Vívian Paulino Figueiredo

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1 Vívin Pulino Figueiredo A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypnosom cruzi AGRAVA O DESENVOLVIMENTO DE LESÕES ATEROSCLERÓTICAS EM CAMUNDONGOS APOE -/- Ouro Preto Mrço de 2012

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS A INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO Trypnosom cruzi AGRAVA O DESENVOLVIMENTO DE LESÕES ATEROSCLERÓTICAS EM CAMUNDONGOS APOE -/- Vívin Pulino Figueiredo Orientdor: Prof Dr. André Tlvni Dissertção presentd o progrm de Pós-grdução em Ciêncis Biológics do núcleo de pesquiss em Ciêncis Biológics d Universidde Federl de Ouro Preto, como prte integrnte dos requisitos pr obtenção do título de mestre em Ciêncis Biológics, áre de concentrção: Imunologi de protozoários. Ouro Preto Mrço de 2012

3 F475i Figueiredo, Vivin Pulino. A infecção experimentl pelo Trypnosom cruzi grv o desenvolvimento de lesões terosclerótics em cmundongos poe -/- [mnuscrito] / Vivin Pulino Figueiredo f.: il., color; grfs.; tbs. Orientdor: Prof. Dr. André Tlvni. Dissertção (Mestrdo) - Universidde Federl de Ouro Preto. Instituto de Ciêncis Exts e Biológics. Núcleo de Pesquiss em Ciêncis Biológics. Progrm de Pós-grdução em Ciêncis Biológics. Áre de concentrção: Imunobiologi de Protozoários. 1. Trypnosom cruzi - Teses. 2. Aterosclerose - Teses. 3. Doenç de Chgs - Teses. 4. Apolipoproteín E (ApoE) - Teses. I. Universidde Federl de Ouro Preto. II. Título. CDU: : Ctlogção: sisbin@sisbin.ufop.br

4 Feliz quele que trnsfere o que sbe e prende o que ensin. Cor Corlin

5 Dedictóri A minh mãe Altir e meus irmãos Anderson, Alessndro e Leiline pelo mor e doção. Vocês são rzão do meu viver. IV

6 Dedictóri Agrdeço Deus por estr o meu ldo. Á minh mãe Altir, pelo mor, doção e sensibilidde. Aos meus irmãos Anderson, Leiline e Alessndro, pel mizde e poio. Amo muito todos vocês! Ao professor André Tlvni, meu orientdor, pelos ensinmentos, mizde, crinho, gentilez, suporte e por estr sempre presente. Aos professores Mri Terezinh Bhi, Mri do Crmo Gouvei Pelluzio e Wnderson Gerldo de Lim pelos ensinmentos e colborção neste trblho. As minhs migs e migos do lbortório de doenç de Chgs e Ptologi, em especil Mír, Tssine, Mgn, Guilherme, Isbel, Gleisine e Kelvinson, pel mizde, jud e bons momentos! A Lís e Diógenes pel mizde e colborção no trblho. Aos meus migos de Ouro Preto, em especil, Mrin, Lívi, Victor, Frncisco, Áure, Lucin e Crlinhos pel compnhi e mizde. Aos recentes professores Girley Frncisco Mchdo de Assis e Ivo Sntn Clds, pelo bom humor e poio. Aos professores Mrt de Ln, Evndro Mchdo e os demis professores do Nupeb pelos conhecimentos trnsmitidos. Ás técnics do lbortório An Slomé, Dniel e Ludmill, pel jud e disposição. Aos migos de Ouro Brnco, muits suddes. Ao lbortório de Bioquímic Nutricionl d UFV, pelo uxílio e colborção neste trblho. Aos lbortórios d UFOP, por disponibilizr regentes e equipmentos qundo necessários. Ao Tigo que mesmo distnte, me pói em tudo que eu fço. A CAPES pel concessão d bols. Enfim todos que contribuírm diret e indiretmente pr relizção deste trblho. V

7 Sumário 1.0. Introdução O Trypnosom cruzi: spectos biológicos e infecção A doenç de Chgs: epidemiologi e crcterizção Respost inflmtóri n infecção pelo Trypnosom cruzi A terosclerose: spectos geris e crcterizção A terosclerose n doenç de Chgs Objetivos Objetivo gerl Objetivos específicos Mteril e Métodos Animis Infecção e prsitemi Quntificção dos níveis de colesterol totl, triglicerídeos e HDL plsmáticos Quntificção dos níveis de lipídeos totis, colesterol totl e triglicerídeos hepáticos Quntificção dos níveis de lipídeos totis e colesterol totl fecl Ensio imunoenzimático ELISA Histologi Análise histoptológic e morfométric do corção Áre de ninhos de mstigot Análise histoptológic e morfométric ds lesões órtics Análise esttístic dos ddos...30 VI

8 Sumário 4.0. Resultdos Mortlidde e prsitemi Vrição do peso corporl Relção entre o peso do fígdo e o peso corporl Dosgem de colesterol totl, HDL e triglicerídeos plsmáticos Dosgem de lipídeos totis, colesterol totl e triglicerídeos hepáticos Dosgem de lipídeos totis e colesterol totl fecl Dosgem plsmátic de MCP1 (CCL2) e RANTES (CCL5) Análise morfométric e morfológic do corção Análise do prsitismo crdíco Aspecto histológico d ort Quntificção de colágeno ns lesões órtics Discussão Conclusão Referêncis bibliográfics...58 VII

9 List de Figurs Figur 1. Curv de prsitemi...31 Figur 2. Curv de sobrevivênci...32 Figur 3. Avlição do colesterol totl, triglicerídeos e HDL plsmáticos...36 Figur 4. Avlição de lipídeos totis, colesterol totl e triglicerídeos hepáticos...37 Figur 5. Avlição de lipídios e colesterol totl fecl...38 Figur 6. Síntese de MCP-1-CCL2 e RANTES-CCL Figur 7. Análise histoptológic do corção...41 Figur 8. Análise morfométric d celulridde crdíc...42 Figur 9. Prsitismo crdíco...43 Figur 10. Aspecto histoptológic d ort...45 Figur 11. Áre d lesão terosclerótic n ort...46 Figur 12. Aspecto Histológico do conteúdo de colágeno...47 Figur 13. Quntificção de colágeno ds lesões n ort...48 VIII

10 List de Tbels Tbel 1. Médi de peso de nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/-, não infectdos, infectdos com s ceps Berenice 78 (Be 78) e Colombin do Trypnosom cruzi durnte qutro semns...33 Tbel 2. Médi d relção entre o peso do fígdo e o peso corporl dos nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/- não infectdos, infectdos com s ceps Berenice 78 (Be 78) e Colombin do Trypnosom cruzi durnte qutro semns...34 Tbel 3. Médi dos níveis de colesterol totl, colesterol HDL e triglicerídeos dos nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/- ntes d infecção...35 IX

11 Resumo A respost inflmtóri sistêmic desencded por lguns gentes infecciosos exercem efeitos pró-terogênicos vi produção e ção de medidores inflmtórios sobre prede vsculr. Nesse contexto, infecção desencded pelo protozoário Trypnosom cruzi present um cráter inflmtório responsável pelo desenvolvimento de inúmers mnifestções crdiovsculres enqunto terosclerose, doenç crônico-degenertiv, tmbém é cpz de ocsionr obstrução de rtéris pelo cúmulo de lipídeos em sus predes trvés de um evento inflmtório locl. A sber, polipoproteín E (poe) é principl glicoproteín responsável pelo trnsporte e metbolismo de colesterol e triglicerideos, sendo um constituinte ds lipoproteíns VLDL, HDL e quilomícrons. Neste estudo vlimos interferênci d poe no desenvolvimento ds lesões crdiovsculres em cmundongos C57BL/6 (n=28) e poe knockout/ -/- (n=28) com 10 semns, infectdos pels ceps Berenice 78 (Be 78) e Colombin do T. cruzi. Avliou-se dirimente prsitemi e semnlmente o peso dos nimis. Antes e pós 30 dis de infecção, coletouse sngue pr dosgens bioquímics (colesterol totl, colesterol HDL e triglicérideos) e imunológics (CCL2/MCP-1 e CCL5/RANTES). Após eutnási, o fígdo e s fezes form utilizdos pr extrção e quntificção dos lipídeos totis e o rco órtico, juntmente com o tecido musculr crdíco, pr vlições morfométrics. Observou-se um menor período pré-ptente nos nimis selvgens (di 9) em relção os poe -/- (di 12), sendo que nestes últimos prsitemi foi menor pr mbs s ceps estudds. Não houve diferenç no peso dos nimis entre os grupos, ms o colesterol totl e os triglicerídeos plsmáticos mostrrm-se elevdos no grupo poe -/-. Em relção à genétic do prsito, cep Be 78 nos nimis poe -/- mostrou-se ssocid o umento dos lipídeos fecis, enqunto cep Colombin neste mesmo grupo presentou-se ssocid níveis elevdos de triglicérideos plsmáticos. N nálise plsmátic de quimiocins, verificou-se elevd produção de CCL2 e CCL5 em todos os nimis infectdos, porém pens com cep Be 78, vlid em nimis poe -/-, houve um redução dos níveis séricos de CCL5. Observou-se umento de céluls inflmtóris no tecido crdíco, bem como de prsitos teciduis, no grupo infectdo com cep Colombin. Em relção à terogênese, o grupo poe -/- infectdo por est cep, presentou miores áres de lesão e lterções no conteúdo de colágeno. Estes ddos sugerem que infecção experimentl pelo T. cruzi interfere no desenvolvimento de lesões terosclerótics em cmundongos poe -/-, ssim como n produção de medidores inflmtórios plsmáticos e de lguns tipos lipídicos. A nálise e compreensão d interferênci d poe n ptogênese crdíc d doenç de Chgs ssocido à vribilidde genétic do prsito constituirão importntes elementos pr estudos futuros envolvendo respost inflmtóri crdiovsculr. Plvrs chve: Trypnosom cruzi, terosclerose, polipoproteín E... X

12 Abstrct Inflmmtory effects induced by photogenic orgnisms my exert pro-therogenic effects thought inflmmtory meditors in the vsculr wlls. In this context, the protozon Trypnosom cruzi is responsible for the development of inflmmtory crdiovsculr events while therosclerosis, chronic degenertive disese, leds to clogged rteries, by the ccumultion of lipids in their wlls, lso induced by inflmmtory events. Apolipoprotein E (poe) is mjor glycoprotein responsible for the trnsport nd metbolism of cholesterol nd triglycerides, being constituent of VLDL, HDL, nd chylomicrons. This study evluted the interference of poe in the development of crdiovsculr lesions in C57BL/6 (n = 28) nd C57BL/6 Apo E-knockout/ -/- (n = 28) t 10 weeks, infected with the Berenice-78 strins (Be 78) nd Colombin of T. cruzi. Dily prsitemi nd weekly weight of nimls were performed nd, before nd fter 30 dys of infection, blood ws collected by biochemicl (totl cholesterol, HDL cholesterol nd triglycerides) nd immune (CCL2/MCP-1 nd CCL5/RANTES) ssys. After euthnsi, liver nd feces were used for extrction nd quntifiction of totl lipids nd ortic rch nd crdic muscles collected to morphometric nlysis. There ws lower pre-ptent period in the wild group (9 dys) compred to the poe -/- (12 dys). There ws no difference in weight between the groups of nimls nd totl cholesterol nd triglycerides were elevted in the group poe -/-. Regrding the genetics of prsite strin Be-78 nimls in poe -/-, it ws ssocited with incresed fecl lipids, while the Colombin strin in this sme group showed elevted levels of plsm triglycerides. In the nlysis of plsm chemokines, there ws high production of CCL2 nd CCL5 in ll infected nimls, but only with the Be 78 strin, evluted in poe -/- nimls, it ws detected reduction in plsm levels of CCL5. The inflmmtory infiltrtion nd prsites in the infected crdic tissues ws observed minly in the group infected with Colombin strin. In reltion to therogenesis, poe -/- group infected with Colombin strin hd lrger lesions nd chnges in the collgen content. These dt suggest tht the experimentl infection with T. cruzi interferes with the development of therosclerotic lesions in poe -/- mice s well s in plsm production of inflmmtory meditors nd some types of lipid. The nlysis nd understnding of the interference of poe in the pthogenesis of Chgs hert disese, s well s possible links with the genetic vribility of the prsite, constitute importnt elements for future studies involving crdiovsculr inflmmtory response. Key words: Trypnosom cruzi, therosclerosis, polipoprotein E. XI

13 Introdução 1.0. Introdução 1.1. O Trypnosom cruzi: spectos biológicos e infecção O Trypnosom cruzi é um protozoário intrcelulr flgeldo d ordem Kinetoplstide, sendo ssim clssificdo por presentr em su estrutur intern um orgnel conhecid por cinetoplsto ric em DNA. Este prsito está entre os mis bem sucedidos protozoários ptogênicos em termos de su diversidde populcionl, virulênci e cpcidde de infectr vários tipos celulres (Rmirez et l, 1998). Seu desenvolvimento pode ser observdo no tritomíneo e em céluls do hospedeiro vertebrdo infectdo. O processo de desão e invsão d célul hospedeir envolve prticipção de diverss moléculs de superfície do prsito ncords n membrn por moléculs de GPI - glicosilfosftidilinositol (Previto et l, 1985; Yoshid et l, 1989). A populção do T. cruzi é muito heterogêne, o que pode ser observdo pel diversidde de crcterístics encontrds entre diferentes ceps deste prsito (Brener e Chiri, 1963; Brener, 1965). O prsito se present com morfologi crcterístic de mstigot, epimstigot, forms de trnsição e tripomstigot. Tripomstigots metcíclics são s forms infectntes pr o hospedeiro vertebrdo. A presenç de tripomstigots snguíneos com diferentes morfologis já hvi sido ssinldo por Chgs em 1909, que tribuiu o fenômeno o significdo de dimorfismo sexul. Esss forms podem ter influênci no desenvolvimento d doenç, visto que foi demonstrdo que forms delgds penetrm mis rpidmente ns céluls do hospedeiro e são mis susceptíveis os mecnismos imunes, enqunto que s forms lrgs persistem por mis tempo no sngue periférico, sendo portnto mis resistentes os ftores imunológicos do hospedeiro (Brener, 1969). Muitos estudos de crcterizção biológic demonstrm que s ceps do T. cruzi possuem diferentes comportmentos em nimis de lbortório, como níveis de prsitemi, histiotropismo e indução de vrids txs de mortlidde (Tliferro e Pizzi 12

14 Introdução 1955; Dene et l, 1963; Andrde e Mglhães 1997). A combinção de vários ftores como possível seleção de ceps e clones, ftores mbientis e imunológicos poderim explicr o comportmento biológico do prsito (Andrde et l, 1970; Bice e Zeledón 1970; Mglhães et l 1996). O T. cruzi possui um grnde diversidde genétic, sendo estuddo por diversos mrcdores. Em 1999 especilists chegrm um consenso propondo unificção ds váris clssificções existentes, dividindo s ceps de T. cruzi em dois grndes grupos, T. cruzi I e T. cruzi II, que coincidem com dicotomi isoenzimátic propost desde o finl dos nos setent (Anonymous, 1999). A interção do prsit com o hospedeiro, os processos de invsão e o desenvolvimento intrcelulr são importntes n determinção d colonizção dos tecidos (Andrde et l, 2010). Em estudos com cmundongos inoculdos com cep Berenice 78, isold por xenodignóstico de um pciente, observou-se polimorfismo com predomínio de forms lrgs (Ln e Chiri, 1986), sendo tulmente pertencente DTU IIb- DiscreteTypingUnits (Brisse, 2000; Zingles, 2009), com tropismo pr céluls crdícs e esquelétics (Tfuri e Brener, 1966). Semelhntemente, cep Colombin em cmundongos (Federici et l, 1964), isold por meio de hemocultur de um cso humno n fse crônic d infecção n Colômbi, present predomínio de forms lrgs o longo d infecção, tropismo musculr crdíco e esquelético; present tmbém ltos picos de prsitemi entre 20 e 30 dis de infecção, sendo tulmente pertencente DTU I (Brisse, 2000; Zingles, 2009). A infecção pelo T. cruzi é nturlmente inicid n cmd dérmic ou mucos conjuntivl por tripomstigosts metcíclics depositds junto às fezes ou urin de tritomíneos durnte o seu repsto snguíneo. Nos hospedeiros vertebrdos o curso d infecção é extremmente vriável, sendo influencido pels crcterístics d populção de prsits, comportmento do hospedeiro e ftores mbientis (Brener, 1979). Entretnto, o T. cruzi pode ser trnsmitido o homem por mecnismo lterntivo, normlmente, trnsfusão snguíne, trnsmissão congênit, infecção cidentl de lbortório, trnsplnte de órgãos e trnsmissão orl (Dis e Brener, 1984; Brener 1984; Brener, 1989; Dis, 1992; 13

15 Introdução Dis et l, 2008 e 2009; Nobreg et l, 2009), tlvez est últim form mis primitiv de trnsmissão, ocsionndo ssim doenç de Chgs A doenç de Chgs: epidemiologi e crcterizção A doenç de Chgs (DC) constitui ind um sério problem de súde n Améric Ltin, cusndo proximdmente 10 mil mortes por no. Estim-se que 10 milhões de pessos estejm infectds em todo o mundo (WHO, 2010). A distribuição geográfic d infecção chgásic, incluindo os seus reservtórios e seus vetores (tritomíneos hemtófgos brbeiros ), estende-se desde o sul dos Estdos Unidos té o sul d Argentin, onde cerc de 90 milhões de pessos encontrm-se exposts à infecção (Cour e Dis, 2009). A incidênci d DC tem reduzido devido às cmpnhs de súde públic pr errdicção do vetor e do melhor controle de qulidde ds trnsfusões de sngue e derivdos (Moncyo, 2003 e 2009). Atulmente questão prioritári está voltd pr o contingente de pessos já infectds pelo T. cruzi (Medei et l, 2008). A doenç de Chgs é dividid em dus fses, gud e crônic, podendo ser sintomátic ou não. A fse gud é mrcd pel presenç de tripomstigots no sngue do pciente e possui durção vriável tnto n infecção humn qunto n experimentl (Prt, 1994). As mnifestções clínics d fse gud d doenç em humnos inicim 6 10 dis pós inoculção, podendo permnecer por 6 8 semns. Frequentemente, certs mnifestções de port de entrd podem estr presentes n conjuntiv oculr e n pele. As mnifestções sistêmics podem incluir febre, edem, linfdenopti, lterções eletrocrdiográfics e umento d áre crdíc (Brener, 1987). Após fse gud, miori dos indivíduos infectdos pelo T. cruzi é conduzid pr um fse ltente d doenç, tmbém conhecid como form crônic indetermind, permnecendo sem mnifestção clínic detectável por décds ou pel vid tod. Por outro ldo, outros indivíduos podem, imeditmente pós fse gud ou pós form crônic indetermind, desenvolver sintoms e sinis clássicos (proximdmente 35% dos 14

16 Introdução indivíduos crônicos) como tquirritmis, brdirritmis, lterções no sistem nervoso utonômico, lterções n motilidde esofágic e intestinl (qudro de megesôfgo e megcólon) e eventos progressivos crdiovsculres levndo o qudro conhecido como crdiopti chgásic crônic (Roch et l, 2007). Ess crdiopti present um cráter inflmtório progressivo, fibrosnte e debilitnte, fetndo o rcbouço estruturl e funcionlidde do corção. O qudro inflmtório nos diversos órgãos de cometimento present relção diret com presenç de prsitos (ruptur dos ninhos de mstigots) e com predominânci de céluls mononucleres próxims ds céluls prsitds rompids (Andrde et l, 2000). A respost inflmtóri pós infecção pelo prsito é essencil pr resistênci do hospedeiro (eliminção do prsito), ms tmbém torn-se primordil pr gerção dos eventos ptológicos nos diferentes órgãos de cometimento, crcterístic observd durnte o curso d doenç Respost inflmtóri n infecção pelo Trypnosom cruzi A principl respost do hospedeiro em relção infecção pelo T. cruzi é de nturez inflmtóri. Em estudos utilizndo modelos experimentis infectdos por diferentes ceps do T. cruzi, foi determindo o ppel de inúmeros medidores inflmtórios potencilmente cpzes de promover proteção contr o prsito, ms tmbém desencder um respost inflmtóri condutor do processo de remodelmento crdíco nesses nimis (Guedes et l, 2010; Pul Cost et l, 2010; Melo et l, 2011). Bsicmente, respost inflmtóri inicil à infecção pelo T. cruzi é coordend por céluls do sistem mononucler fgocitário que respondem os ntígenos do prsito trvés de um vi dependente de receptores do tipo Toll (TLR)-Myd88 (Cmpos et l, 2004). Ess tivção origin citocins próinflmtóris como IL-12 e TNF-lf que, por su vez, fcilitm polrizção ds céluls TCD4 + e CD8 + em produtors de IFN-gm (Cmpos et l, 2004; Tlvni e Teixeir 2011). O IFN-gm produzido tnto por céluls d respost imune int (ex. Nturl killer cells) qunto por céluls T, em concomitânci com o próprio TNF-lf, induzem produção de 15

17 Introdução óxido nítrico por mcrófgos, trvés d vi d L-rginin tundo ssim, no controle e n morte diret desses prsitos (Silv et l, 2003). Durnte fse inicil d doenç, prticipção diret ds céluls TCD8 +, bem como do repertório de imunoglobulins ntimoléculs do T. cruzi e ds citocins de perfil Th1, Th2 e Th17, precem ser cruciis pr o início do processo inflmtório gerdor d crdiopti chgásic (Bilte et l, 2008). Por outro ldo, IL-4 e IL-10 presentm umento d expressão no tecido crdíco durnte fse crônic d infecção, sugerindo ppéis reguldores pr ests citocins n imunidde medid por céluls. Medinte ess interção inicil entre prsito e hospedeiro, respost inflmtóri no sítio inflmtório crdíco poderá gerr um respost moderd ou grve, ocsionndo em lguns csos flênci funcionl do órgão ou mesmo morte do hospedeiro. As quimiocins presentm um ppel importnte nesse processo inflmtório sítiodependente por exercer função de recrutmento leucocitário. Recentemente, foi demonstrdo que o T. cruzi é cpz de induzir produção de quimiocins por mcrófgos vi receptor Toll (TLR-2), tnto in vitro qunto in vivo (Coelho et l, 2002; Crrer-Silv et l, 2008). De cordo com o perfil de quimiocins produzids durnte infecção hverá formção de um infiltrdo inflmtório no miocárdio com fenótipos celulres específicos (ex. mcrófgos, céluls T CD8 + ), controlndo dess form replicção prsitári, ms lesndo tmbém o tecido do miocárdio. Algums quimiocins já form bem crcterizds pr doenç de Chgs experimentl, como MCP-1 (CCL2), RANTES (CCL5), MIP1- lf(ccl3); sendo prte desss proteíns reguld pelo IFN-gm no sítio d respost inflmtóri (Tlvni et l, 2000; Roffe et l, 2010). Quimiocins têm hbilidde de tivr mcrófgos e crdiomiócitos produzir óxido nítrico pr combter o T. cruzi. Assim CCL5 e CCL3 qundo bloqueds prejudicrim temporrimente o controle d replicção do T. cruzi (Roffê et l, 2010). CC-quimiocins preferencilmente trem céluls mononucleres pr locis de inflmção crônic e ests predominm em lesões de pcientes com doenç de Chgs. Em diferentes modelos murinos de infecção gud e crônic pelo T. cruzi, umento dos níveis do mrna de quimiocins (CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES) foi observdo no tecido crdíco ssocido à formção do infiltrdo inflmtório (Tlvni et l, 2000; Pul Cost et l, 2010). Petry et l 2002, utilizndo 16

18 Introdução nticorpos neutrlizntes mostrrm que quimiocin CCL3/MIP1-lf está envolvid no recrutmento de mcrófgos durnte infecção gud. Contudo, são necessários mis estudos pr se compreender o ppel ds quimiocins n migrção diferencil ds populções celulres n infecção pelo T. cruzi. Múltiplos ftores contribuem pr os eventos crdiovsculres n doenç de Chgs, ms respost imune do hospedeiro e o pdrão genético do prsito precem contribuir pr definição do prognóstico clínico tnto em humnos, qunto em modelo experimentl (Henriksson et l, 1993;Tlvni et l, 2000; Roch et l, 2007). Estudos em cmundongos crcterizndo o infiltrdo celulr e ssocição d produção de citocins no corção n infecção experimentl pelo T. cruzi, demonstrrm mudnçs endoteliis órtics como elevd expressão de ICAM-1, IL-6 e TNF-lf, com um ssocid inflmção n dventíci consistindo principlmente de céluls CD4+ e CD8+ e mcrófgos (Sunnemrk et l, 1996). Est infecção provoc lterções n circulção micro e mcrovsculr e sever crdiopti e embor lguns estudos em humnos demonstrem incidênci de terosclerose em pcientes chgásicos, nenhum ligção ind foi provd (De Moris et l, 1989; Bestetti et l, 1992; Reis et l, 1995; Crvlho, 2011). Efeitos pró-terogênicos induzidos pel infecção experimentl pelo T. cruzi, podem estr relciondos com inflmção sistêmic e efeitos diretos sobre prede vsculr (Sunnemrk et l, 2000). De cordo com um importnte hipótese, lipoproteíns de bix densidde oxidds são ftores importntes no desenvolvimento d doenç terosclerótic (Steinberget l, 1989). O ppel d inflmção tem despertdo bstnte tenção no contexto d doenç terosclerótic, desde que est é um inflmção d prede vsculr, n qul mcrófgos /monócitos e céluls T são bundntes (Ross, 1993). A loclizção de mbos, linfócitos e mcrófgos, no terom humno sugere que respost imune poss contribuir pr ptogênese ds lesões terosclerótics (Lichtmn, 1996; Hnsson, 1997; Libby, 2000). Um detlhd crcterizção do terom humno têm determindo que ests céluls se loclizm em lesões recentes durnte ptogênese, sendo trdimente ssocids 17

19 Introdução com lesões instáveis (Libby, 2000). Entretnto terosclerose é considerd um doenç inflmtóri crônic e infecções sistêmics têm um importnte ppel n inicilizção e perpetução d ptologi ns lesões terosclerótics (Portugl et l, 2004) A terosclerose: spectos geris e crcterizção A terosclerose é um doenç crônico-degenertiv que se crcteriz pel grdul diminuição d luz vsculr, seguid por um obstrução ds rtéris devido o cúmulo de lipídeos em sus predes, o que reduz ou impede o fluxo snguíneo (Lefcovitz, 2001) ocsiondo hipóxi ou isquemi o órgão. Lipídeos são utilizdos in vivo pr diversos propósitos como fontes de energi e moléculs biologicmente tivs, lém de serem importntes constituintes ds membrns e outrs estruturs celulres (Stryer, 1995). As espécies moleculres de lipídeos presentes no plsm, essenciis do ponto de vist fisiológico e clínico, são os ácidos grxos, os triglicerídeos, os fosfolipídeos e o colesterol (Weiss, 1993; Montgomery, 1996). Os ácidos grxos podem ser sturdos, mono ou poliinsturdos, os triglicerídeos são s forms de rmzenmento energético mis importntes no orgnismo, os fosfolipídeos têm, entre outrs funções, formr bicmd lipídic que é estrutur básic ds membrns celulres e o colesterol é precursor dos hormônios esteróides, dos ácidos bilires e d vitmin D, lém de ter importntes funções ns membrns celulres, influencindo su fluidez e o estdo de tivção de enzims ligds membrns. As lipoproteíns plsmátics são moléculs formds de lipídeos (principlmente fosfolipídeos, colesterol livre, ésteres de colesterol e triglicerídeos) e proteíns específics denominds de polipoproteíns. Ests prtículs estão em constnte estdo de síntese, degrdção e remoção no plsm, tendo um grnde importânci biológic, não somente no trnsporte de lipídeos, ms tmbém no envolvimento em processos diversos como reções imunes, cogulção snguíne e repro de tecidos (Ross, 1995). A polipoproteín E 18

20 Introdução (poe) é principl glicoproteín responsável pelo trnsporte de lípideos no orgnismo, sendo um constituinte ds lipoproteíns VLDL, HDL e quilomícrons (Stryer, 1995). O umento ds lipoproteíns (LDL, IDL, VLDL e quilomícrons remnescentes) no plsm cus turbulêncis hemodinâmics ocsionndo um disfunção endotelil com umento d permebilidde d cmd íntim às lipoproteíns plsmátics fvorecendo retenção dests no espço subendotelil. Um vez retids, s prtículs de LDL sofrem oxidção cusndo exposição de diversos neo-epítopos imunogênicos. Assim, devido um tivção endotelil ocorre um recrutmento de leucócitos e, conseqüentemente, formção de um centro de desenvolvimento e progressão de plcs terosclerótics resultndo em complicções clínics (Petrovn et l, 2007). A ingestão indequd de nutrientes, com bixos níveis de colesterol HDL e ltos de LDL dentre outros ftores, são importntes ftores de risco pr doençs crdiovsculres, onde diet tem importnte ppel n determinção dos níveis lipidêmicos (Cervto et l, 1997). Os eventos d terosclerose tem sido muito esclrecidos por estudos em modelos nimis, incluindo coelhos, porcos, primts não-humnos e roedores. Cmundongos deficientes em poe ou ind lipoproteín de bix densidde (LDL) podem desenvolver lesões vnçds e são os modelos mis usdos em estudos genéticos e fisiológicos (Pelluzio et l, 2001; Dugherty et l, 2002; Resende et l, 2011; Ye et l, 2011; Rong et l, 2012). A primeir mudnç identificd n prede d rtéri é o cúmulo de prtículs de lipoproteíns e seus gregdos n íntim ds rtéris, em locis de predileção d lesão. Neste processo, os monócitos podem se derir à superfície do endotélio e então migrr trvés d monocmd endotelil pr íntim, onde eles proliferm, se diferencim em mcrófgos e fgocitm principlmente LDL oxidd, formndo céluls espumoss. A morte desss céluls pode levr necrose e secreção de elementos fibrosos pels céluls do músculo liso, plcs oclusivs fibross podem se desenvolver e umentr de tmnho. Inicilmente, s lesões crescem em direção à dventíci té que um ponto crítico é tingido, depois disso começm se expndir e invdir o lúmen. As lesões continum crescer pel migrção de novs céluls mononucleres do sngue, que é compnhd por proliferção 19

21 Introdução celulr, produção de mtriz extrcelulr e do cúmulo de lipídios extrcelulres. A terogênese pode ser vist como um "respost à lesão", com lipoproteíns, céluls inflmtóris e outros ftores de risco como gentes prejudiciis (Lusis, 2000). A miori dos ftores de risco clássicos pr terosclerose têm sido relciondos mudnçs ns concentrções de diferentes biomrcdores de mtriz extrcelulr e nos critérios do escore de Frminghm (tbel de vlição de risco crdiovsculr) (Sundstrom et l (1 e 2), 2004). Apesr dos mecnismos cusdores por esse processo não estrem clros, os ftores de risco poderim modulr estrutur vsculr e estbilidde de plcs, que por su vez influencirim s concentrções de MMP (mtriz metloproteinse) e TIMP (inibidores de metloproteinses), ou trvés de modificções n produção de colágeno (Rodriguez et l, 2007). Defeitos n síntese e n seprção d mtriz extrcelulr são processos chve no desenvolvimento d terosclerose e complicções trombótics. Correlções têm sido observds entre níveis circulntes de biomrcdores de mtriz extrcelulr, mnifestções clínics e ftores de risco pr terosclerose (Rodriguez et l, 2007). 1.5 A terosclerose n doenç de Chgs As doençs crdiovsculres são s principis cuss de morte no mundo ocidentl, sendo que no Brsil ocsionm 27,22% dos óbitos registrdos n populção. Dos pcientes chgásicos, estudos mostrm que proximdmente 56% d populção possuem lgum nível de lesão terosclerótic, levndo o óbito 30 40% dos pcientes (Mrin-Neto, 2007). A miori ds doençs crdiovsculres é resultnte de complicções d terosclerose, embor prte d populção cbe não desenvolvendo doenç. Nos sintomáticos el pode ter sido inicid nos primeiros nos de vid, desenvolvendo-se lentmente e podendo culminr, posteriormente, em grves complicções clínics, como ulcerções e rupturs, que podem evoluir pr oclusões guds trombótics, contribuindo com lt morbidde e mortlidde. Embor o processo terosclerótico sej crcterístico d cmd íntim ds grndes e médis rtéris, inúmers lterções ocorrem tmbém n 20

22 Introdução microcirculção, primrimente decorrentes de lterções n função endotelil (Witzum e Steinberg, 1991; Shimokw, 1999). Além dos ftores já estbelecidos pr terosclerose, como hiperlipidemi, tbgismo, hipertensão, o estilo de vid e genétic do indivíduo (Strocker et l, 2004), têm se demonstrdo importânci de grvntes como infecções prlels com cometimento vsculr (Portugl et l, 2004). Os eventos inflmtórios e s infecções cusds por vírus, bctéris e/ou protozoários precem tmbém como importntes ftores de risco pr doenç terosclerótic (Sunemrk et l, 2000; Portugl et l, 2004 e 2006). Um exemplo de doenç inflmtóri cusd por protozoário é doenç de Chgs, que fet principlmente o sistem crdiovsculr (Mrin-Neto et l, 2007). No entnto, é notável que ns últims décds o intenso processo de urbnizção progressivo mudou hábitos e costumes d populção brsileir. Além dos riscos ocsionds pel infecção pelo T. cruzi o orgnismo do hospedeiro, ocorrerm ind profunds modificções de estilo de vid que levou exposição dos pcientes chgásicos os mesmos ftores de risco pr terosclerose que est sujeit o restnte d populção. Portnto, é plusível supor que doenç coronári terosclerótic tenh torndo freqüente em pcientes com doenç de Chgs (Mrin-Neto et l, 1995). Um estudo com 136 pcientes chgásicos que form submetidos cteterismo crdíco por cus de um crdiopti ssocid, encontrou obstruções coronáris hemodinmicmente significtivs em 51 destes (37%), o que reforç o conceito de que grnde prte d populção chgásic frequentemente é fetd pel terosclerose (Grzon, 1985). A região picl do ventrículo esquerdo é um região crític no corção chgásico onde neurisms, trombos ou mbos ocorrem com freqüênci (Albnesi-Filho et l, 1991; Viotti et l, 2004). N crdiopti chgásic crônic descrit em indivíduos não idosos, s lterções mcroscópics vrim de um corção prentemente norml com diltção d urícul direit té umento do peso, diltção globl do corção ssocid com hipertrofi, fibrose endocárdic n pont do ventrículo e músculos ppilres, espessmento endocárdico, lesão vorticilr com ou sem trombose intrcrdíc, crdiomegli extrem 21

23 Introdução com peso cim de 1.000g e lterções n ort, como diltção suprvlvr e formção de neurisms (Andrde Z e Andrde SG, 1955; Lopes, 1981). Lesão vorticilr e trombose intrcrdíc no ventrículo esquerdo ssocid à lesão vorticilr form encontrds somente em idosos com crdiopti chgásic crônic. Esse fto está de cordo com litertur, que descreve lesão vorticilr como típic d crdiopti chgásic, sendo considerd um ds lterções mcroscópics mis importntes pr o dignóstico d crdiopti, que, por su vez, predispõe à formção de trombose intrcrdíc (Menezes e Koberle, 1965). Estudos mostrrm que proximdmente 56% de tques súbitos em chgásicos são cusdos por crdioembolismo, portnto neurism picl, insuficiênci crdíc e rritmi mostrm ser importntes ftores de risco n gênesis do tque isquêmico relciondo com DC (Lndim et l, 2009). A presenç de ftores de risco pr doenç crdiovsculr, principlmente no contexto d doenç terosclerótic, induz mudnçs nos spectos tnto funcionis qunto morfológicos do endotélio, fcilmente levndo inflmção, trombose e vsoconstrição (Vit e Keney, 2002; Crod-Artlet l, 2005). Um endotélio disfuncionl pode ser detectdo por um desequilíbrio entre ftores de diltção e constrição, ftores pro-cogulntes e nticogulntes, tividdes estimulntes e inibitóris, relcionds com o desenvolvimento e proliferção celulr (Lndim et l, 2009; Rubnyi et l, 1993). Os prlelos entre respost inflmtóri descrit durnte infecção pelot. cruzi e respost inflmtóri envolvid n ptogênese d terosclerose gerrm questionmentos sobre interferênci do prsito no desenvolvimento e progressão ds lesões rteriis em chgásicos. Assim, lém de mplir o entendimento de como infecção pelo T. cruzi pode interferir no perfil ptológico d terosclerose, este estudo permitirá tmbém compreender interferênci d vribilidde genétic do prsito junto seu hospedeiro, elementos essenciis pr estudos futuros envolvendo respost inflmtóri crdiovsculr. 22

24 Objetivos 2.0. Objetivos 2.1. Objetivo gerl O objetivo deste trblho foi vlir interferênci de diferentes ceps do Trypnosom cruzi no desenvolvimento ds lesões terosclerótics em cmundongos selvgens e knockout( -/- ) pr polipoproteín E Objetivos específicos Avlir interferênci d poe n infecção pelo T. cruzi (quntificção de prsitos circulntes), mortlidde e vrição do peso dos nimis; Verificr os níveis hepáticos de lipídeos totis e de colesterol, pós infecção pelo T. cruzi em nimis poe -/- e selvgens. Verificr os níveis de lipídeos totis e de colesterol presentes no conteúdo fecl dos cmundongos poe -/- e selvgens pós infecção pelo T. cruzi; Determinr os níveis snguíneos de colesterol totl, triglicerídeos e colesterol HDL, em cmundongos poe -/- e selvgens por meio d dosgem enzimátic; Avlir por ensio imunoenzimático s quimiocins CCL2 e CCL5 em ssocição com infecção pelo T. cruzi em cmundongos poe -/- e selvgem; Avlir, por histologi, os prâmetros inflmtórios crdiovsculres (quntificção do infiltrdo celulr e ninhos de mstigot) e vlição do rco órtico (presenç de teroms e deposição de colágeno). 23

25 Mteril e Métodos 3.0. Mteril e métodos 3.1. Animis Neste estudo form utilizdos 56 cmundongos mchos e fêmes C57BL/6, com 10 semns de idde, peso de proximdmente 21g. Sendo, 28 nimis poe -/- e 28 selvgens. Estes nimis form locdos em giols coletivs de polipropileno, em sls climtizds e sem distinção de limentção (rção comercil pr cmundongo), sendo ofert de águ livre. Durnte todo o período experimentl os nimis permnecerm em condições controlds de luminosidde (12h clro-escuro) e tempertur (22,0±2 ºC). Os nimis form pesdos semnlmente. Os nimis form fornecidos pelo Biotério Centrl d UFV, os quis form mntidos no biotério do Lbortório de Nutrição Experimentl tmbém d UFV. Todos os procedimentos experimentis form provdos pelo Comitê de Étic em Experimentção Animl (CETEA) d Universidde Federl de Viços, protocolo número 08/ Infecção e prsitemi Form inoculdos, intrperitonelmente com 100 forms tripomstigots os seguintes grupos experimentis: (i) 20 nimis com cep Berenice 78 (10 poe -/- e 10 selvgens) e (ii) 20 nimis com cep Colombin (10 poe -/- e 10 selvgens). Form utilizdos 16 nimis como controle não infectdo (8 poe -/- e 8 selvgens). Após confirmção d infecção destes nimis foi relizd prsitemi dirimente trvés d colet de 5µl de sngue pel secção de veis superficiis d cud (Brener, 1962) e contgem diret dos prsitos circulntes em lâmin/lmínul e mortlidde entre os nimis observd. 24

26 Mteril e Métodos 3.3. Quntificção dos níveis de colesterol totl, triglicérideos e HDL plsmáticos Form dosdos os níveis de colesterol totl, triglicerídeos (TG) e HDL dos nimis ntes e 30 dis pós infecção, no plsm, tecido hepático e fezes. As determinções de colesterol totl, TG e HDL form relizds bsendo no método enzimático colorimétrico utilizndo os Kits enzimáticos colesterol totl, TG e HDL (Liquiform, Lbtest Belo Horizonte). 3.4.Quntificção dos níveis de lipídeos totis hepáticos, colesterol totl e triglicerídeos hepáticos Os nimis form submetidos eutnási com 14 semns de idde por inlção de gás CO 2. Durnte eutnási o fígdo dos nimis foi removido, lvdo em solução slin fisiológic, seco em ppel de filtro e pesdo. Foi então colocdo em ppel lumínio e mntido 80 0 C té relizção ds dosgens. Os lipídeos totis hepáticos form extrídos de cordo com o método de Folch et l. (1957). Em síntese, form pesdos 100 mg de fígdo em tubos de plástico previmente identificdos e posteriormente triturdos com 1900 µl de solução contendo clorofórmio:metnol (2:1) homogeneizndo por 3 minutos à um velocidde rpm. Após dição de 400 µl de metnol, os tubos form centrifugdos por 10 minutos 3000 rpm e o sobrendnte trnsferido pr novos tubos de vidro com peso conhecido. Posteriormente form crescentdos 800 µl de clorofórmio, 640 µl de solução de NCl 0,73% e s mostrs form novmente centrifugds por 10 minutos 3000 rpm, sendo desprezd fse superior. A prede interior de cd tubo foi lvd três vezes com 600 µl 25

27 Mteril e Métodos de solução de Folch (solução de 3% de clorofórmio, 48% de metnol, 47% de águ destild e 2% de NCl 0,29%) e os lipídeos ssim extrídos form secos em estuf overnight 37 0 C. Após verificr que os tubos estvm totlmente secos, eles form pesdos e quntidde de lipídeos extríd foi dd pel diferenç dos tubos de vidro ntes e depois de secos. Posteriormente pesgem dos tubos, os mesmos form rmzendos em freezer 80ºC pr dosgem do colesterol hepático. Pr tl, s mostrs form descongelds e ressuspendids em 500 µl de isopropnol e homogeneizds té complet solubilizção dos lipídeos. Os níveis de colesterol e derivdos form determindos d mesm form como descritos nteriormente pr o plsm. 3.5.Quntificção dos níveis de lipídeos totis e colesterol totl fecl Após eutnási s fezes form retirds do ceco dos nimis e foi rmzend em freezer 80 0 C té relizção ds dosgens. A quntificção dos lipídeos cecis foi relizd pelo método de Folch et l. (1957) e os níveis de colesterol form determindos d mesm form como descritos nteriormente. 3.6.Ensio imunoenzimático ELISA Os ensios imunenzimáticos form relizdos utilizndo-se plsm dos cmundongos infectdos ou não pelo T. cruzi. Pr o ensio form utilizdos kits pr detecção ds quimiocins CCL2 e CCL5 (R&D Systems Inc, Minnepolis, USA). Pr sensibilizção ds microplcs de 96 poços form diciondos 100µl/poço dos nticorpos monoclonis contr proteín ser dosd, diluídos em PBS contendo 0.1% de lbumin de soro bovino - BSA (SIGMA), sendo ests plcs incubds overnight à tempertur 26

28 Mteril e Métodos mbiente. Anticorpos não dsorvidos pels plcs form descrtdos, por inversão e sucessivs lvgens em PBS-Tween e s plcs bloqueds com 300µl/poço de um solução contendo PBS-BSA 1%, durnte 1 hor 37 C. A seguir s plcs form novmente lvds. Após o bloqueio form diciondos 25µl ds mostrs de plsm e de 100µl dos pdrões respectivos pr CCL2 e CCL5 (R&D Systems Inc, Minnepolis, USA). Após 2 hors de incubção relizou-se novmente o processo de lvgem e form diciondos 100µl dos nticorpos biotinildos de detecção, nti-ccl2 e nti- CCL5, usndo diferentes diluições em PBS, ph 7,4 com 1% de lbumin bovin e incubds dus hors tempertur mbiente, seguindo-se lvgem. Em seguid form diciondos 100µl/poço de estreptovidin HRP (R&D Systems Inc., Minnepolis, USA) em diluição de 1:200 em PBS com 1% de lbumin bovin e posterior incubção tempertur mbiente durnte 20 min. As plcs form novmente lvds e diciondo 100µl d solução substrto por poço (mistur diluíd 1:1 de peróxido do hidrogênio e tretrmetilbenzidin), seguido de incubção por min em tempertur mbiente. A reção foi interrompid crescentndo-se 50µl de H 2 SO 4 1M por poço. A densidde óptic foi determind utilizndo leitor de microplcs com filtro de 450ɳm. A quntificção ds citocins presentes ns mostrs foi determind utilizndo densidde óptic obtid com curv pdrão de concentrções conhecids ds citocins e nlisds pelo softwre SOFTmx PRO Histologi Análise histoptológic e morfométric do corção Durnte eutnási, o corção e seção proximl d ort dos nimis form removidos, lvdos em solução slin fisiológic e secos em ppel de filtro. Estes órgãos form preservdos em formol tmpondo 10%. 27

29 Mteril e Métodos Pr contgem dos prsitos teciduis (ninhos de mstigot) e pr mensurção d inflmção, o tecido crdíco foi processdo e vlido trvés de histologi convencionl. Secções com 4µm de espessur form desprfinizdos em dois bnhos de xilol, 30 minutos cd, hidrtdos em soluções lcoólics de concentrções decrescentes de álcool (100%, 90%, 80% e 70%) 5 minutos em cd e lvdos em águ corrente por 5 minutos. Em seguid, os cortes form cordos pel Hemtoxilin por 1 minuto e 30 segundos, lvdos em águ corrente por 30 minutos e cordos pel Eosin durnte 40 segundos. Posteriormente form mergulhdos rpidmente 3 vezes em álcool bsoluto e 3 vezes em águ. Após o último processo s lâmins com os cortes, form colocds n estuf à 56ºC pr secgem. Ao finl, s lâmins form montds com lmínuls e Etelln e submetidos à nálise em microscopi óptic. Posteriormente foi relizd quntificção d inflmção n áre crdíc. Todos os núcleos celulres presentes no frgmento crdíco form quntificdos em 20 imgens (cmpos) letórios (áre totl percorrid igul 1,49 x 10 6 µm 2 ). As imgens visulizds pel objetiv de 40X form digitlizds pel microcâmer Leic DM 5000 B (Leic Appliction Suite, versão 2.4.0R1) e nlisdos por meio do progrm nlisdor de imgens Leic Qwin V Áre de ninhos de mstigot O prsitismo crdíco foi determindo pel quntificção d áre dos ninhos de mstigot. Assim, os ninhos presentes no frgmento crdíco form quntificdos em 30 imgens (cmpos) letóris (áre totl percorrid igul 1,49 x 10 6 µm 2 ). As imgens visulizds pel objetiv de 40X form digitlizds trvés d microcâmer Leic DM 5000 B (Leic Appliction Suite, versão 2.4.0R1). As imgens ssim cpturds form 28

30 Mteril e Métodos visulizds e grvds pr posterior utilizção com o progrm de nálise de imgem ImgeJ (ImgeJ versão 1.44), onde form obtids s mensurções, cujos vlores form expressos em µm Análise histoptológic e morfométric ds lesões órtics Os corções já fixdos form cortdos trnsverslmente sob visão estereoscópic, o nível d bord tril inferior direit, de modo seprr região dos átrios e dos ventrículos. O frgmento contendo porção proximl do corção e riz d ort foi seprdo em três prtes denominds de proximl, medil e distl, tomndo-se como referênci porção proximl do corção. Ests prtes form processds pr inclusão em prfin, de form orientd no mesmo bloco pr obtenção de cortes histológicos de 5µm de espessur. As lâmins form enumerds em série e cords em Hemtoxilin e Eosin. O tmnho d lesão terosclerótic foi vlido em 30 cortes por niml; cd 50µm, 2 cortes sequenciis erm seleciondos pr medid num totl de 6 cortes por lâmin (contendo 2 cortes proximis, 2 mediis e 2 distis) segundo técnic modificd de Pigen et l 1987 e Portugl et l As áres form medids por meio d nálise morfométric, pelo progrm Imge J. O cálculo do tmnho d lesão de cd niml foi feito pel som ds áres dos 30 cortes e vlor médio por grupo foi utilizdo pr comprções esttístics. O colágeno extrcelulr presente ns lesões terosclerótics foi visulizdo utilizndo-se o cornte Tricrômico de Gomori, o qul present colorção esverded, e contr-cordos com Hemtoxilin. Form nlisdos 3 cortes não consecutivos em intervlo letório por niml (Gupt et l., 1997; Dugherty e Rteri, 1994) e os resultdos form expressos como porcentgem de colágeno/áre de lesão. 29

31 Mteril e Métodos 3.8. Análise esttístic dos ddos: Os prâmetros vlidos form representdos pel médi de seus vlores e respectivo erro médio pdrão. Utilizou-se o progrm GrphPd Prism e os ddos form nlisdos pelo teste OneWy ANOVA pr múltipls comprções (Turkey test). As diferençs form considerds significtivs se o P foi igul ou menor que 0,05. 30

32 Prsitos por 5 l/sngue (x10 3 ) Resultdos 4.0. Resultdos 4.1. Mortlidde e prsitemi As ceps Colombin e Be 78 presentrm diferençs significtivs nos prâmetros biológicos qundo inoculds em cmundongos C57BL6 selvgem e poe -/-. Form observdos perfis diferentes de curvs de prsitemi nos nimis inoculdos com ests ceps do T. cruzi (Figur 1). Ao se vlir cep Be 78 inoculd nos nimis selvgens e poe -/-, estes presentrm menores níveis de prsitemi em relção à cep Colombin. No grupo poe -/- infectdo com cep Colombin foi observd diferenç significtiv nos dis 19, 25 e 26 pós infecção em relção os demis grupos infectdos. O mesmo foi observdo pr o grupo selvgem inoculdo por est cep. O período préptente foi menor nos nimis selvgens (9 dis), em relção os nimis infectdos poe - /- (12 dis) Be 78 poe -/- Col poe -/- Be 78 Col * * * * * Dis pós infecção Figur 1. Curv de prsitemi. A contgem de tripomstigots circulntes foi relizd dirimente trvés d vlição snguíne (vei cudl). Be 78 poe -/- : Knockout pr polipoproteín E infectdo com Berenice 78; Col poe -/- Knockout pr polipoproteín E infectdo com Colombin; Be 78: tipo selvgem infectdo com Berenice 78; Col: tipo selvgem infectdo com Colombin. Os ddos cim form presentdos como médi+/- SEM e nlisdos por OneWy ANOVA (Tukeytest), sendo significtivo o p<

33 Sobrevivênci /% Resultdos As txs de mortlidde form determinds pr cd grupo de nimis (Figur 2). A sobrevivênci foi de 100% nos grupos não infectdos selvgem e poe -/-. Tmbém nos nimis infectdos pel cep Be 78, tnto selvgens qunto poe -/-, não houve mortlidde. Detectou-se mortlidde pens nos grupos infectdos pel cep Colombin, sendo que no grupo selvgem ocorreu no 9º di de infecção e no grupo poe -/- ocorreu no 25º di CNI CNI poe -/- 50 Be 78 Be 78 poe -/- 25 Col Col poe -/ Dis Figur 2. Curv de sobrevivênci. A sobrevivênci foi compnh em todos os grupos durnte 25 dis de infecção. CNI: Controle não infectdo; CNI poe -/-: Controle não infectdo knockout pr polipoproteín E; Be 78 poe -/-: Knockout pr polipoproteín E infectdo com Berenice 78; Col poe -/-: Knockout pr polipoproteín E infectdo com Colombin; Be 78: tipo selvgem infectdo com Berenice 78; Col: tipo selvgem infectdo com Colombin. Os ddos cim form presentdos como médi+/- SEM e nlisdos por OneWy ANOVA (Tukeytest), sendo significtivo o p<

34 Resultdos 4.2. Vrição do peso corporl N tbel 1, encontr-se reltdo vrição de peso dos nimis. Não observou-se diferençs entre os grupos. Tbel 1. Médi de peso de nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/-, não infectdos, infectdos com s ceps Berenice 78 (Be 78) e Colombin do Trypnosom cruzi durnte qutro semns. Semns (Médi ± SEM) 1ª 2ª 3ª 4ª CNI 24,5 ± 0,89 23,4 ± 0,41 23,7 ± 0,72 23,2 ± 0,40 Be78 24,2 ± 0,91 24,3 ± 0,93 23,9 ± 0,96 23,6 ± 0,89 Col 23,3 ± 0,95 24,1 ± 0,40 24,9 ± 0,46 21,7 ± 0,56 CNI poe -/- 21,9 ± 0,81 23,8 ± 0,78 24,7 ± 0,74 25,0 ± 0,76 Be78 poe -/- 21,1 ± 0,87 21,8 ± 0,87 22,9 ± 0,96 24,2 ± 0,96 Col poe -/- 20,8 ± 0,56 21,9 ± 0,65 23,4 ± 0,76 22,6 ± 0,91 Os ddos bixo form presentdos como médi+/- SEM e nlisdos por OneWy ANOVA (Turkey test), sendo significtivo o p<0.05. CNI: Controle não infectdo Col: cep Colombin Be78: cep Berenice 78 CNI poe -/-: controle não infectdo knockout pr polipoproteín E Be78 poe -/-: infectdo com Berenice 78 knockout pr polipoproteín E Col poe -/-: infectdo com Colombin knockout pr polipoproteín E 33

35 Resultdos 4.3. Relção entre o peso do fígdo e o peso corporl N tbel 2, encontr-se descrit médi d relção entre o peso do fígdo e o peso corporl dos nimis n 4ª semn de experimento. No grupo de nimis infectdos com cep Colombin form observdos vlores esttisticmente mis elevdos dest relção, sendo que nos demis grupos ess relção foi similr. Tbel 2. Médi d relção entre o peso do fígdo e o peso corporl dos nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/- não infectdos, infectdos com s ceps Berenice 78 (Be 78) e Colombin do Trypnosom cruzi durnte qutro semns. Vlores (Médi ± SEM) Vlores (Médi ± SEM) Grupos Grupos CNI 0,048 ± 0,001 CNI ApoE-/- 0,053 ± 0,001 Be78,b 0,058 ± 0,002 ApoE-/- Be78 0,044 ± 0,006 Col b 0,062 ± 0,003 ApoE-/- Col b 0,057 ± 0,004 Os ddos bixo form presentdos como médi+/- SEM e nlisdos por OneWy ANOVA (Turkey test), sendo significtivo o p<0.05. Letrs diferentes significm diferenç entre os grupos.cni: Controle não infectdo; Col: cep Colombin; Be78: cep Berenice 78; CNI poe -/-: controle não infectdo knockout pr polipoproteín E; Be78 poe -/-: infectdo com Berenice 78 knockout pr polipoproteín E; Col poe -/-: infectdo com Colombin knockout pr polipoproteín E 34

36 Resultdos 4.4. Dosgem de colesterol totl, colesterol HDL e triglicerídeos plsmáticos. Avlimos os níveis de colesterol totl, colesterol HDL e triglicerídeos plsmáticos dos nimis poe -/- e selvgens, ntes (tbel 3) e pós 27 dis de infecção pelo T. cruzi (figur 3). Ao se vlir os níveis de colesterol totl, observmos que qundo poe est usente estes vlores estvm mis elevdos (Figur 3A), tnto ntes qunto pós infecção. Ao contrário em relção os níveis de colesterol HDL, n presenç d poe, observmos vlores menores em comprção os nimis selvgens (Figur 3B), sendo menores ntes d infecção. Já qundo comprmos os níveis de triglicerídeos encontrmos diferenç significtiv pens no grupo poe -/- infectdo pel Colombin, qundo comprdos os demis grupos (Figur 3C). Tbel 3. Médi dos níveis de colesterol totl, colesterol HDL e triglicerídeos dos nimis d linhgem C57BL6 selvgem ou poe -/- ntes d infecção. Resultdos (Médi ± SEM) Grupo Prâmetros poe -/- Selvgem Colesterol totl inicil 276,50 ± 29,13 83,48 ± 6,04 Colesterol HDL inicil 13,71 ± 0,26 28,39 ± 2,96 Triglicérideos iniciis 71,51 ± 4,26 76,16 ± 4,06 poe -/-: nimis knockout pr polipoproteín E 35

37 Triglicérideos (mg/dl) Colesterol totl (mg/dl) HDL colesterol (mg/dl) Resultdos A) B) Selvgem ApoE -/- b b b b,b b Selvgem ApoE -/ CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col 0 CNI Be 78 Col CNI Be 78 Col C) 300 Selvgem ApoE -/- b CNI Be78 Col CNI Be78 Col Figur 3. Avlição do colesterol totl, triglicérideos e HDL plsmáticos. Colesterol totl (A), HDL (B) e triglicerídeos (C) no soro dos nimis Knockout pr poe e selvgem, n fse gud d infecção pelo T. cruzi. Os ddos cim form presentdos como médi +/- SEM e nlisdos por OneWy ANOVA (Turkey test), sendo significtivo o p<0.05. Letrs diferentes significm diferenç entre os grupos. CNI: controle não infectdo; Be 78: infectdo com Berenice 78; Col: infectdo com Colombin; poe -/-: cmundongo knockout pr polipoproteín E Dosgem de lipídeos totis, colesterol totl e triglicerídeos hepáticos. Ao se vlir os lipídeos hepáticos totis observou-se um redução de su concentrção nos nimis poe -/- infectdos com mbs s ceps do T. cruzi qundo comprdos com o nimis poe -/- - não infectdos (Figur 4A). Por outro ldo, qundo se vliou o colesterol totl hepático nesses nimis, observou-se que presenç d cep Be78 36