IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DO ANTÍGENO D FRACO NO LABORATÓRIO CLÍNICO E BANCO DE SANGUE

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1 IDENTIFICAÇÃO DA PRESENÇA DO ANTÍGENO D FRACO NO LABORATÓRIO CLÍNICO E BANCO DE SANGUE Crispina Conceição Santos* RESUMO: No sistema Rh(D) já foram descritos 52 antígenos, mas cinco deles (D, C, c, E, e) são responsáveis por 99% dos problemas clínicos associados a este sistema. Os antígenos Rh são antígenos especificamente eritrocitários e surgem precocemente na vida intra-uterina. O antígeno Rh(D) possui a mais elevada imunogenicidade do sistema Rh e tem grande significado clínico na transfusão sanguínea e na doença hemolítica perinatal. Esse antígeno apresenta formas variadas de expressão na membrana eritrocitária caracterizando a presença dos antígenos Rh (D) parcial ou Rh (D) fraco, cuja detecção é de interesse na rotina transfusional. O presente estudo relata identificação de antígeno Rh (D) parcial tipo D fraco em doador e pacientes através de métodos sorológicos, bem como a importância dos mesmos na detecção do fenótipo Rh(D). A transfusão de uma única unidade de sangue Rh(D) positivo em paciente Rh(D) negativo está associado com uma imunização acima de 80%. Desta forma, a tipagem de R(D) deve ser realizada em todos doadores e receptores para assegurar que pacientes Rh(D) negativo recebam sangue Rh(D) negativo. Portanto, identificar reagentes e as técnicas disponíveis no mercado para a realização da pesquisa de antígeno D fraco é de grande importância para profissionais que atuam em bancos de sangue e laboratórios clínicos para que possam garantir qualidade e segurança na identificação da presença do antígeno D fraco. Palavras-chave: Grupo sanguíneo. Fator Rh(D). Doadores. Antígeno. Anticorpo. * Farmacêutica Bioquímica do setor de hematologia do laboratório de análises clínicas da Escola Bahiana de Medicina e do setor de Imuno-Hematologia da Fundação de Hemoba. crispinaevol@ig.com.br. Artigo apresentado a Atualiza Cursos, como requisito parcial para obtenção do título de especialista em Hematologia e Hemoterapia, sob a orientação do professor Max José Pimenta Lima. Salvador, 2014.

2 2 1 INTRODUÇÃO Este trabalho pretende apontar a importância e as diferentes alternativas de identificação do antígeno D fraco na tipagem Rh de pacientes e doadores de sangue. O antígeno D é o responsável pela terminologia de Rh positivo ou negativo, ou seja, um indivíduo que possui este antígeno na superfície das suas hemácias será dito como tendo sangue Rh positivo, e inversamente na sua ausência. (ARAÚJO, 2005). Este antígeno D é o mais antigênico após os antígenos do sistema ABO. No sistema ABO, temos anticorpos naturais que aparecem antes do primeiro ano de vida. Isso consiste em que não é necessário que a pessoa tenha contato com o antígeno por uma gravidez e/ou transfusão para desenvolver esse anticorpo. (GIRELLO, 2011) Assim, o encontro do anticorpo presente no sangue de um paciente com hemácias que entram no seu organismo por transfusão ou gravidez, causará reação de lise com consequências de diferentes graus de acordo com o volume de hemácias, o título do anticorpo, etc. Para o antígeno D, o primeiro contato resultará em reconhecimento por parte do sistema imune, como estranho e desenvolvimento de anticorpos, em cerca de 85% dos pacientes. Em um segundo contato com esse antígeno estranho para ele, o indivíduo que já possui o anticorpo, irá reagir semelhante ao referido para os antígeno do sistema ABO. (HARMENING, 2006) O antígeno D Fraco é uma variante do antígeno D e necessita de testes adicionais para sua identificação. Essa pesquisa do antígeno D fraco é realizada em amostras de sangue que apresentam reações fracas/nulas em testes de aglutinação direta com soro anti-d. O paciente com a presença desta variante poderá desenvolver anticorpos anti-d quando exposta ao antígeno D não identificado como D fraco. Quanto ao sangue do doador com este antígeno D fraco, deverá ser transfundido apenas em pacientes que possuem o antígeno D, para que não ocorra a sensibilização. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013) Para otimizar a identificação da presença deste antígeno, diversas técnicas e diferentes reagentes tem sido desenvolvidas. É relevante reconhecer e atualizar as técnicas de identificação da presença do antígeno D fraco e sua importância no laboratório clínico e banco de sangue e descrever as diferentes técnicas de identificação da pesquisa do antígeno D fraco, identificar os reagentes disponíveis

3 3 no mercado para a realização da pesquisa do antígeno D fraco, analisar a importância do antígeno D fraco em doadores de sangue e receptores e analisar a importância do antígeno D fraco na doença hemolítica perinatal. Foi realizada uma revisão de artigos no período de 2002 a 2014 sobre a pesquisa do antígeno D fraco, em bases de dados Scielo, Medline, Lilacs, usando como palavras: D fraco, variante Rh, tipagem Rh. Além disso, foram utilizados livros de hematologia e imunohematologia que abordam o tema.

4 4 2 DESENVOLVIMENTO 2.1 IMUNOLOGIA O organismo quando exposto a um estímulo imunogênico, responde iniciando uma série de eventos coordenados e sequenciais desenvolvidas pelo seu sistema imunológico como forma de proteção (HARMENING, 2006). Os anticorpos ou imunoglobulinas são substâncias produzidas a partir da ativação dos leucócitos, mais especificamente os linfócitos B, que se diferenciam em plasmócitos e secretam anticorpos, em resposta à introdução de um dado antígeno (BAIOCHI, 2009). 2.2 IMUNO-HEMATOLOGIA ERITROCITÁRIA Por definição antígenos eritrocitários são estruturas membranares, herdados geneticamente e são definidos por sequências de aminoácidos específicas (antígenos proteicos) ou por carboidratos ligados a essas proteínas ou lipídios (BONIFACIO, 2009). Antígenos protéicos são produtos diretos dos genes que os codificam, e antígenos carboidratos são produtos secundários de genes produtores de glicosiltransferases, que transportam carboidratos para estruturas precursoras da membrana da hemácia (GIRELLO, 2011). As hemácias possuem na sua superfície diversos antígenos pertencentes a diferentes sistemas sanguíneos. Os antígenos eritrocitários ao serem descobertos recebiam denominações fornecidas pelo responsável pela sua identificação. Com o avanço da ciência, foi possível aprofundar o conhecimento em relação a esses antígenos e verificou-se que alguns antígenos possuíam mais de uma denominação por ter sido considerado inicialmente que eram distintos. Foi proposto então que um comitê internacional reorganiza-se esses antígenos e buscasse uma nomenclatura que permitisse acréscimos de novos antígenos e ao mesmo tempo tornasse mais homogênea a nomenclatura em cada sistema sanguíneo. Esse trabalho foi desenvolvido pela Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea (International Society of Blood Transfusion ISBT). Foi proposta a utilização de uma nomenclatura numérica que pode também ser representada por letras, de modo a auxiliar a memorização (ARAÚJO,2005).

5 5 No momento, são conhecidos mais de 250 antígenos pertencentes aos grupos sanguíneos classificados em 25 sistemas, cinco coleções e duas séries de acordo com a nomenclatura proposta pela ISBT, distribuídos conforme tabela abaixo (ARAUJO, 2005): Tabela 1: Distribuição dos antígenos e nomenclatura de acordo com o ISBT NOME CONVENCIONAL SIMBOLO ISBT NÚMERO ISBT ANTIGENOS SISTEMAS DE GRUPO SANGUÍNEO ABO ABO MNSs MNS P P Rh RH Lutheran LU Kell KEL Lewis LE Duffy FY Kidd JK Diego DI Cartwright YT Xg XG Scianna SC Dombrock DO Colton CO Landsteiner-Wiener LW Chido/Rogers CH/RG Hh H Kx XK Gerbich GE Cromer CROMER Knops KN Indian IN Ok OK Raph RAPH

6 6 JMH JMH COLEÇÕES DE ANTÍGENOS Cost COST Ii I Er ER P, P1, LKE GLOBO Lewis-like: Le-c, Le-d Wright WR Low Prevalence Baixa prevalência High Prevalence Alta prevalência Os diferentes sistemas e antígenos possuem características específicas o que faz com que uns tenham maior envolvimento em reações transfusionais e doença hemolítica perinatal (ARAÚJO, 2005). 2.3 SISTEMA Rh Neste sistema já foram relatados 52 antígenos, mas cinco deles (D, E, e, C e c) responsáveis por 99% dos problemas clínicos associados a este sistema. Os antígenos Rh são estritamente eritrocitários e surgem precocemente na vida intrauterina (NARDOZZA, 2011). O antígeno Rh D é o mais imunogênico do Sistema Rh e possui grande significado clínico na transfusão sanguínea e na doença hemolítica perinatal (CANO, 2008). Dois genes localizados no cromossomo 1, controlam a produção das proteínas Rh: Gene RHD, que não possui alelos, codifica a produção da proteína RhD que carreia o antígeno D; Gene RHCE, que possui vários alelos (RHCe, RHcE, RHce, RHCE), codifica produção da proteína RhCE (ce).

7 7 O indivíduo considerado positivo (D positivo) possui dois genes (RHD, RHCE) e os indivíduos Rh negativos, quase na sua totalidade, o gene RHD está deletado. Estes genes são co-dominantes e são herdados segundo as leis de Mendel (GIRELLO, 2011; NARDOZZA, 2011) D FRACO Uma característica peculiar do antígeno D é o chamado D Fraco. Consiste numa variante fenotípica do antígeno Rh, que reage fracamente nos testes de tipagem Rh, e que essa menor expressão da proteína RhD na membrana eritrocitária se deve a alterações qualitativas na sua porção intramembranar. Outra variante é o D parcial caracterizado pela ausência de um ou mais epítopos do antígeno D, que foram substituídos por epítopos da proteína CcEe. Nos testes sorológicos rotineiros para tipagem Rh é difícil distinguir entre o D fraco e o D parcial (CANO, 2008; FLEGEL, 2002; GIRELLO,2011). Na prática transfusional, a conduta é ainda controversa, mas geralmente os doadores D fraco são considerados Rh positivos e os receptores D fraco, Rh negativos, buscando assim prevenir possíveis imunizações (DANIELS, 2002) ANTI-Rh Os anticorpos Rh são clinicamente significativos e reagem otimamente a 37 o C. Quase todos resultam de aloimunização por transfusão ou gravidez, Há relatos na literatura de seu envolvimento em doença hemolítica perinatal (DHPN), anemia hemolítica auto-imune (AHAI) e reações transfusionais (DANIELS, 2002) 2.4 ALOIMUNIZAÇÃO A aloimunização ocorre como resultado da exposição a antígenos de hemácias, seja em uma ou diversas transfusões desse hemocomponente. Com frequência é difícil encontrar amostras de doadores compatíveis com o sangue dos indivíduos aloimunizados (BAIOCHI, 2009). O risco geral de um paciente ser aloimunizado para um antígeno eritrocitário é estimado ser de 1 a 1,5% para cada concentrado de hemácias transfundido. Entretanto, a taxa de aloimunização eritrocitária depende não só do número de unidades transfundidas, mas também do título do anticorpo presente no plasma, do grau de antigenicidade, da classe de imunoglobulina pertencente, idade, condição

8 8 clinica e nutricional do paciente, da freqüência de certos antígenos e da compatibilidade fenotípica entre a população de doadores de sangue e dos pacientes transfundidos em determinada população (DANIELS, 2002; FLEGEL, 2002) Quando ocorre a transfusão de hemácias incompatíveis, ou seja, com antígenos para os quais a receptor possui anticorpos, poderá ocorrer a reação transfusional hemolítica aguda ou tardia. Os aloanticorpos formados são detectáveis entre 7 e 10 dias após a transfusão, permanecem circulando por muitos meses, e cerca de 50% deles deixam de ser detectáveis no plasma dos pacientes 2 anos após a imunização (FLEGEL, 2002). 2.5 TESTES LABORATORIAIS PARA DETECÇÃO DO ANTÍGENO D TIPAGEM Rh Para o sistema Rh é realizada a tipagem direta, onde se utiliza soros obtidos no comercialmente, que possuem anticorpos anti-d monoclonais ou policlonais de acordo com a escolha do laboratório e estes permitirão identificar a presença do antígenos na superfície das hemácias. O reagente anti-d é proteico, o que torna necessário a utilização de um controle negativo, Controle de Rh que consiste na mesma base proteica do reagente anti-d, mas não contem o anticorpo. Neste caso, se o controle for positivo a reação não será válida pois as hemácias estão aglutinando sem a presença do anticorpo. A leitura do resultado é feita pela presença de aglutinação, e o resultado interpretado de acordo com a tabela abaixo. Tabela 2: Resultado dos testes de Rh Tubo Tubo Rh do paciente Anti D Controle Rh Presente Ausente Positivo Aglutinação Ausente Ausente Negativo Presente Presente Não válido Este teste pode ser realizado pela metodologia em tubo, em lâmina, em microplaca, em gel de centrifugação.

9 9 A técnica em gel consiste em cartelas contendo 6 tubos. Estes contém partículas de gel e solução tampão. Adiciona-se o reagente anti-d e Controle de Rh em tubos diferentes, a amostra do sangue em suspensão salina a 3% e centrifugase D FRACO Todas as vezes que o teste Rh descrito acima, for negativo, deve ser continuado para verificar a presença do antígeno D fraco. Inicialmente, os dois tubos do teste anterior são colocados em banho-maria a 37º C por 15 minutos e depois verificada a aglutinação para intensificar a possibilidade de detectar o antígeno D. Caso, seja negativo, as hemácias dos dois tubos devem ser lavadas três vezes com salina para retirar os anticorpos que não tenha se ligado a antígenos D na superfície das hemácias e após tirar a salina da última lavagem adicionam-se 2 gotas de antiglobulina humana. Centrifuga-se o material e se realiza a leitura da presença ou ausência da aglutinação. Se o teste for positivo nesta fase, será dito como D Fraco. Esta metodologia pode ser feita em tubo, microplaca e gel de centrifugação, porém não em lâmina. O antígeno D Fraco pode ser devido ao número reduzido de antígenos na superfície da hemácia, ou pode ser o chamado D parcial. Este antígeno D parcial, consiste em variantes genéticas que resultam em um antígeno que falta algum ou alguns epítopos. Diversos reagentes foram desenvolvidos e atualmente temos reagentes que nos permitem identificar qual é essa fração ausente no antígeno, porém esta definição da fração ausente tem importância em pesquisa, e não é necessário para a prática médica.

10 10 3 CONCLUSÃO A evolução no conhecimento da base molecular do sistema Rh permitiu o desenvolvimento de técnicas sorológicas e moleculares para determinação das variantes Rh nas diversas populações (BARROS, 2006). Além da melhoria da qualidade dos reagentes para a imunohematologia. permitindo a detecção de antígenos Rh em indivíduos com menores expressões nas hemácias, e isto leva a se pensar que muitas pessoas que foram anteriormente tipadas como D Fraco, ou melhor Du que era a nomenclatura em vigor, atualmente são tipados com Rh positivos. Similar ao que Nardozza e colaboradores (2010), pontuaram sobre o limite entre D fraco e D parcial, que tornou-se muito próximo devido ao grande número de alelos D fracos descritos. Todos esses ganhos na imunohematologia, são de grande importância, porém não há uma técnica que possa nos dar garantia quanto a obtenção de 100% de sensibilidade e especificidade que é o que se deseja na prática laboratorial. Porém o entendimento deste sistema Rh, com suas variantes é de extrema importância para os profissionais que atuam em bancos de sangue e laboratórios, para entenderem o processo e explicarem para os pacientes e demais profissionais.

11 IDENTIFICATION OF THE PRESENCE OF ANTIGEN D WEAK IN MEDICAL LABORATORY AND BLOOD BANK 11 ABSTRACT: The Rh (D) system consists of 52 defined antigens, among which but five of antigens (D, C, c, E, e) are responsible for 99% of the clinical disorders associated with this system. The Rh antigens are specifically erythrocyte antigens and appear early in intrauterine life. The Rh antigen (D) has the highest immunogenicity of the Rh system and has great clinical significance in blood transfusion and hemolytic diseases. This antigen showed various forms of appearance in erythrocyte membrane characterizing the presence of Rh antigens (D) partial or Rh (D) weak, which detection is significant in transfusion routine. The present study reports the identification of Rh(D) partial type d weak in blood donors and patients by serological methods and their importance in the detection of Rh phenotype (D). The transfusion of one unit of blood Rh(D) positive in a patient that is Rh(D) negative is associated with an immunization above 80%. So, type R(D) should be held by all of the donors and recipients to in order to assure that patients who are Rh(D) negative receive Rh(D) negative blood. Therefore, identifying reagents and available techniques in the market for the realization of the search of the weak antigen D is highly important for professionals that work in blood banks and clinical laboratories so that they can guarantee quality and safety in the identification of the presence of the weak antigen D. Keywords: Blood group. Rh factor (D). Blood donors. Antigen. Antibody.

12 12 REFERÊNCIAS ARAÚJO F. Grupos Sanguíneos: Terminologia. ABO Revista de Medicina Transfusional, Lisboa, n. 23, 15-22, jul/set BAIOCHI E, NARDOZZA LMM. Aloimunização. Rev. Bras. Ginecol. Obstet. v. 31, n.6, p BARROS C et al. Avaliação de reagentes anti-d na detecção dos antígenos D fraco e D parcial. Rev. bras. hematol. hemoter. v. 28, n. 4, p BONIFÁCIO SL et al. Funções biológicas dos antígenos eritrocitários Rev. Bras. Hematol. Hemoter. V.31, n. 2, p CANO, TA. DETECÇÃO SOROLÓGICA DE ANTÍGENO RhD PARCIAL DFR EM DOADOR. Anais da Academia de Ciência e Tecnologia de São José do Rio Preto, CARVALHO W.F. Técnicas Médicas de Hematologia e Imuno-hematologia. 8 a Edição, Coopmed, CASTILHO L et al. Genotipagem de grupos sanguíneos. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. v.26, n.2, p DANIELS G. et al. The clinical significance of blood group antibodies. Transfusion Medicine, v.12, p FLEGEL,WA WAGNER FF. Molecular Biology of partial D and weak D: Implications for Blood Bank Practice Clin. Lab. v.48, p GIRELLO A.L. Fundamentos de Imuno-hematologia eritrocitária. Editora Senac HARMENING D. M. Técnicas Modernas em Banco de Sangue e Transfusão. Revinter. 4ª Edição JONG, L.,D(etectar) ou não d(etectar) (Reagentes Sanquin) ABO : Revista de Medicina Transfusional, p.11, n. 31 (Jul./Set. 2007) JUNQUEIRA P. C. História da Hemoterapia no Brasil. Bazilian Journal of Hematology and Hemotherapy. v.27, n.3, p MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria nº 2.712, de 12 de novembro de NARDOZZA LMM et al. Bases moleculares do sistema Rh e suas aplicações em obstetrícia e medicina transfusional. Rev. Assoc. Med. Bras v.56 n.6, p