Texto: Discrepâncias na fenotipagem ABO AUTORAS Ana Lúcia Girello Telma Ingrid Borges de Bellis Kühn

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1 Texto: Discrepâncias na fenotipagem ABO AUTORAS Ana Lúcia Girello Telma Ingrid Borges de Bellis Kühn 1

2 Discrepâncias na fenotipagem ABO Introdução Quando realizamos a fenotipagem ABO dos indivíduos utilizamos 2 provas: A direta que pela adição de anti-soros isto é, soros contendo anticorpos anti-a e anti-b, vão reagir com as hemácias que possuem os antígenos específicos; A reversa que é a verificação no soro dos anticorpos regulares e naturais anti-a e anti-b. O indivíduo só formará anticorpos contra os antígenos eritrocitários do sistema ABO que ele não possui. Desta forma, existe uma tabela para classificação do grupo sanguíneo ABO com base nos resultados esperados para as provas direta e reversa: Prova Direta Prova Reversa Fenótipo do Anti-A Anti-B Anti-AB* Hemácias Hemácias indivíduo A1 B A B O AB Segundo a legislação em vigência é obrigatória a realização dessas duas provas para a classificação do fenótipo ABO em serviços de hemoterapia uma vez que, uma determinação errônea do fenótipo ABO pode produzir conseqüências desastrosas para o receptor de sangue. Vale lembrar que a prova reversa não deve ser realizado em recém-nascidos pois ainda não produziram os anticorpos do sistema ABO! As discrepâncias na fenotipagem ABO ocorrem quando os resultados observados na prova direta (determinação dos antígenos eritrocitários) não concordam com os resultados obtidos na prova reversa (determinação dos anticorpos naturais presentes no soro). Segundo a Portaria 1353/2011 (M.S.) toda discrepância ABO deve ser esclarecida antes da liberação dos resultados. 2

3 Algumas discrepâncias são devidas a erros técnicos, tais como : Uso incorreto de reagentes Identificação incorreta da amostra e tubos Erro de interpretação e/ou transcrição de resultados Falha ao adicionar o reagente Contaminação bacteriana de regentes Super ou sub-centrifugação Vidraria mal lavada Equipamentos descalibrados, etc. Outros problemas são considerados discrepâncias verdadeiras. Dentre os mais comuns na rotina imuno-hematológica, podemos citar aqueles causados por: ausência ou fraca reatividade dos antígenos; ausência ou fraca reatividade dos anticorpos; anormalidades protéicas ou plasmáticas; presença de anticorpos irregulares. Causas mais frequentes das discrepâncias ABO: A) Problemas com os glóbulos vermelhos testados: Aglutinação inesperada devido a: A1) Formação de rouleaux (empilhamento) das hemácias: Causas prováveis: Concentração anormal de proteínas séricas, especialmente em indivíduos que apresentam algumas patologias, como mieloma multiplo, macroglobulinemia, crioglobulinemia, cirrose hepática, hiperfibrinogenemia 3

4 Hemácias de cordão contaminadas com geléia de Wharton Contaminação bacteriana de reagentes ou amostras Presença de aglutininas frias no soro. Como proceder nesta situação: Repetir a lavagem das hemácias-teste, para auxiliar na remoção da geléia de Wharton ou promover dissociação dos anticorpos fixados às hemácias, especialmente em casos onde existam anticorpos frios. Neste último caso, a solução fisiológica pode ser aquecida a 37 o C; Coletar nova amostra, em caso de sangue de cordão excessivamente contaminado com geléia de Wharton, solicitando coleta de sangue venoso Realizar técnica de dispersão do roleaux por adição de solução fisiológica e posterior observação microscópica dos aglutinados A.2) Quimerismo natural ou artificial Causas Transfusão ou transplante de medula óssea recentes. Como proceder: Nestes casos é necessário que o laboratório seja informado sobre essa condição do paciente. Recomenda-se que sejam realizados os testes em método de gel-centrifugação para evidenciar as duplas populações de células. A.3) Teste direto da antiglobulina positivo/ ou autoanticorpos frios ligados as hemácias Causas Devido as hemácias estarem recobertas por anticorpos a fenotipagem ABO pode sofrer interferência. 4

5 Como proceder: atualizado em agosto/2012 Repetir a lavagem das hemácias-teste. Em casos de autoanticorpos frios, devemos utilizar a solução fisiológica aquecida a 37 o C, para promover a dissociação destes. Refenotipar as hemácias e repetir o teste direto da antiglobulina. Realizar a prova reversa e pesquisa de anticorpos irregulares utilizando o soro pré-aquecido a 37 o C No caso destas crioaglutininas estarem presentes em altas concentrações e/ou apresentem alta avidez pelos antígenos, podemos utilizar soluções de reagentes thiol, como 2- mercaptoetanol (2-ME) e ditiotreitol (DTT), para tratamento das hemácias e soro, para destruição dos anticorpos IgM. Repetir os procedimentos após tratamento. Usar soro auto adsorvido a frio para realização dos testes prova reversa e PAI. Recorrer a utilização de técnicas que dissociam os anticorpos ligados as hemácias para possibilitar a fenotipagem e classificação sanguínea. A.3) Poliaglutinação Causas prováveis: É o fenômeno onde as hemácias são aglutinadas por todos (ou a maioria) dos soros de indivíduos adultos. Ocorre por vários mecanismos, entre eles exposição de criptoantígenos por alteração da membrana dos glóbulos vermelhos, ou por super-exposição anormal de determinados receptores de membrana. E a poliaglutinação ocorre, pois o soro dos indivíduos normais contêm anticorpos naturais IgM contra estes receptores, como por exemplo anti-t. O antígeno T é geralmente exposto por ação de bactérias que produzem neuraminidase, ou em alguns tipos de câncer. Observação importante: panaglutinação é o fenômeno de aglutinação inespecífica das hemácias por ação de outros agentes, que nem sempre os anticorpos, como por exemplo, detergentes, sílica coloidal, entre outros. 5

6 Como proceder: atualizado em agosto/2012 Repetir a lavagem das hemácias-teste. Em casos de autoanticorpos frios, devemos utilizar a solução fisiológica aquecida a 37 o C, para promover a dissociação destes. Refenotipar as hemácias e repetir o teste direto da antiglobulina. Realizar a prova reversa e pesquisa de anticorpos irregulares utilizando o soro pré-aquecido a 37 o C para evitar a reatividade de anticorpos frios. Usar reagentes monoclonais que não detectam antígeno T (verificar na bula). Utilização de soro de cordão umbilical, pois não contém anticorpos poliaglutináveis. Tratar soros com reagentes thiol (2-ME ou DTT), desde que contenham suficientes níveis de anticorpos IgG, para posterior utilização na fenotipagem ABO. Tratar as hemácias teste com enzima protease, que remove os receptores que causam poliaglutinação. Solicitar nova amostra. Distinguir entre hemácias sensibilizadas com anticorpos, que ocorrem em casos como anemia hemolítica auto-imune; DHPN; induzida por medicamentos, reações transfusionais. A.4) Antígeno B-adquirido Causas : Indivíduos que apresentam carcinoma de cólon ou reto, ou patologias envolvendo alguns microorganismos, por exemplo, em doenças intestinais obstrutivas (raramente relatados em indivíduos sãos). Ocorre pela desacetilação das estruturas antigênicas A 1, provocada pelas enzimas bacterianas, promovendo uma modificação que era antigamente reconhecida por alguns soros anti-b policlonais e alguns monoclonais (VER ARTIGO POSTADO NA SALA DE AULA). Atualmente esta ocorrência não será mais observada devido a alteração dos clones dos antissoros usados no Brasil, ficando esta discrepância restrita à literatura! 6

7 N-acetil-galactosamina desacetilação galactosamina semelhança estrutural com galactose, açúcar imunodominante B Como proceder: Testar a amostra com soros monoclonais anti-b, que por serem mais específicos para os determinantes antigênicos, não reagirão com o açúcar modificado (galactosamina). Acidificar o reagente policlonal anti-b até atingir ph 6,0. Verificar o diagnóstico do paciente para verificação da patologia; Testar a saliva dos indivíduos sabidamente secretores para substâncias solúveis ABO. Realizar o teste auto-controle: resultado esperado é negativo A.5)Interferência da geléia de Wharton presente em amostras colhidas de cordão umbilical Causas: Presença de aglutinação inespecífica devido à presença de grande quantidade de macromoléculas da geléia de Wharton. Como proceder Amostras de cordão umbilical devem ser lavadas por no mínimo 6 vezes (até 9 vezes) Coletar nova amostra, em caso de sangue de cordão excessivamente contaminado com geléia de Wharton, solicitando coleta de sangue venoso. A. 6) Antígenos fracamente expressos Causas: subgrupos ABO. Exs: A x, A m, B x, etc. O que são subgrupos ABO? Apesar de podermos classificar como subgrupos todas as variantes dos genes originais (A 1, B 1 e O 1 ), vamos 7

8 denominá- los como produtos de genes alelos variantes ou mutantes mais raros, e que apresentam significativa redução no número de sítios antigênicos expressos nas hemácias, embora sejam formados do mesmo açúcar imunodominante. Isto explica porque, algumas vezes, observamos menor reatividade com antisoros A, B e AB nas fenotipagens ABO. Podemos encontrar na fenotipagem direta ABO, diferentes expressões (variações quantitativas) dos antígenos A ou B. Ou mesmo, encontrar algumas discrepâncias entre a prova direta e reversa, por exemplo: indivíduos com prova direta indicando grupo A, mas apresentando em seu soro/plasma, anticorpos que aglutinam a hemácia-teste A, além da hemácia-teste B devido a presença de anti-a 1. Expressão antigênica alterada devido à patologias, como leucemias. Genótipo CIS AB: raramente, os genes A e B podem estar localizados em um mesmo cromossomo, e levar ao aparecimento de um fenótipo muitas vezes descrito como A 2 B, com a ocorrência de anti-b no soro. Foram relatados casos de indivíduos CIS AB em cruzamento com indivíduos O que geraram inesperados descendentes A 2 B. (Issit, P. pp.215) Como proceder Lavar as hemácias e testar com outros reagentes anti-a, anti-b e anti-ab (pode ser testado a 4 o C com controle - hemácias O). Utilizar lectinas anti-a 1 e anti-h para confirmação de subgrupos de A (quando for o caso). 8

9 Ac atualizado em agosto/2012 Antígenos ABO - Subrupos de A Cadeia H1 Cadeia H2 Aa Y Cadeia Cadeia H3 H3 RN e Subgrupos Ab Y Cadeia Cadeia H4 H4 A TOTAL (A 1 ) A d Esquema das cadeias lineares e ramificadas do antígeno H: lembrar que em subgrupos de A apenas cadeias lineares são ocupadas pelo açúcar N-acetil-galactosamina, e assim menos sítios antigênicos A são encontrados por hemácia. Testar o soro/plasma com hemácias do grupo A 2 para confirmação da especificidade do anticorpo anti- A 1 (quando for o caso) Procedimento de adsorção e eluição, que consiste em colocar as hemácias-teste em contato com determinado volume do anti-soros de fenotipagem ABO, em incubação durante certo tempo, o que permitirá (ou não) a adsorção de quantidade de anticorpos aos antígenos fracamente expressos. Estes anticorpos serão agora eluídos (ou não) e demonstrados (ou não) em procedimento de identificação, com hemácias selecionadas para os fenótipos ABO correspondentes. Utilizar enzimas proteolíticas, como papaína, ficina ou bromelina, para tratamento das hemácias a serem testadas. As enzimas removem fragmentos polipeptídicos de glicoproteínas membranares da superfície das hemácias, diminuindo o potencial zeta e aumentando a afinidade dos anticorpos, por uma reestruturação dos antígenos. Então, termina por expor alguns sítios antigênicos, como dos antígenos dos sistemas ABO e Rh, melhorando a reatividade em caso de antígenos fracamente expressos. Utilizar cartelas para fenotipagem pelo método de aglutinação em coluna, que propicia um aumento de sensibilidade do teste pela utilização de enzimas ou solução 9

10 de baixa força iônica no preparo da suspensão de hemáciasteste e a facilidade na verificação de campos mistos, característicos em alguns subgrupos ou quimeras. Fig.1: Dupla população observada no microtubo contendo anti-a, característica do subgrupo A 3. Testar a saliva de indivíduos sabidamente secretores, para presença das substâncias ABO solúveis. Usar biologia molecular, para caracterização dos genes ABO. B) Problemas existentes no soro/plasma: Reatividade inesperada devido a: B1) Roleaux Causas prováveis: Concentração anormal de proteínas séricas, especialmente em indivíduos que apresentam algumas patologias, como mieloma multiplo, macroglobulinemia, crioglobulinemia, cirrose hepática, hiperfibrinogenemia. Como proceder nesta situação: Realizar técnica de dispersão do roleaux por adição de solução fisiológica e posterior observação microscópica dos aglutinados Coletar nova amostra 10

11 B2) autoanticorpos frios / quentes ou Aloanticorpos (adquiridos ativa/ passivamente) ou Presença de anti-a 1 em indivíduos de subgrupos A 2, A 2 B e A x Causas prováveis: Anticorpo irregular Anti-A 1, geralmente presentes no soro de indivíduos subgrupos A 2 e A 2 B Alo-anticorpos classes IgM, como anti-m, -N, -Le a, -Le b, -P 1 Rouleaux de hemácias ou Auto anti-i (autocontroles serão positivos) Aloanticorpos contra outros antígenos, desde que reajam a temperatura ambiente. Como proceder: Fenotipar as hemácias-teste com lectina anti-a 1 para confirmar / descartar a possibilidade de tratar-se de subgrupo de A com anti-a 1 no soro. Neste caso, a fenotipagem resultará positiva e, portanto, a amostra é do grupo A 1 e o anticorpo reativo com a hemácia de reversa A 1 deverá possuir outra especificidade. Realizar identificação do anticorpo no soro, pela realização de painel de hemácias, resultará na especificidade do anticorpo. Após a identificação, fenotipar as hemácias do reagente de reversa A 1 para o antígeno correspondente ou trocar por hemácia de outro lote (que provavelmente não possuirá este antígeno). Repetir a lavagem das hemácias-teste. Em casos de autoanticorpos frios, devemos utilizar a solução fisiológica aquecida a 37 o C, para promover a dissociação destes. Refenotipar as hemácias e repetir o teste direto da antiglobulina. Realizar a prova reversa e pesquisa de anticorpos irregulares utilizando o soro pré-aquecido a 37 o C. Usar soro auto adsorvido a frio para realização dos testes prova reversa e PAI. 11

12 Realizar a prova reversa a 37ºC na tentativa de eliminar a interferência de um possível anticorpo frio. Anti-H em indivíduos com deficiência na substância H Anticorpos dirigidos à substâncias contidas no diluente dos reagentes. Trocar os reagentes ou lavar as hemácias de reversa e ressuspender com solução fisiológica. B3) Anticorpos do sistema ABO fracos ou ausentes devido a: Causas prováveis: Idade Patologias ou tratamentos imunosupressores Quimerismo Variantes raras dos antigenos A e B. Como proceder: Cada caso acima deve ser minuciosamente estudado: em casos de idosos e tratamentos com imunossupressores realizar prova reversa em temperaturas mais frias (2-6ºC); Quimerismo: aguardar um tempo de 90 dias para classificar o fenótipo ABO/Rh; Variantes raras: realizar técnicas de adsorção e eluição para detectar expressões mais fracas desses antígenos. Sugestões gerais para procedimentos técnicos: Descartar erros técnicos; Lavar as hemácias a serem testadas, 3 vezes com solução fisiológica; Repetir a fenotipagem ABO direta e reversa (de preferência com outros lotes de anti-soros); Fazer auto-controle ou teste direto da antiglobulina (TAD) e pesquisa de anticorpos irregulares no soro ( P.A.I.) ; Usar hemácias A 2 (opcional); Verificar os dados do paciente, como idade, diagnóstico e histórico transfusional. Quando as dúvidas persistirem (quando for o caso): 12

13 Coletar nova amostra; Realizar adsorção e eluição; Estender o tempo de incubação do teste; Diminuir temperatura na incubação do teste; Utilizar lectinas anti-a 1 e anti-h; Pesquisa de substâncias solúveis na saliva de indivíduos secretores; Separação de misturas de sangue em casos de quimeras; Pesquisa das transferases ABO; Tratamento enzimático das hemácias-problema; Estudo familiar; Biologia molecular: atualmente as técnicas in house não estão sendo mais utilizadas nos laboratórios de referencia do Brasil por serem de difícil execução. Sistema ABO LINKS/REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 13

14 1. The Blood Group Antigen Gene Mutation Database. Disponível em: me. 2. BATISSOCO, A.C. et al. Easy method for determining the frequency of O 1 and O 2 alleles in Brazilian blood donors by PCR- RFLP analysis. Immunohematology, 2001; 17: BATISSOCO, A.C. NOVARETTI, M. C. Z. Aspectos moleculares do Sistema Sangüíneo ABO. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., Mar 2003, vol.25, no.1, p GIRELLO, A. L.; KUHN, T. I. B. B. Fundamentos da imunohematologia eritrocitária. São Paulo : SENAC São Paulo, JUDD, W.J. JOHNSON, S.T. STORRY, J. R. JUDD S Methods in Immunohematology. AABB Press, OLIVEIRA, M. C. V.; GOES, S. M. P. M. Práticas em imunologia eritrocitária. São Paulo : MEDSI, p. 7. ROBACK, J.D. COMBS, M.R. GROSSMAN, B.J. HILLYER, C.D. AABB Technical Manual. Bethesda, Maryland: AABB, RUDMANN, S.V. Serologic Problem Solving.: a systematic approach for improved practice. AABB Press, YAMAMOTO, F. et al. Molecular genetic bases of the histo-blood group ABO system. Nature 345: , Site: Aspectos históricos,moleculares e bioquímicos do Sistema ABO: Disponível em : 14