: incompatível

60 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE A Prova Cruzada é importante porque é através dela que se pode detectar: - Erros nas tipagens ABO do doador e do receptor; - Anticorpos irregulares clinicamente significantes não detectados na PAI do receptor; -Anticorpos contra antígenos de baixa freqüência presentes nas hemácias do doador. No entanto, a prova cruzada não previne a imunização, nem acusa todos os erros de tipagem.

61 PROVA CRUZADA (PROVA DE COMPATIBILIDADE Um resultado positivo na prova cruzada requer maiores estudos, sendo que o paciente não deverá ser transfundido até que a causa da incompatibilidade tenha sido completamente esclarecida

62 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA (TAD) OU COOMBS DIRETO Finalidade: pesquisa a presença de hemácias sensibilizadas por anticorpos e/ou frações de complemento. Aplicações laboratoriais: Estudo da Doença Hemolítica Peri-Natal Anemia Hemolítica Auto-Imune Hemólise induzida por drogas Reações hemolíticas imunes pós-transfusionais

63 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA (TAD) OU COOMBS DIRETO. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA: 1- Lavar as hemácias teste 3 à 4 vezes em salina preparar uma suspensão de 3 à 5% em salina. 2- Identificar dois tubos ( IgG, Poli) e acrescentar 1 gota de suspensão de hemácias em cada tubo; 3- Adicionar de 1 a 2 gotas do soro antiglobulina correspondente a cada tubo; 4- Misturar e centrifugar de 3000 a 3600 rpm por segundos; 5- Ressuspender gentilmente e examinar a aglutinação. Registrar os resultados.

64 TESTE DIRETO DA ANTIGLOBULINA (TAD) OU COOMBS DIRETO. Reação positiva

65 ELUATO. A técnica do Eluato é utilizada para a identificação de anticorpos quando o TAD está positivo. É utilizada na investigação da Doença hemolítica perinatal Tem como princípio a liberação do anticorpo por ruptura da membrana da hemácia. A partir do Eluato é possível fazer a identificação do anticorpo irregular (IAI) usando a técnica de Coombs Indireto

66 ELUATO. Técnicas: LUI - eluição de anticorpos fixados às hemácias por congelamento e descongelamento, Diacidel (eluição por meio ácido).

67 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA A fenotipagem tem como principio a interação antígenoanticorpo visualizada pela reação de aglutinação das hemácias estudadas em presença dos Anti-soros específicos. Tem como objetivo a pesquisa de antígenos fixados na hemácia pesquisada. O uso da fenotipagem na Hemoterapia é muito importante para a escolha do concentrado de hemácia mais compatível para o paciente quando este apresenta anticorpos de significado clínico importante

68 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA Através da fenotipagem eritrocitária é possível aumentar a disponibilidade de hemocomponentes compatíveis e proporcionar transfusões com o menor risco de reações, pois os antígenos são diferenciados previamente e os hemocomponetes são identificados de acordo com o fenótipo eritrocitário. Principais sistemas para fenotipagem: Sistema Rh e Kell (rotina) Sistema Duffy (Fy) Sistema Kidd (JK) Sistema MNS Sistema Diego (Di) Estendida

69 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA Para determinar a fenotipagem eritrocitária utilizam-se soros comerciais, seguindo a técnica conforme recomendações do fabricante do anti-soro, Pode se utilizar a técnica em tubo ou gel centrifugação Ler e interpretar as reações e anotar os resultados em graus de aglutinação, Se houver presença de aglutinação indica reação positiva para o antígeno correspondente, Ausência de aglutinação indica reação negativa para o antígeno correspondente. Este teste apresenta um custo bastante elevado, não sendo feito de rotina.

70 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA.Anti-soros

71 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA.Gel centrifugação

72 FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA. Limitações: A presença de hemácias do doador na circulação do paciente com transfusão recente dificulta a correta identificação do perfil antigênico, impossibilitando a seleção adequada do sangue a ser transfundido. Alternativa: genotipagem de grupos sanguíneos

73 .

74 RDC 36, 25 DE JULHO DE Art. 8º O Plano de Segurança do Paciente em Serviços de Saúde (PSP), elaborado pelo NSP, deve estabelecer estratégias e ações de gestão de risco, conforme as atividades desenvolvidas pelo serviço de saúde para: VIII - segurança na prescrição, uso e administração de sangue e hemocomponentes;

75 CADEIA TRANSFUSIONAL PRESCRIÇÃO (MÉDICO) COLETA DE AMOSTRAS TRANSFUSÃO SEGURA TRANSFUSÃO TESTES PRÉ- TRANSFUSIONAIS

76 Solicitação de Transfusão É feita pelo médico, em formulário específico e deve ser preenchida adequadamente para garantir a segurança transfusional, contendo: nome completo, registro, clínica, leito, sexo, diagnóstico, hemocomponentes, data, dados do médico e carimbo, tipo de transfusão, entre outros.

77 Coleta da amostra Identificação Correta da Amostra é fundamental Atenção!!! A coleta é um momento onde se inicia os testes prétransfusionais, portanto é fundamental confirmar a identificação da amostra e do receptor. Esta atividade envolve todo profissional na área de saúde.

78 Identificação da amostra O. QUE DEVE CONSTAR NO TUBO PARA COLETA DE AMOSTRA DE SANGUE: nome completo do paciente sem abreviaturas registro data da coleta nome do responsável pela coleta Afixar a etiqueta de identificação do paciente no tubo da amostra à beira do leito, após ter confirmado verbalmente e através da pulseira de identificação do paciente

79 Testes Pré-transfusionais.Causas de erros: Enganos na transcrição e interpretação de resultados Vidraria mal lavada e com resíduos Reagentes com prazo de validade vencida Falhas na identificação e/ou troca de amostras Falha na adição do reagente e/ou amostra Falha na execução técnica Equipamentos descalibrados Concentração da suspensão celular inadequada Utilização de reagentes de diferentes fabricantes

80 Liberação de sangue para transfusão: A etiqueta de liberação do hemocomponente que será transfundido, deve conter: Nome completo do paciente, Registro do paciente, Enfermaria e leito, Tipagem ABO/ Rh do receptor, Número da bolsa do hemocomponente com sua tipagem ABO/ Rh, Resultado da conclusão do teste de compatibilidade, Data e nome do responsável pela realização dos testes prétransfusionais e pela liberação.

81 Ato transfusional O receptor será identificado imediatamente antes da transfusão por meio da informação de seu nome completo prestada pelo próprio receptor ou por profissional da equipe médica e/ou de enfermagem responsável pela assistência direta ao paciente. Havendo qualquer discrepância entre a identificação do receptor e a constante da bolsa, a transfusão será suspensa até o esclarecimento do fato. Haverá mecanismos, tais como pulseiras ou braceletes, que reduzam a possibilidade de erro na identificação do receptor na hipótese de receptores inconscientes ou desorientados