SECRETARIA DE ESTADO DA SAUDE PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL KENIA PATRÍCIA DOS SANTOS DO CARMO

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1 SECRETARIA DE ESTADO DA SAUDE PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL KENIA PATRÍCIA DOS SANTOS DO CARMO TÉCNICAS UTILIZADAS PARA SELEÇÃO DE UNIDADES DE CONCENTRADO DE HEMÁCIAS EM PACIENTES COM ANEMIA HEMOLÍTICA AUTO-IMUNE Marília 2013

2 SECRETARIA DE ESTADO DA SAUDE PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL KÊNIA PATRÍCIA DOS SANTOS DO CARMO TÉCNICAS UTILIZADAS PARA SELEÇÃO DE UNIDADES DE CONCENTRADO DE HEMÁCIAS EM PACIENTES COM ANEMIA HEMOLÍTICA AUTO-IMUNE Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Programa de Aprimoramento Profissional/SES-Fundap, elaborado na Faculdade de Medicina de Marília, sob a orientação de David Sebastião Lopes Nevoa Junior Área: Hemoterapia Marília 2013

3 C287t Carmo, Kênia Patrícia dos Santos do Técnicas utilizadas para seleção de unidades de concentrado de hemácias em pacientes com anemia hemolítica auto-imune. - - Marília, SP: [s.n.], Orientador: David Sebastião Lopes Nevoa Junior Trabalho de Conclusão de Curso (Programa de Aprimoramento Profissional) Secretaria de Estado da Saúde-Fundap, elaborado na Faculdade de Medicina de Marília. Área: Hemoterapia. 1. Anemia hemolítica auto-imune. 2. Auto-anticorpos. 3. Adsorção.

4 Kênia Patrícia dos Santos do Carmo Técnicas Utilizadas para Seleção de Unidades de Concentrado de Hemácias em Pacientes com Anemia Hemolítica Auto-Imune. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Programa de Aprimoramento Profissional/SES-Fundap, elaborado na Faculdade de Medicina de Marília em fevereiro de Área: Hemoterapia. Comissão de Aprovação: David Sebastião Lopes Nevoa Junior Supervisor/Orientador Sérgio Manoel Zimmermann Dias Coordenador PAP (SES/Fundap) Famema Hemoterapia Profa. Dra. Roseli Vernasque Bettini Coordenador PAP (SES/Fundap) Famema Data de Aprovação:

5 Agradecimentos Acima de tudo agradeço a Deus pela sabedoria e raciocínio exigidos para realização deste trabalho. À minha família pelo respaldo a mim dedicado. Ao meu orientador David Sebastião Nevoa Junior pela paciência, compreensão e tempo a mim dispensado. E aos meus amigos de curso, pelos momentos de companheirismo.

6 Nunca deixem que lhe digam que não vale a pena acreditar num sonho que se tem, ou que seus planos nunca vão dar certo, ou que você nunca vai ser alguém... tem gente que machuca os outros, tem gente que não sabe amar, mas eu sei que um dia a gente aprende. Se você quiser alguém em quem confiar, confie em si mesmo! Quem acredita sempre alcança! Renato Russo

7 Resumo Uma grande dificuldade é encontrada nos casos de anemia hemolítica auto-imune quando é necessária uma transfusão sanguínea para pacientes com esse tipo de patologia. A compatibilidade sanguínea entre doador e receptor é sempre priorizada, e em alguns casos, é necessária a realização da fenotipagem dos eritrócitos do receptor, principalmente para os antígenos mais imunogênicos dos sistemas de grupos sanguíneos Rh, Kell, Kidd e Ss. Um TAD (teste de coombs direto) positivo, indicando a presença de auto-anticorpos revestindo a membrana eritrocitária é o que traz a maior dificuldade na realização desse tipo de análise, pois nela é realizada a fase de anti-globulina humana (AGH) e a presença desses auto-anticorpos leva a resultados falso-positivos, além do tempo levado para realização de técnicas viáveis para remoção dos auto-anticorpos e pela complexidade da realização dessas técnicas. A auto-adsorção é quase sempre necessária, mas pode-se realizar a interação com outras técnicas, em determinados casos. Neste trabalho serão revisadas informações sobre essa patologia e sobre as técnicas utilizadas para seleção de unidades de concentrados de hemácias adequados em casos de necessidade de terapia transfusional em pacientes com anemia hemolítica autoimune. Palavras-chave: Anemia hemolítica auto-imune. Auto-anticorpos. Adsorção.

8 Abstract A great difficulty is found in the cases of autoimmune hemolytic anemia when it is needed a blood transfusion for patients with this type of condition. The blood compatibility between donor and receptor is always prioritized, and in some cases it is necessary phenotyping of receptor erythrocytes. A positive DAT (direct Coombs test) indicating the presence of autoantibodies bound to the erythrocyte membrane is what brings the greatest difficulty in performing this type of analysis, both by the time taken for completion of viable techniques for the removal of these autoantibodies, and the complexity of these techniques. The adsorption is almost always necessary, but in certain cases it is possible the interaction with other techniques. In this work, information about this pathology and the techniques used for selection of packed red blood cells units appropriate in cases of needed transfusion therapy in patients with autoimmune hemolytic anemia will be reviewed. Keywords: Autoimmune hemolytic anemia, Autoantibodies. Adsorption.

9 Sumário 1 Introdução Auto-anticorpos frios Auto-anticorpos quentes Desenvolvimento Presença de aloanticorpos com auto-anticorpos Teste de coombs direto (TAD) Teste da antiglobulina indireto (TAI) Reagentes de globulina anti-humana Antiglobulina humana poliespecífica Antiglobulina humana monoespecífica Técnicas utilizadas para detectar aloanticorpos em pacientes com TAD positivo Adsorção Auto-adsorção Aloadsorção Dissociação Dissociação (tratamento de hemácias com ZZAP) Dissociação (tratamento de hemácias com difosfato de cloroquina) Fenotipagem Diluição Conclusão Referências... 22

10 8 1 Introdução Auto-imunidade pode ser definida como ação do sistema imune voltada contra os componentes do próprio indivíduo. Os linfócitos T ficam ativados e produzem anticorpos que atacam e destroem órgãos alvos, como por exemplo a tireóide, e os linfócitos B secretam anticorpos como os responsáveis pela anemia hemolítica autoimune (FERREIRA; ÁVILA, 2001). A destruição intravascular ou intra-esplênica maciça de eritrócitos é conhecida como anemia hemolítica (RAVEL, 1995). A anemia hemolítica pode ser reconhecida pelos seguintes aspectos: encurtamento da duração de sobrevida dos eritrócitos; elevados níveis de eritropoetina e eritropoese elevada na medula óssea; acúmulo dos produtos do catabolismo da hemoglobina por um aumento de destruição dos eritrócitos (ROBINS, 2005). Anemia hemolítica auto-imune (AHAI) ocorre quando o organismo forma anticorpos dirigidos contra os próprios eritrócitos, chamados de auto-anticorpos, aglutinando, sensibilizando ou hemolisando esses eritrócitos ou eritrócitos provenientes de uma transfusão recebida. (HARMENING, 2006). De acordo com sua etiologia, a AHAI pode ser classificada em dois tipos: primária ou idiopática, quando não se está relacionada a uma patologia de base, ou secundária, quando se está relacionada a uma patologia, como doenças linfoploriferativas, imunodeficiências, uso de medicamentos ou neoplasias. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). A AHAI pode ser classificada em duas classes distintas de auto-anticorpos antieritrocitários, IgM e IgG, sendo cada uma com especificidades diferentes, caracterizando formas de anemia (FERREIRA; ÁVILA, 2001). São: - AHAI a frio, onde a melhor temperatura de reação dos anticorpos é a 4ºC, levando a hemólise por ativação do sistema complemento, ou seja, a fixação imune leva a uma série de reações em cascata, levando à lise dos eritrócitos (hemólise intravascular). Os anticorpos presentes geralmente são da classe IgM; e - AHAI a quente, onde a melhor temperatura de reação dos anticorpos é a 37ºC (responsável por 70% a 80% dos casos de AHAI) levando a hemólise pelo sistema reticuloendotelial, onde os eritrócitos são fagocitados pelo sistema macrofagocítico (hemólise extravascular). A classe de anticorpo normalmente encontrada nesse tipo de AHAI é IgG. Raramente é encontrada IgA. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

11 9 Tabela 1 Diagnósticos associados com anemia hemolítica auto-imune causada por anticorpos a quente Tipo de AHAI Prevalência Primária ou idiopática 60% Secundária: Induzida por drogas 10% Síndromes linfoploriferativas 10% Carcinomas 5% Mielodisplasia 2% Outras 6% Fonte: Zago; Falcão;Pasquini, 2004 Tabela 2 - Comparação de anemias hemolíticas auto-imunes a quente e a frio AHAI Quente AHAI Fria Temperatura ideal de > 32ºC < 30ºC reação Classe da imunoglobulina IgG IgM Ativação do complemento Pode ligar complemento Liga complemento Local de hemólise Geralmente extravascular (sem lise celular) Geralmente intravascular (lise vascular) Frequência 70% a 75% dos casos 16% dos casos Fonte: Harmening, 2006 Nos casos mais severos de AHAI, muitas vezes o paciente necessita de terapia transfusional para corrigir a anemia desenvolvida. Além da importância clínica, a AHAI é de importante conhecimento para rotina laboratorial em imunohematologia, sendo que os auto-anticorpos formados nessa patologia interferem diretamente nos resultados dos testes pré-transfusionais realizados entre doador e receptor, elem dos resultados das fenotipagens, identificação de aloanticorpos, entre outros. (GIRELLO, 2002). Será abordado neste trabalho a respeito da AHAI primária, onde não se tem uma patologia de base que origina esse distúrbio (idiopática) e o organismo adquire autoimunidade contra os próprios eritrócitos. Trata-se da sobrevida dos eritrócitos encurtada pela presença de auto-anticorpos. (GIRELLO, 2002).

12 10 2 Auto-anticorpos frios Auto-anticorpos frios normalmente pertencem à classe IgM e são assim chamados por reagem a baixas temperaturas (0 a 4ºC), não reagindo na temperatura corpórea, sendo assim, de pouca importância clínica. (HARMENING, 2006) A ligação da imunoglobulina de classe IgM resulta na aglutinação dos eritrócitos e consequentemente fixa rapidamente o sistema complemento em sua superfície, levando à hemólise (ROBINS, 2005). A habilidade desses anticorpos em destruir os eritrócitos está relacionada com a capacidade de fixar complemento quando há exposição do paciente em baixas temperaturas (BARBOSA et al.,2008). Os auto-anticorpos frios podem aparecer de forma aguda, levando a uma hemólise perceptível pela anemia, durante a fase de recuperação de certas doenças infecciosas, como pneumonia por micoplasma e mononucleose infecciosa. Pode também estar relacionada de forma crônica em associação a certos neoplasmas linfóides ou em uma condição idiopática (ROBINS, 2005). A AHAI causada por auto-anticorpos frios é relativamente rara, bem menos freqüente com a AHAI causada por auto-anticorpos quentes, sendo responsável por aproximadamente 10 a 20% de todas as anemias hemolíticas. Em geral, os autoanticorpos desse tipo são incapazes de aglutinar os eritrócitos em temperaturas acima de 30ºC (ANDRADE et al., 1999), entretanto, seu significado clínico não deve ser negligenciado, pois podem interferir com tipagens e provas cruzadas (HENRY, 1983). É difícil estabelecer sua especificidade, porém podem ser frequentemente identificadas. Os mais comuns são: auto-anti-i, auto-anti-h e auto-anti-hi (HARMENING, 2006).

13 11 3 Auto-anticorpos quentes Como já relatado anteriormente, a classe de anticorpos quentes geralmente são pertencentes à classe IgG, sendo ativos em temperatura corporal (HARMENING, 2006). Os anticorpos quentes da classe IgA, em associação com outras imunoglobulinas a classe IgM e/ou IgG estão presentes em torno de 14% dos pacientes com AHAI, enquanto que é rara a presença de somente imunoglobulina da classe IgA (BUENTES; MESS, 2003) (JANVIER et al., 2002). Clinicamente, a AHAI por auto-anticorpos quentes pode afetar qualquer grupo etário, podendo ser crônica ou aguda. Quando crônica, é quase sempre de baixo grau. Quando aguda pode ser mais grave e fatal. Os achados laboratoriais são como qualquer anemia hemolítica, dependendo do grau de hemólise: os reticulócitos podem apresentar elevados, frequentemente é observada esplenomegalia, pode haver a presença de esferócitos e o TAD normalmente é positivo. (RAVEL, 1995). É a forma mais comum das anemias hemolíticas auto-imunes (48% a 70%) (ROBINS, 2005), e esses auto-anticorpos sensibilizam os eritrócitos autólogos in vivo em temperatura corporal, sendo considerado o tipo mais patológico. (HARMENING, 2006). Os auto-anticorpos desse tipo são compostos basicamente da subclasse 1 ou 3 de IgG, sendo mais patológico que as imunoglobulinas de subclasses 2 ou 4 e a anemia ocorre quando a velocidade de destruição dos eritrócitos ultrapassa a capacidade de produção pela medula óssea. (HARMENING, 2006). A presença de auto-anticorpos geralmente dificulta ou impossibilita a identificação de aloanticorpos na rotina de banco de sangue, sendo estes aloanticorpos, considerados na rotina transfusional, de significância clinica, onde pela legislação vidente devemos identificar sua especificidade e por sua vez o concentrado de hemácias a ser transfundido deve carecer do seu respectivo antígeno. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).

14 12 4 Desenvolvimento 4.1 Presença de aloanticorpos com auto-anticorpos Pacientes com AHAI podem desenvolver uma anemia severa, podendo haver a necessidade de terapia transfusional (LIUMBRUNO et al., 2006) Os auto-anticorpos presentes na superfície dos eritrócitos e que reagem otimamente a 37ºC são um desafio para o laboratório de imuno-hematologia, uma vez que esses auto-anticorpos podem esconder a presença de um aloanticorpo (anticorpo formado devido ao contato prévio com antígenos eritrocitários, através de transfusão sanguínea ou gestação). (LEGER; GARRATTY, 1999). Quando auto-anticorpos estão presentes em pacientes que necessitam de terapia transfusional, tipicamente eles reagem com todas as células de um painel de hemácias, pois elas reagem com todas as hemácias normais, inclusive as do próprio indivíduo (HARMENING, 2006), mascarando assim a presença de possíveis aloanticorpos. (BRANCH; PETZ, 1999). Em pacientes com AHAI que necessitam de terapia transfusional, aloanticorpos não detectados podem ser a causa do aumento de reações transfusionais hemolíticas, muitas vezes falsamente atribuídas a um aumeto na severidade da patologia de base. (BRANCH; PETZ, 1999). As investigações imuno-hematológicas utilizadas para selecionar unidades de concentrados de hemácias para pacientes com AHAI inclui testes básicos como a pesquisa de anticorpos e sua possível identificação através de painéis de hemácias comerciais e prova de compatibilidade, usando o soro do paciente (LIUMBRUNO et al., 2006), e quando necessário, até testes mais complexos, como adsorção, testes com tratamento enzimático ou químico ou associação de técnicas que permitam uma fenotipagem confiável (como a técnica de bloqueio associada à técnica de adsorção) e a identificação de aloanticorpos em misturas de auto-anticorpos.

15 13 5 Teste de coombs direto (TAD) Após descobrirem os anticorpos anti-rh, Coombs, Race e Mourant relataram como detectar anticorpos anti-rh incompletos (GIRELLO, 2002). Esses anticorpos incompletos eram anticorpos da classe IgG, que normalmente não são capazes de aglutinar eritrócitos alvos (FERREIRA; ÁVILA, 2001). Então, utilizaram uma antiglobulina humana (AGH), obtida através da imunização em coelhos, ficando conhecido como teste de antiglobulina (TAG) ou teste de Coombs. O teste de Coombs foi então, utilizado para detectar eritrócitos sensibilizados in vivo e in vitro, auxiliando no diagnóstico de doenças como doença hemolítica do recém-nascido e anemia hemolítica auto-imune (GIRELLO, 2002). A diferenciação da AHAI dos outros tipos de anemias hemolíticas (como por exemplo: anemia hemolítica causada por enzimopatia ou por hemoglobinopatias) é demonstrar a presença de anticorpos antieritrocitários e isso é realizado, inicialmente, através do TAD (GIRELLO, 2002). O TAD é normalmente utilizado por ser um teste simples, rápido e barato (NATHALANG et al., 2011) e detecta hemácias sensibilizadas in vivo e in vitro com componentes de imunoglobulina IgG e/ou frações do complemento (HARMENING, 2006). Contudo, um TAD negativo não exclui totalmente as chances de um indivíduo ter AHAI, uma vez que 2-10% desses pacientes com características clínicas de AHAI exibem um TAD negativo. Esse fenômeno pode ocorrer, pois, deve haver no mínimo 500 moléculas de IgG por eritrócito para que a sensibilidade do TAD comum em tubo possa detectá-las (THEDSAWAD; TAKA; WANACHIWANAWIN, 2011).

16 14 6 Teste da antiglobulina indireto (TAI) O uso da AGH para detectar a sensibilização de eritrócitos in vitro é chamado de Teste de Antiglobulina Indireto (TAI), também conhecido como Teste de Coombs Indireto, e é realizado em duas fases. O princípio do teste de Coombs é que globulinas anti-humanas obtidas de espécies não humanas imunizadas se ligam a globulinas humanas como IgG ou complemento livres no soro ou fixas a antígenos eritrocitários (SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA MEDICINA LABORATORIAL). Os anticorpos chamados de completos são da classe IgM e por sua estrutura pentâmera, se ligam facilmente aos antígenos eritrocitários favorecendo a aglutinação direta desses eritrócitos. Os anticorpos chamados de incompletos, como mencionado anteriormente, são da classe IgG, e por apresentar uma estrutura pequena (monômera) não são capazes de aglutinar os eritrócitos, apenas sensibilizando-os quando apresentam antígenos correspondentes. As hemácias sensibilizadas por esses anticorpos necessitam da adição da AGH para aglutinarem e assim proporcionar sua detecção ou identificação nos testes prétransfusionais.(sociedade BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA MEDICINA LABORATORIAL). 6.1 Reagentes de globulina anti-humana São em 2 tipos: antiglobulina humana poliespecífica, antiglobulina humana monoespecífica e anti-igg Antiglobulina humana poliespecífica Contém anticorpos IgG e C3d do complemento humano, podendo estar presente também outros anticorpos anticomplemento, como anti-c3b, anti-c4b ou anti-c4d. Esse tipo de AGH comercialmente preparada não contém atividade contra cadeias pesadas de IgA e IgM, porém, a mistura de soros poliespecíficos podem conter atividades de anticorpos contra cadeias leves kappa e lambda comuns a todas as classes de imunoglobulinas (SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA MEDICINA LABORATORIAL).

17 Antiglobulina humana monoespecífica Esse tipo de reagente contém apenas uma especificidade de anticorpos, podendo ser anti-igg (mais utilizado) ou anticorpos contra componentes do complemento como C3b ou C3d (SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA MEDICINA LABORATORIAL).

18 16 7 Técnicas utilizadas para detectar aloanticorpos em pacientes com TAD positivo 7.1 Adsorção Junto com os auto-anticorpos podem estar presentes também aloanticorpos (de significância clínica), caso o paciente já tenha recebido uma transfusão anteriormente ou histórico de gestação anterior (BRANCH; PETZ, 1999), levando a entender a razão pela qual a pesquisa destes é obrigatória nos testes prétransfusionais, mesmo ao apresentar um TAD positivo (LIUMBRUNO et al., 2006; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Para identificar os aloanticorpos de paciente que possui também a presença de auto-anticopos, os serviços de bancos de sangue podem abrir mão de varias técnicas entre elas a auto-adsorção, onde permite a remoção dos auto-anticorpos do soro do paciente, sendo assim possível a identificação aloanticorpos que estejam presentes no soro adsorvido (PETZ, 2004). Um número considerável de abordagens é avaliado para selecionar doadores de sangue para pacientes que necessitam de transfusão e que tem a presença de autoanticorpos quentes por causa de uma AHAI (LAWRENCE; PETZ, 2004). Geralmente, o mais eficaz é realizar o procedimento de adsorção, que permite a remoção dos auto-anticorpos do soro do paciente, sendo possível a identificação de possíveis aloanticorpos que estejam presentes no soro adsorvido (PETZ, 2004). No banco de sangue, auto-adsorção é o processo em que se realiza a retirada de auto-anticorpos presentes no soro, através da ligação (adsorção) destes com antígenos eritrocitários correspondentes em condições adequadas para isso. Realiza-se uma mistura de hemácias do próprio paciente com seu soro, incuba-se essa mistura e após a centrifugação, os anticorpos presentes são removidos do soro através da ligação aos antígenos eritrocitários (HARMENING, 2006). Utiliza-se adsorção a frio ou a quente, dependendo da classe do anticorpo presente que caracteriza o tipo do auto-anticorpo. Auto-adsorção a frio é realizada em baixas temperaturas, a 4ºC, para retirada de auto-anticorpos da classe IgM. Auto-adsorção a quente é realizado em temperaturas mais elevadas, a 37ºC e remove autoanticorpos da classe IgG. Para o procedimento de adsorção pode-se utilizar hemácias do próprio paciente (autólogas), chamando esse processo de auto-

19 17 adsorção, ou utilizar hemácias alogênicas, chamado de aloadsorção (HARMENING, 2006). A adsorção é uma técnica muito utilizada demonstrando alta eficiência para remoção dos auto-anticorpos, permitindo a utilização do soro auto-adsorvido para identificação de anticorpos e teste de compatibilidade (PETZ, 2004). Para realizar o processo de auto-adsorção as hemácias podem ser tratadas com determinados reagentes que potencializam a expressão de determinados antígenos e consequentemente melhoram a reatividade do anticorpo por esses antígenos Auto-adsorção O procedimento chamado de auto-adsorção, como mencionado anteriormente, é o método ideal para detectar aloanticorpos de alta significância clínica, uma vez que as hemácias do paciente são utilizadas para adsorver os auto-anticorpos, deixando livre os aloanticorpos no soro. Uma grande vantagem desse método é a utilização de apenas um tipo de hemácia, as do próprio paciente, diferentemente do processo de aloadsorção, uma vez que esse trabalho se tornaria muito exaustivo e trabalhoso. Outra vantagem é a quantidade de material utilizada para a realização dessa técnica. A quantidade de soro remanescente após a auto-adsorção é maior do que se utilizasse uma adsorção com mais células. Isso é consideravelmente importante, principalmente quando o volume de sangue disponível é limitado ou quando o paciente possui uma anemia severa impossibilitando a aquisição de grandes volumes de amostra. Em casos de volume limitado de amostra, a quantidade de soro remanescente poderia não ser suficiente para a realização de determinados testes, como a especificidade do anticorpo ou prova cruzada, caso fosse necessária a adsorção com várias células alogênicas (BRANCH; PETZ, 1999). A desvantagem da realização da técnica de auto-adsorção é que ela não pode ser realizada em pacientes que receberam terapia transfusional há menos de 3 meses, uma vez que hemácias alogênicas provenientes da transfusão ainda estariam presentes na circulação do paciente, tornando difícil a validade do teste (BRANCH; PETZ, 1999).

20 Aloadsorção Aloadsorção é o procedimento realizado através da adsorção de anticorpos com hemácias alogênicas fenotipicamente conhecidas para remover seletivamente um aloanticorpo (HARMENING, 2006). Nesse procedimento, utilizam-se hemácias com fenótipos conhecidos para adsorver os aloanticorpos, possibilitando a identificação de múltiplos anticorpos. Por exemplo: Usa-se uma hemácia com fenótipo Jk (a-); outros aloanticorpos se ligarão a essas células (se reagirem com antígenos presentes nessas hemácias) deixando os aloanticorpos anti-jk a livres no soro, podendo ser identificado (PETZ, 2004). O que leva a escolha de realizar auto-adsorção e/ou aloadsorção é a quantidade de amostra disponível, a gravidade da anemia do paciente e a possibilidade do paciente ter recebido transfusão há menos de 90 dias (DAS; CHAUDHARY, 2009). 7.2 Dissociação A técnica de dissociação de anticorpos consiste na remoção dos anticorpos da classe IgG da membrana dos eritrócitos com o teste de TDA positivo, mantendo intacta as hemácias, sem alterar a grande maioria dos antígenos eritrocitários. Atualmente, na rotina dos Bancos de sangue, pacientes portadores de AHAI com o teste de TDA positivo, que necessitam de transfusão de sangue e que não tenham histórico transfusional inferior a 90 dias, é indicado a realização da dissociação de auto-anticopos para podermos realizar sua fenotipagem e auto-adsorção para investigar a presença de aloanticorpos (anticorpos de significância clinica). As subtâncias utilizadas para a técnica de dissociação são: disfofato de cloroquina e ZZAP (DTT (0.2 M ditiotreitol) + papaína).(harmening, 2006) Dissociação (tratamento de hemácias com ZZAP) ZZAP é um reagente capaz de dissociar imunoglobulinas da classe IgG ligadas a membrana dos eritrócitos enquanto que, ao mesmo tempo, trata enzimaticamente as hemácias (BRANCH; PETZ, 1982). O reagente é uma mistura de DTT (0.2 M ditiotreitol) e papaína, e ao tratar as hemácias, deixa-as adequadas para procedimentos de auto-adsorção, pois reduz a quantidade de IgG presentes na membrana, deixando maior disponibilidade de locais para anticorpos, e as trata com enzima para melhorar a ligação entre antígeno e anticorpo (HARMENING, 2006).

21 19 Certo cuidado deve ser tomado ao utilizar esse tipo de reagente, pois por possuir enzimas em sua composição, o reagente ZZAP pode destruir determinados antígenos eritrocitários, como antígenos do sistema Kell, Duffy, S e s (LIUMBRUNO et al., 2006) Dissociação (tratamento de hemácias com difosfato de cloroquina) Difosfato de cloroquina é um reagente utilizado para desligar anticorpos da classe IgG que estão sensibilizando os eritrócitos (TAD positivo). A grande vantagem desse reagente e de manter intactas as hemácias, preservando os antígenos eritrocitários, como já mencionado, possibilitando o uso destas hemácias para realização de testes de auto-adsorção e ou fenotipagem que utilizam técnicas que possuem a fase de AGH. 7.3 Fenotipagem O que pode ser realizado para uma terapia transfusional mais segura é a fenotipagem das hemácias do paciente e das unidades de concentrado de hemácias a serem transfundidas, para que o processo transfusional seja fenótipo compatível (KUHN, 2006). A fenotipagem é realizada através da análise dos antígenos presentes na membrana dos eritrócitos do paciente, utilizando antissoros específicos contra determinados antígenos para selecionar unidades de hemácias com antígenos compatíveis. Essa, sem dúvida alguma, seria a mais viável técnica para ser realizada em casos de terapia transfusional em pacientes com AHAI, porém, é difícil a realização dessa técnica nesse tipo de paciente pelo fato das hemácias estarem revestidas com autoanticorpos do tipo IgG, sendo necessário o tratamento prévio dessas hemácias (BRANCH; PETZ, 1999), levando maior tempo de trabalho, e pela dificuldade de ter sempre disponível unidades de sangue com fenótipo compatível (LIUMBRUNO et al., 2006). Em busca de uma transfusão mais segura, é aconselhável realizar a fenotipagem para vários antígenos de significância clínica (fenótipo estendido, como ex. D, C, E, c, e, K, Jk a, Jk b, Fy a, Fy b, S e s) em busca de sangue compatível (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Isso faz com que esse procedimento se torne difícil em um paciente nessas condições, sendo necessária a realização prévia da dissociação de autoanticorpos de seus eritrócitos. (PETZ, 2004).

22 20 A fenotipagem parcial, onde é realizada para apenas alguns antígenos, como ex. Rh e Jk a, forneceria proteção apenas contra esses antígenos, e as chances do indivíduo desenvolver uma reação transfusional hemolítica é maior (PETZ, 2004). Devido ao fato mencionado, é necessária a realização de uma fenotipagem estendida. 7.4 Diluição Uma outra técnica que pode ser utilizada é a diluição do soro do paciente, em uma proporção de 1:5 com salina tamponada com fosfato, descrita por Oyen e Angeles, na tentativa de minimizar a quantidade de auto-anticorpos ali presentes, para depois utilizá-lo para passar em um painel de hemácias com fenótipo conhecido para possível identificação dos aloanticorpos (LEGER; GARRATY, 1999). Isso poderia ser realizado quando ocorre certa discrepância entre a quantidade de autoanticorpos com relação a aloanticorpos, sendo viável quando há uma reação fraca dos primeiros e uma reação forte dos segundos. Mesmo sendo uma técnica simples e barata, não é garantido que isso ocorra (não sendo possível a confirmação da presença de uma menor quantidade de auto-anticorpos com relação aos aloanticorpos), é uma técnica muito incerta (PETZ, 2004). A realização das técnicas que são utilizadas em caso de pacientes com AHAI, que apresentam auto-anticorpos quentes e que possivelmente apresentam um aloanticorpo mascarado pelos autos, levam tempo para serem realizadas, trazendo problemas para transfusões consideradas de urgência (PETZ, 2004). Nesses casos, há relatos na literatura sugerindo utilizar a técnica de diluição na tentativa de selecionar unidades para transfusão em menor quantidade de tempo. Quando a técnica de diluição não trouxer solução, a transfusão de fenótipos parcialmente compatíveis tem sido outra sugestão (LIUMBRUNO et al., 2006). Ao mesmo tempo que se sabe da pouca confiabilidade que essas técnicas trazem e o alto risco do paciente em desenvolver uma reação transfusional hemolítica, atrasar a transfusão pode levar o paciente a correr risco de vida. Cabe ao serviço transfusional a informação de um caso de transfusão desse tipo para o clínico, ficando a este a responsabilidade da decisão (PETZ, 2004) (GIRELLO, 2002).

23 21 8 Conclusão De acordo com o levantamento bibliográfico, conclui-se que diferentes procedimentos podem ser utilizados para selecionar unidades de concentrado de hemácias para pacientes com AHAI que necessitam receber transfusão, e esses procedimentos serão realizados de acordo com a situação apresentada pelo paciente. O ideal seria a realização de uma transfusão planejada, onde se teria tempo suficiente para se obter hemácias para a realização das provas que necessitam de testes complementares, como auto-adsorção, dissociação de anticorpos, fenotipagem e detecção de aloanticorpos através de técnicas que utilizam a fase de AGH. Outros métodos são obtidos na literatura, como a diluição do soro do paciente para reduzir a quantidade de auto-anticorpos e assim identificar os aloanticorpos presentes e a transfusão de concentrado de hemácias totalmente fenotipadas de acordo com as hemácias do paciente. Porém, há controvérsias a respeito da técnica de diluição, por não permitir a diluição de soros com altos títulos de auto-anticorpos e a respeito da fenotipagem, pela impossibilidade de fenotipar pacientes com AHAI que recebem frequentemente transfusões de concentrados de hemácias Em casos em que não é possível a identificação de aloanticorpos no soro de pacientes com AHAI pela presença de auto-anticorpos, e que também não é possível a realização de fenotipagem eritrocitária, e que esses casos não são de urgência, pode-se utilizar a biologia molecular para distinguir o fenótipo do paciente através da análise de genotipagem. Dessa forma, seria possível analisar adequadamente quais antígenos presentes em seus eritrócitos, podendo selecionar unidades compatíveis, tornando a terapia transfusional um procedimento com menores riscos aos pacientes com AHAI.

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