P ROC E D I M E N T O O P E R A C I O N A L P A D R Ã O

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1 Encaminhamos pela presente, Norma e Procedimento que implanta e define a sistemática de do HOSPITAL SANTA ROSA. Controle Nome/Cargo Assinatura Elaborado por: Revisado por: Aprovado por: Givanildo Vieira da Cunha Coordenador técnico Givanildo Vieira da Cunha Coordenador técnico Carmen Aparecida de A. Neves Diretora Técnica ELABORAÇÃO REVISÃO Nº03 EMISSÃO 01 DATA: 08/02/2008 DATA: 17/02/2012 DATA: 22/02/ / 31

2 I A P R E S E N T A Ç Ã O 1. Objetivo: 1.1. Estabelecer normas e procedimentos para Realização de Exames Pré- Transfusionais em pacientes do Hospital Santa Rosa, a fim de minimizar os riscos de possíveis reações transfusionais. 2. Áreas Envolvidas: 2.1. Banco de Sangue 2.2. PA 2.3. UTI s 2.4. Centro Cirúrgico 2.5. Unidades de Internação 3. Fatores de Risco: 3.1. Contaminação da amostra colhida Erro na identificação da amostra colhida Erro na determinação dos grupos sangüíneos. 4. Considerações Gerais: 4.1. Método: Aglutinação em tubos 4.2. Amostra: Sangue total com EDTA ou heparina. Soro ou plasma EDTA ou heparina. 2 / 31

3 II R E S P O N S A B I L I D A D E S 1. Banco de Sangue 1.1. Realizar a coleta de sangue Conferir os dados da amostra com a solicitação médica Realizar os exames pré-transfusionais da amostra do receptor. 2. Pronto Atendimento 2.1. Equipe Médica Preencher o formulário da guia do convênio do paciente com o produto hemoterápico a ser solicitado Preencher o formulário da Requisição de Hemocomponentes para Transfusão Equipe de enfermagem Comunicar o banco de sangue, quando houver solicitação de hemocomponente; A coleta da amostra de sangue poderá ser realizada pela Banco de sangue a amostra previamente identificada com nome completo do paciente, localização, data e hora da coleta, número do registro do paciente receptor ou data de nascimento do mesmo e rubrica da pessoa que realizou a coleta. 3. UTI s: 3.1. Equipe Médica Preencher o formulário da guia do convênio do paciente com o produto hemoterápico a ser solicitado Preencher o formulário da Requisição de Hemocomponentes para Transfusão Equipe de enfermagem Avisar o banco de sangue, quando houver solicitação de hemocomponente; A coleta da amostra de sangue poderá ser realizada pelo Banco de sangue a amostra previamente identificada com nome completo do paciente, localização, data e hora da coleta, número do registro do paciente receptor ou data de nascimento do mesmo e rubrica da pessoa que realizou a coleta. 3 / 31

4 4. Centro Cirúrgico 4.1. Equipe Médica Preencher o formulário da guia do convênio do paciente com o produto hemoterápico a ser solicitado Preencher o formulário da Requisição de Hemocomponentes para Transfusão Equipe de enfermagem: Avisar o banco de sangue, quando houver solicitação de hemocomponente; A coleta da amostra de sangue poderá ser realizada pela própria equipe de enfermagem que entrega ao Banco de sangue a amostra previamente identificada com nome completo do paciente, localização, data e hora da coleta, número do registro do paciente receptor ou data de nascimento do mesmo e rubrica da pessoa que realizou a coleta. 5. Unidades de Internação: 5.1. Equipe Médica Preencher o formulário da guia do convênio do paciente com o produto hemoterápico a ser solicitado Preencher o formulário da Requisição de Hemocomponentes para Transfusão Equipe de enfermagem: Avisar o banco de sangue, quando houver solicitação de hemocomponente; A coleta da amostra de sangue poderá ser realizada pela equipe do Banco de sangue a amostra previamente identificada com nome completo do paciente, localização, data e hora da coleta, número do registro do paciente receptor ou data de nascimento do mesmo e rubrica da pessoa que realizou a coleta. 4 / 31

5 III D E S C R I Ç Ã O D A A T I V I D A D E 1. Materiais e Reagentes necessários a) Albumina bovina; b) Caneta pilot para marcação em tubos; c) Dispenser (repipetador automático); d) Estantes; e) Hemáceas testes A1 e B; f) Papel absorvente; g) Pinças; h) Pipetas com volume de 50 microlitros; i) Ponteiras para pipetas automáticas; j) Relógio; k) Óculos; l) Máscaras; m) Luvas de procedimento; o) Solução salina isotônica (0,9%) à temperatura ambiente; p) Soro anti-a,b q) Soro anti-a; r) Soro anti-b; s) Soro anti-d; t) Soro anti-humano; u) Crhccontrole de Rh v) Soro coombs; w) Biopeg; x) Albumina bobina 22%; y) Tubos de ensaio 10x75mm ou 12x75mm; n) Jaleco; 2. Equipamentos necessários a) Aglutinoscopio; b) Banho Maria; c) Centrífuga sorológica; d) Temporizador analógico; e) Capela de fluxo Laminar; 1. Procedimento Técnico para Determinação do Grupo ABO - Direta: 1.1. Realização da suspensão de hemácias a 5%: Em um tubo de hemólise devidamente identificada, colocar 1,0 ml de solução salina 0,9%, usando o dispensador; 5 / 31

6 Adicionar no tubo, 01 gota (50 microlitros) do concentrado de hemácias; Homogeneizar delicadamente; 1.2. Tipagem direta do grupo sanguíneo ABO: Identificar 03 tubos A, B e AB; Pingar 01 gota de soro anti-a no tubo A, 01 gota de soro anti-b no tubo B e 01 gota de soro anti-a, B no tubo AB; Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; Agitar lentamente; Centrifugar 15 segundos entre ( G); Ressuspender delicadamente o botão de hemácias; Fazer a leitura; 1.3. Tipagem ABO e Rh em sangue de cordão e sangue de Rn: Identificar 04 tubos A, B, AB e Rh; Pingar 01 gota de soro anti-a no tubo A, 01 gota de soro anti-b no tubo B e 01 gota de soro anti-a, B no tubo AB e uma gota de Rh (D) no tubo Rh; Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; Agitar lentamente; Centrifugar 15 segundos entre ( G); Ressuspender delicadamente o botão de hemácias Discrepância entre a tipagem ABO direta e reversa: Identificar 03 tubos: A, B e AB; Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; Lavar as hemácias 03 vezes utilizando soro fisiológico 0,9%; 6 / 31

7 Pingar uma gota do soro anti A no tubo A, uma gota do soro anti B no tubo B e uma gota do soro anti AB no tubo AB; Agitar lentamente e centrifugar 15 segundos entre 1000 e 1500g; Ressuspender delicadamente o botão de hemácias; Considerar a tipagem direta proveniente desse processo; Proceder ao teste de coombs indireto. 2. Procedimento Técnico para Determinação do Grupo ABO - Reversa: 2.1. Repetir a Tipagem direta e Reserva com nova Diluição; 2.2. Persistindo a Discrepância, deve-se colher uma nova amostra do paciente; 2.3. Persistindo a Discrepância, deve-se encaminhar a amostra para o laboratório de apoio para conclusão do caso ; 2.4. Comunicar o médico Assistente; 2.5. Selecionar Hemocomponente O- negativo em sistema de emergência; 2.6. Aguardar o resultado definitivo do Laboratório de Apoio; 3. Procedimento Técnico para Determinação do Fator RH: 3.1. Identificar 02 tubos D(Rh) e CRh; 3.2. Pingar 1 gota de soro anti-d (Rh) no tubo D e 01 gota do reagente controle de Rh no tubo CRh; 3.3. Pipetar 1 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; 3.4. Agitar lentamente; 3.5. Centrifugar 15 segundos entre ( G); 3.6. Ressuspender delicadamente o botão de hemácias; 3.7. Fazer a leitura; 4. Procedimento Técnico para Variante D fraco (Qdo RH Negativo): 4.1. Preparar uma suspensão de 5% das hemacias a serem classificadas; 4.2. Identificar 02 tubos D (Rh) e CRh; 7 / 31

8 4.3. Pingar 01 gota de soro anti-d (Rh) no tubo D e 01 gota do reagente controle de Rh no tubo CRh; 4.4. Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; 4.5. Agitar lentamente; 4.6. Incubar o tubo D (Rh) e CRh em banho Maria a 37 ºC entre 15 a 30 minutos; 4.7. Após a incubação, lavar os tubos 03 vezes em solução salina a 0,9%, decantando o sobrenadante; 4.8. Após a última lavagem, decantar totalmente o sobrenadante.; 4.9. Pingar 02 gotas de soro de Coombs (Antiglobulina humana monoespecífico, ou Anti-humano poliespecífico); Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos entre ( G); Ressuspender delicadamente o botão de hemácias; Fazer a leitura; Para confirmação do teste negativo é valido adicionar células sensibilizadas por imunoglobulinas IgG e centrifugar entre ( G) durante 15 segundos e observar a glutinação. Nota: Se o teste for negativo após a adição do controle de hemácias, o teste é invalido e deverá ser repetido. 5. Procedimento Técnico para Pesquisa de Anticorpos Irregulares: 1ª Etapa: Meio salino em temperatura ambiente. Finalidade: Detectar anticorpos salinos da classe IgM das imunoglobulinas, reativos em temperatura ambiente. a) Ressuspender gentilmente os glóbulos vermelhos das hemácias sensibilizadas I e II, invertendo os frascos pelo menos 10 vezes. Não agitar. b) Colocar em cada um dos dois tubos de ensaio previamente identificado I e II, 50 microlitros (1gota) do soro sob triagem para anticorpos irregulares. c) Acrescentar uma gota de suspensão de hemácias sensibilizadas ao tubo I ao tubo II respectivamente misturar bem. d) Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos entre ( G). e) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo. 8 / 31

9 f) Registrar a presença ou a ausência de aglutinação ou hemólise. 2ª Etapa: Meio protéico em temperatura ambiente. Finalidade: Detectar anticorpos salinos (IgM) que possui uma ação intensificada em meio protéico e anticorpos incompletos albumínicos mais potentes (anticorpos da classe IgG). a) Adicionar aos tubos I e II, 02 gotas de albumina bovina 22% e homogeneizar bem. b) Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos entre ( G) c) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo observando a presença ou ausência de aglutinação ou hemólise. Nota: Nos exames em que soro BioPEG substituir a albumina bovina o tempo de incubação diminui de 30 para 15 minutos, sendo também desnecessário a centrifugação logo após a adição desse soro. Prosseguir diretamente para incubação 37ºC. 3ª Etapa: Meio protéico em temperatura de 37ºC. Finalidade: Detectar anticorpos incompletos albumínico reativos a 37ºC, como os anticorpos do sistema Rh. a) Incubar os tubos em banho Maria a 37ºC durante 30 minutos. b) Após a incubação centrifugar todos os tubos durante 15 segundos entre G c) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo. d) Registrar a presença ou a ausência de aglutinação ou hemólise. 4ª Etapa: Teste de antiglobulina humana (Coombs indireto). Finalidade: Detectar anticorpos incompletos reativos pelo teste de Coombs indireto (anticorpos de classe IgG e anticorpos fixadores de componentes do complemento à membrana celular.) a) Lavar as hemácias dos tubos três vezes com solução fisiológica a 0,9%. Na última lavagem desprezar a salina e secar as bordas do tubo com papel absorvente para retirar toda a salina. b) Acrescentar uma gota do soro anti-humano nos tubos I e II e homogeneizar bem. c) Centrifugar os tubos entre ( G) durante 15 segundos. 9 / 31

10 d) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e verificar a presença ou ausência de aglutinação e/ou hemólise. e) Adicionar a cada tubo com resultado negativo, uma gota de hemácias sensibilizadas do grupo O como controle de qualidade da técnica. f) Homogeneizar e centrifugar os tubos entre G por 15 segundos. Nesses tubos no qual foi adicionado o controle de hemácias, deve ser observada aglutinação. Se não houver aglutinação, deve-se repetir o teste desde a primeira etapa. 6. Procedimento Técnico para Coombs Direto: a) Em um tubo de ensaio devidamente identificado, lavar 03 vezes com salina, 250 microlitros do concentrado de hemácias. b) Após a última lavagem, desprezar bem o sobrenadante, invertendo o tubo e enxugando as bordas do tubo com papel absorvente. c) Preparar uma suspensão a 5% das hemácias lavadas, usando 1,0 ml de salina do repipetador e (50 microlitros) das hemácias já lavadas. d) Marcar 02 tubos de ensaio com CP (coombs poliespecífico) e CM (coombs monoespecífico). e) Adicionar em cada tubo (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5%. f) Adicionar ao tubo CP, duas (02) gotas de soro anti-humano poliespecífico e ao tubo CM duas (02) gotas de soro de coombs (soro anti-gama globulina humana monoespecífico). g) Homogeneizar delicadamente e centrifugar os tubos entre ( G) por 15 segundos. h) Ressuspender o botão de hemácias delicadamente e verificar a presença ou não de aglutinação. i) Se os resultados forem negativos nos 2 tubos incubar por 15 minutos em banho maria a 37ºC e depois centrifugar por 15 segundos entre (1000 a 1500 G). Verificar a presença ou ausência de aglutinação após ressuspender o botão. Se houver aglutinação pode indicar a presença de frações do complemento, sendo considerado então, coombs direto positivo. j) Quando o coombs direto for positivo, avisar o médico assistente. 7. Procedimento Técnico de Auto Controle 1ª Etapa: Meio protéico em temperatura ambiente 10 / 31

11 Finalidade: Detectar anticorpos salinos (IGM) que possui uma ação intensificada em meio protéico e anticorpos incompletos albumínicos mais potentes (anticorpos da classe IgG). a) Lavar as hemácias do paciente três vezes com salina; b) Preparar uma suspensão de hemácias a 5% em salina; c) Marcar dois tubos de ensaio: A (auto controle); d) Colocar 50 microlitros do soro ou plasma do paciente; e) Adicionar 50 microlitros da suspensão de hemácias lavadas do paciente; f) Adicionar 02 gotas de albumina bovina 22% ; g) Homogeneizar e centrifugar entre G durante 15 segundos; h) Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias no fundo do tubo e avaliar de houve ou não hemólise; i) Incubar o tubo em banho Maria a 37ºC durante 30 min.; j) Centrifugar conforme o item g; l) Efetuar leitura conforme item h; m) Lavar o tubo com salina três vezes, e decantar bem a salina da última lavagem; n) Adicionar 02 gotas de soro Anti humano ou soro de coombs; o) Centrifugar conforme o item g; p) Efetuar leitura conforme item h. Nota: Nos exames em que o soro Bio PeG substituir a albumina bovina 22% o tempo de incubação diminuir de 30 para 15 minutos, sendo também desnecessários a centrifugação logo após a adição desse soro. 11 / 31

12 8. Procedimento Técnico Prova Cruzada: 1ª Etapa: Meio Protegido em Temperatura Ambiente Finalidade: Detectar anticorpos salinos (IGM) que possui uma ação intensificada em meio protéico e anticorpos incompletos albumínicos mais potentes (anticorpos da classe IgG) a) Realizar expressão do macarrão da bolsa fazendo com que todo o sangue do conector seja introduzido na bolsa, garantindo assim uma amostra homogênea. b) Preparar uma suspensão de hemácias a 5% em salina. c) Marcar dois tubos de hemólise S e A. d) Colocar 50 microlitros de soro do receptor nos tubos S e A. c) Adicionar 50 microlitros da suspensão de hemácias a 5% nos tubos S e A. f) Adicionar duas gotas de albumina bovina 22% no tubo A. g) Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a G durante 15 segundos. h) Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação. i) Incubar os tubos a S e A em banho-maria a 37 ºC por 30 minutos. Nota: Nos exames em que o soro Bio PeG substituir a albumina bovina 22% o tempo de incubação diminuir de 30 para 15 minutos, sendo também desnecessários a centrifugação logo após a adição desse soro. 2ª Etapa: Meio Protéico a 37ºC Finalidade: Detectar anticorpos incompletos albumínicos reativos a 37ºC, como os anticorpos do sistema Rh. a) Incubar os tubos S e A em banho Maria a 37ºC por 30 minutos. b) Centrifugar os dois tubos a G durante 15 segundos c) Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação. d) Lavar os tubos S e A com salina em abundância 03 vezes decantar bem a última lavagem. 3ª Etapa: Teste de antiglobulina humana (Coombs Indireto) 12 / 31

13 Finalidade: Detectar anticorpos incompletos reativos pelo teste de coombs Indireto (anticorpo da classe IgG e anticorpos fixadores de componentes do complemento a membrana celular). a) Acrescentar em cada um dos tubos 02 gotas de soro de coombs ou antíhumano. homogeneizar bem. b) Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a entre (1000 a 1500 G) durante 15 segundos. c) Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação. d) Se o resultado for negativo (sem aglutinação), adicionar 01 gota de controle de hemácias sensibilizada do grupo O. e) Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a entre (1000 a 1500 G) durante 15 segundos. f) Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação. OBS: Prova Cruzada Incompatível, deverá ser realizada até o final (até a 3ª etapa), pois a fase em que a incompatibilidade se manifestar com maior intensidade direcionara o técnico na sua resolução. Diante de uma incompatibilidade, deve ser feito um protocolo, registrando as reações observadas graduando as em cruzes. Nota: Na prova incompatível, deve se ainda, contatar o médico solicitante, a fim de informá-lo da situação e realizar também os testes abaixo: a) Auto Controle b) Coombs Direto c) Pesquisa de Anticorpos Irregulares 13 / 31

14 IV A N E X O S 1. DETERMINAÇÃO DO GRUPO ABO - DIRETA VALORES DE REFERÊNCIA: GRUPOS FENOTIPAGEM DIRETA Soro Anti-A Soro Anti-B Soro Anti-AB A B AB O OBS: + = Presença de Aglutinação 0 = Ausência de aglutinação TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa 14 / 31

15 2. DETERMINAÇÃO DO GRUPO ABO - REVERSA VALORES DE REFERÊNCIA: FENOTIPAGEM REVERSA GRUPO HEMACIAS A 1 HEMACIAS B A O + B + O AB O O O + + Material Plasma o Soro Plasma ou Soro Reagente Hemácias Padronizadas Hemácias Padronizadas + = Presença de Aglutinação O = Ausência de Aglutinação TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa 15 / 31

16 3. DETERMINAÇÃO DO FATOR RH TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa VALORES DE REFERÊNCIA GRUPOS FENOTIPAGEM DIRETA Soro Coombs (Anti globulina humana) CRh RH Positivo (D) + 0 RH Negativo (D) 0 0 OBS 1 : + = Presença de Aglutinação 0 = Ausência de Aglutinação 16 / 31

17 4. VARIANTE D FRACO TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa VALORES DE REFERÊNCIA GRUPOS FENOTIPAGEM DIRETA Soro Coombs (Anti globulina humana) CRh RH Positivo (D) + 0 RH Negativo (D) 0 0 OBS: + = Presença de aglutinação 0 = Ausência de aglutinação 17 / 31

18 5. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES VALORES DE REFERÊNCIA Aglutinação Ausente: Aglutinação presente: Pesquisa de anticorpos irregulares negativa Indica a presença de anticorpos livres no soro do paciente os quais correspondem a um ou mais antígenos presentes nas hemácias usadas no teste. Geralmente, os anticorpos frios da classe IgM reagem inicialmente na fase salina e podem desaparecer nas fases seguintes. Anticorpos quentes de classe IgG geralmente não reagem na fase salina, mas suas reações são intensificadas nas fases seguintes, principalmente após incubação a 37ºC e após a adição da anti-globulina humana. Os anticorpos frios não têm importância clínica, enquanto que os anticorpos quentes são de grande importância clínica. TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa 18 / 31

19 6. COOMBS DIRETO VALORES DE REFERÊNCIA a) Ausência de aglutinação nos tubos CP (poli) e CM (mono): Coombs direto negativo b) Presença de aglutinação nos 02 tubos CP e CM: Coombs direto positivo. c) Presença de aglutinação no tubo CP e ausência de aglutinação no tubo CM: coombs direto positivo. d) Presença de aglutinação no tubo CM e ausência de aglutinação no tubo CP repetir a reação, pois isso não deverá ocorrer. TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença e vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa Usar o controle de hemácias em todos os tubos em que ocorram resultados negativos a fim de comprovar a exatidão da técnica. 19 / 31

20 7. AUTO CONTROLE VALORES DE REFERÊNCIA Reação com o Soro mono ou Poloespecífico Auto Controle + Positivo O Negativo + Presença de Aglutinação (Teste Positivo) O Ausência de Aglutinação (Teste Negativo) TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação 1/2 Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. O Ausência de Grumos. Reação negativa 20 / 31

21 8. PROVA CRUZADA Se houver aglutinação no tubo S ou A, em quaisquer fases, os resultados serão de incompatibilidade, e a bolsa não deverá ser transfundida. Existem exceções, como no caso de anemias hemolíticas auto imunes, porém isto deverá ser discutido com o médico assistente do paciente e hemoterapeuta responsável pelo serviço. Reação com o soro ou mono especifica Teste de Compatibilidade + Positivo O Negativo + Presença de aglutinação (teste positivo) O Ausência de aglutinação (teste Negativo) TABELA PARA INTERPRETAÇÃO DE GRAU DE AGLUTINAÇÃO NAS REAÇÕES IMUNOHEMATOLÓGICAS ESCORE INTERPRETAÇÃO 4 Presença de único Grumo sólido, com sobrenadante claro. Reação 3 Presença de vários Grumos grandes, com sobrenadante claro. Reação 2 Presença de Grumos menores, com sobrenadante róseo. Reação 1 Presença de vários Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação ½ O Presença de poucos Grumos bem pequenos, com sobrenadante róseo. Reação duvidosa. Ausência de Grumos. Reação negativa 21 / 31

22 I V F L U X O G R A M A Procedimento Técnico para Determinação do Grupo ABO Direta Início Realização da suspensão de hemácias a 5%: Tipagem direta do grupo sanguíneo ABO Lavagem das hemácias Tipagem ABO e Rh em sangue de cordão e sangue de Rn Discrepância entre a tipagem ABO direta e reversa colocar 1,0 ml de solução salina 0,9% em um tubo de hemólise Identificar 03 tubos A, B e AB realizar a lavagem prévia do sangue de cordão e sangue de RN, devido à presença da geléia de WORTON Adicionar solução salina isotônica (0,9%) até 01 cm da borda do tubo e vedar com papel para filme ou outro; Identificar 04 tubos A, B, AB e Rh Repitir a Tipagem Direta a reversa com nova deluição Pingar 01 gota de soro anti-a Pingar 01 gota de soro anti-a no tubo A, 01 gota de soro Adicionar no tubo, 01 gota (50 microlitros) do concentrado de hemácias no tubo A, 01 gota de soro anti-b no tubo B e 01 gota de soro anti-a, B no tubo AB Centrifugar a amostra de sangue entre ( G) por 05 minutos Homogeneizar por inversão e centrifugar por 2 minutos entre ( G); anti-b no tubo B e 01 gota de soro anti-a, B no tubo AB e uma gota de Rh (D) no tubo Rh; Colher do Paciente Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo Separar o plasma ou o soro das hemácias, transferindo-o para outro tubo; Desprezar o sobrenadante Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de Pingar uma gota do soro hemácias a 5% em cada anti A no tubo A, uma gota tubo; do soro anti B no tubo B e uma gota do soro anti AB no tubo AB Agitar lentamente Colocar um volume arbitrário Repetir os três últimos do concentrado de hemácias processos por mais duas em um tubo limpo vezes devidamente identificado (pode ser 01 ml); Agitar lentamente; Agitar lentamente e centrifugar 15 segundos entre Centrifugar 15 segundos 1000 e 1500g; entre ( G); Deixar o tubo vedado até o uso Centrifugar 15 segundos entre ( G); Ressuspender delicadamente o botão de hemácias Ressuspender delicadamente o botão de hemácias; Ressuspender delicadamente o botão de hemácias Fazer Leitura Considerar a tipagem direta proveniente desse processo Fazer Leitura Fim Proceder ao teste de coombs indireto 22 / 31

23 Procedimento Técnico para Determinação do Grupo ABO - Reversa Início Identificar 02 tubos de ensaio a e b Colocar em cada tubo 50 microlitros de soro e/ ou plasma a ser testado No tubo a colocar 01 gota das hemácias - teste A No tubo b colocar 01 gota das hemácias - teste B Homogeneizar os tubos Centrifugar por 15 segundos entre ( G) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e anotar o grau de aglutinação Fim 23 / 31

24 Procedimento Técnico para Determinação do Fator RH Início Identificar 02 tubos D(Rh) e CRh Pingar 1 gota de soro anti-d (Rh) no tubo D e 01 gota do reagente controle de Rh no tubo CRh; Pipetar 1 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo Agitar lentamente Centrifugar 15 segundos entre ( G) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias Fazer a Leitura Fim 24 / 31

25 Procedimento Técnico para Variante D fraco (Qdo RH Negativo) In[icio Preparar uma suspensão de 5% das hemacias a serem classificadas Após a incubação, lavar os tubos 03 vezes em solução salina a 0,9%, decantando o sobrenadante Identificar 02 tubos D (Rh) e CRh Após a última lavagem, decantar totalmente o sobrenadante Pingar 01 gota de soro anti-d (Rh) no tubo D e 01 gota do reagente controle de Rh no tubo CRh; Pingar 02 gotas de soro de Coombs (Antiglobulina humana monoespecífico, ou Anti-humano poliespecífico); Pipetar 01 gota (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% em cada tubo; Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos entre ( G); Agitar lentamente Incubar o tubo D (Rh) e CRh em banho Maria a 37 ºC entre 15 a 30 minutos Teste é inválido Repetir o teste S o teste deu negativo após a adição do controle de hemácias? Ressuspender delicadamente o botão de hemácias Para confirmação do teste negativo é valido adicionar células sensibilizadas por imunoglobulinas IgG e centrifugar entre ( G) durante 15 segundos e observar a glutinação N Fim 25 / 31

26 Procedimento Técnico para Pesquisa de Anticorpos Irregulares Inicio 1ª Etapa Meio salino em temperatura ambiente 2ª Etapa: Meio protéico em temperatura ambiente 3ª Etapa Meio protéico em temperatura de 37ºC 4ª Etapa Teste de antiglobulina humana (Coombs indireto). Ressuspender gentilmente os glóbulos vermelhos das hemácias sensibilizadas I e II, invertendo os frascos pelo menos 10 vezes. Não agitar. Adicionar aos tubos I e II, 02 gotas de albumina bovina 22% e homogeneizar bem Incubar os tubos em banho Maria a 37ºC durante 30 minutos Lavar as hemácias dos tubos três vezes com solução fisiológica a 0,9%. Colocar em cada um dos dois tubos de ensaio previamente identificado I e II, 50 microlitros (1gota) do soro sob triagem para anticorpos irregulares Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos entre ( G) Após a incubação centrifugar todos os tubos durante 15 segundos entre G Acrescentar uma gota do soro anti-humano nos tubos I e II e homogeneizar bem Acrescentar uma gota de suspensão de hemácias sensibilizadas ao tubo I ao tubo II respectivamente misturar bem Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo observando a presença ou ausência de aglutinação ou hemólise Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo Centrifugar os tubos entre ( G) durante 15 segundos Centrifugar ambos os tubos durante 15 segundos entre ( G) Registrar a presença ou a ausência de aglutinação ou hemólise Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e verificar a presença ou ausência de aglutinação e/ou hemólise Ressuspender delicadamente o botão de hemácias em cada tubo Adicionar a cada tubo com resultado negativo, uma gota de hemácias sensibilizadas do grupo O como controle de qualidade da técnica Registrar a presença ou a ausência de aglutinação ou hemólise Homogeneizar e centrifugar os tubos entre G por 15 segundos Fim 26 / 31

27 Procedimento Técnico para Coombs Direto Início Em um tubo de ensaio devidamente identificado, lavar 03 vezes com salina, 250 microlitros do concentrado de hemácias Após a última lavagem, desprezar bem o sobrenadante, invertendo o tubo e enxugando as bordas do tubo com papel absorvente Preparar uma suspensão a 5% das hemácias lavadas, usando 1,0 ml de salina do repipetador e (50 microlitros) das hemácias já lavadas Marcar 02 tubos de ensaio com CP (coombs poliespecífico) e CM (coombs monoespecífico). Adicionar em cada tubo (50 microlitros) da suspensão de hemácias a 5% incubar por 15 minutos em banho maria a 37ºC e depois centrifugar por 15 segundos entre (1000 a 1500 G). Adicionar ao tubo CP, duas (02) gotas de soro antihumano poliespecífico e ao tubo CM duas (02) gotas de soro de coombs (soro antigama globulina humana monoespecífico) Verificar a presença ou ausência de aglutinação após ressuspender o botão S Homogeneizar delicadamente e centrifugar os tubos entre ( G) por 15 segundos Há aglutinação? Ressuspender o botão de hemácias delicadamente e verificar a presença ou não de aglutinação Os resultados foram negativos? pode indicar a presença de frações do complemento, sendo considerado então, coombs direto positivo. N Fim 27 / 31

28 Procedimento Técnico de Auto Controle Início 1ª Etapa Meio protéico em temperatura ambiente Lavar as hemácias do paciente três vezes com salina Incubar o tubo em banho Maria a 37ºC durante 30 min Preparar uma suspensão de hemácias a 5% em salina Homogeneizar e centrifugar entre G durante 15 segundos Marcar dois tubos de ensaio: A (auto controle) Colocar 50 microlitros do soro ou plasma do paciente deslocar o botão de hemácias no fundo do tubo e avaliar de houve ou não hemólise Adicionar 50 microlitros da suspensão de hemácias lavadas do paciente Lavar o tubo com salina três vezes, e decantar bem a salina da última lavagem Adicionar 02 gotas de albumina bovina 22% Adicionar 02 gotas de soro Anti humano ou soro de coombs Homogeneizar e centrifugar entre G durante 15 segundos Homogeneizar e centrifugar entre G durante 15 segundos deslocar o botão de hemácias no fundo do tubo e avaliar de houve ou não hemólise deslocar o botão de hemácias no fundo do tubo e avaliar de houve ou não hemólise Fim 28 / 31

29 Procedimento Técnico Prova Cruzada Início 1ª Etapa Meio Protegido em Temperatura Ambiente 2ª Etapa Meio Protéico a 37ºC 3ª Etapa Teste de antiglobulina humana (Coombs Indireto) Realizar expressão do macarrão da bolsa fazendo com que todo o sangue do conector seja introduzido na bolsa, garantindo assim uma amostra homogênea Incubar os tubos S e A em banho Maria a 37ºC por 30 minutos Acrescentar em cada um dos tubos 02 gotas de soro de coombs ou antí-humano. homogeneizar bem Preparar uma suspensão de hemácias a 5% em salina Centrifugar os dois tubos a G durante 15 segundos Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a entre (1000 a 1500 G) durante 15 segundos Marcar dois tubos de hemólise S e A. Colocar 50 microlitros de soro do receptor nos tubos S e A. deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação Adicionar 50 microlitros da suspensão de hemácias a 5% nos tubos S e A. Lavar os tubos S e A com salina em abundância 03 vezes decantar bem a última lavagem O Resultado foi negativo? S Adicionar duas gotas de albumina bovina 22% no tubo N adicionar 01 gota de controle de hemácias sensibilizada do grupo O Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a G durante 15 segundos Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a entre (1000 a 1500 G) durante 15 segundos Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação Com movimentos suaves, deslocar o botão de hemácias do tubo e avaliar se houve ou não hemólise ou aglutinação Incubar os tubos a S e A em banho-maria a 37 ºC por 30 minutos Fim 29 / 31

30 V C O N T R O L E D E R E V I S Õ E S DATA ALTERAÇÃO REALIZADA RESPONSÁVEL 23/04/2010 Sem Alteração Givanildo Vieira da Cunha Coordenador técnico 15/10/2011 Sem Alteração Givanildo Vieira da Cunha Coordenador técnico 17/02/2012 Alterações na Descrição da Atividade no Fluxograma Givanildo Vieira da Cunha Coordenador técnico 30 / 31

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