de restrição de tipo II Descoberta Sistemas de modificação restrição Como actuam Aplicações

Transcrição

1 Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição de tipo II Descoberta Sistemas de modificação restrição Como actuam Aplicações

2 Bacterial a lysis s after ate phage infection

3 Bacteriophage infection and plaque formation

4 Lysis plaques Bacterial colonies

5 Sistemas de Restrição-Modificação X X X X Y Y X X Y Y Y As bactérias resistem à infecção a novos fagos O DNA fágico é digerido por enzimas bacterianas As enzimas restringem o leque de hospedeiros à infecção fágica Modificação e restrição de um vírus, controlado pelo hospedeiro

6 Modificação do DNA METILAÇÃO 1) Modificação do DNA- METILAÇÃO 2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenosil metionina) ATP SAM CH 3 activo 3 Metionina S adenosil homocisteína CH 3 Homocisteína H 2 O

7 Exemplo de metilação Metilações mais frequentes m6 A N6 metiladenina m5 C C5 metilcitosina m4 C N4 metilcitosina hm5 C C5 hidroximetilcitosina

8 Sistemas de Restrição Modificação Tipo I ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADO Tipo II consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADO Tipo III Sistemas de Restrição (endonucleases) McrA C*CGG McrB G*C Mrr C*AC e C*AG Só CLIVAM sequências METILADAS Sistemas de Modificação (metilases sítio específicas) Dam (N6) G*ATC Dcm (C5) C*CAGG e C*CTGG Só METILAM

9 Características das enzimas dos Sistemas de Modificação Restrição de tipo I, II e III

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11 Sequências de reconhecimento das enzimas de restrição Tipo I EcoAI EcoKI StySPI GAGNNNNNNNGTCA AACNNNNNNGTGC AACNNNNNNGTRC Corte a mais de 1000 pb da sequência de reconhecimento que é bipartida e assimétrica Tipo II EcoRI BalI PstI G/AATTC TGG/CCA CTGCA/G Corte na, ou muito próximo da sequência de reconhecimento que é frequentemente PALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb Tipo III EcoP151 EcoPI HinfIII CAGCAG AGACC CGAAT Corte a pb a jusante da sequência de reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb Locais de corte, sequências de reconhecimento, locais de restrição N A, C, G ou T; R G ou A

12 Palíndromos RADAR MADAM IN EDEN I M ADAM ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5

13 Endonucleases de tipo II AccI AluI BamHI EcoRI HaeIII Sau3AI Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A

14 Type II restriction enzymes

15 3 OH 5 P Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfodiéster onde ocorre o corte

16 Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição Extremidades cegas e coesivas (ou salientes) Extremidades 5 e 3 projectadas a 5 do eixo de simetria a 3 do eixo de simetria As mesmas extremidades coesivas, produzidas por diferentes enzimas de restrição

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19 Sistemade modificação restrição das enzimas de tipoii (Exemplo) A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento: aactgaattctcgac ttgacttaagagctg aactg ttgacttaa AATTCtcgac Gagctg A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimento aact G A *A T T C tcgac ttga C T T *A A G agctg A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI

20 Sistema de Modificação Metilação Dam Mtil Metilação Dam: G m6 ATC (grupo metilo na posição iã N6 da adenina: N6 metiladenina i ) 1 Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam ClaI XbaI MboI G*ATCGAT TCTAG*ATC G*ATC 2 Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam BamHI GG*ATCC PvuI CG*ATCG Sau3AI G*ATC A negrito a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II

21 Diferentes padrões de metilação vs diferentes sensibilidades de clivagem Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação, consoante a especificidade das metilases da célula Ex. G m6 ATC (Dam) GAT m5 C GAT m4 C GAT hm5 C As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidades aos diversos padrões de metilação Ex: Sau3A1 CLIVA NÃO CLIVA G m6 ATC GAT m5 C GAT m4 C GAT hm5 C

22 Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à metilação DpnII não CLIVA CLIVA DpnI GATC G m6 ATC GATC CTAG CT m6 AG CTAG Sau3AI CLIVA GATC CTAG G m6 ATC CT m6 AG DpnI só corta sequência de reconhecimento quando metilada DpnII não metilada Sau3AI metilada e não metilada

23 CLIVA DpnI DpnII GATC NÃO CLIVA SÓ CLIVA NÃO CLIVA GATC G*ATC Metilase GAT C Protecção da Restrição As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restrição por cada uma destas enzimas G*AT C

24 Isoesquizómeros 1 Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais AccIII BspEI TCCGGA AGGCCT TCCGGA AGGCCT Extremidades compatíveis com XmaI CCCGGG GGGCCC 2 Reconhecem a mesma sequência mas clivam diferentemente (geram extremidades diferentes) Acc65I GGTACC XmaI CCCGGG CCATGG GGGCCC KpnI GGTACC SmaI CCCGGG CCATGG GGGCCC 3 Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda, após clivagem, geram extremidades diferentes

25 Metilação em organismos eucariotas um outro significado biológico Mto variável consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila DNA não metilado Geralmente a metilação está associada a mecanismos de silenciamento i génico REGULAÇÃO EPIGÉNICA Alteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequência de DNA, mas a algo que aa somar à sequência de DNA, influi a expressão génica, como seja: modificação de bases e proteínas (histonas) factores proteicos que se ligam ao DNA

26 Aplicação das enzimas de restrição de tipo II DNA cloning

27 DNA cloning... One of the mostimportant goals of recombinant DNA technology isto clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on: the gene what is known about it objective Among the several toolsneeded for cloning, lets consider: restriction enzymes vector DNA DNA ligase host cell

28 Isolating and cloning a DNA fragment

29 Construction of a recombinant DNA molecule DNA ligase activity

30 VECTORS Central component of gene cloning experiments Two types of naturally ocurring DNA molecules: Plamids Bacteriophages Other, constructed vectors Cosmids Phagemids Properties Self replicating Unique restriction enzymes cleavage sites Selectable marker Easy to recover

31 Plasmídios Geralmente moléculas de DNA circulares e cadeia dupla, com replicação independente do cromossoma bacteriano Podem existir em todos os tipos de bactérias Papel importante na adaptação e evolução bacteriana Codificam proteínas tí que na maioria i dos casos conferem vantagens à célula l Número variável de cópias Dimensões muito variáveis: 3kb 200 kb Células bacterianas podem conter mais do que um tipo de plasmídio Grupos de incompatibilidade plasmídica Tipos de replicação dos plasmídios Teta Círculo rolante Importantes ferramentas em engenharia genética

32 Plasmids are small circular DNA molecules that are found inside some prokaryotic cells Epissome.

33 Type of plasmid Gene functions Examples Resistance Antibiotic resistance Rbk of Escherichia coli and other bacteria Fertility Conjugation and DNA F of E. coli transfer between bacteria Killer Synthesis of toxins that kill Col of E. coli,, for colicin other bacteria production Degradative Enzymes for metabolism of TOL of Pseudomonas putida, unusual molecules for toluene metabolism Virulence Pathogenicity Ti of Agrobacterium tumefaciens, conferring the ability to cause crown gall disease on dicotyledonous plants

34 Plasmídios construídos um tipo de vector de clonagem Importantes ferramentas em engenharia genética pbr322

35 puc19

36 pcmv GLuc

37 Shuttle vector Two different bacterial origins of replication: ori pbr322 (ColE1, which is recognized in E. coli hosts) ori pbc16 (which is recognized in B. subtilis hosts)

38 Plasmid DNAreplication starts at ori

39 Regulation of replication of ColE1 derived plasmids RNA I and RNA II involved in the initiation of plasmid replication that have a cole1 (or pbm1) origin RNA I Rop dimer Rop protein dimer stabilizes the initial iti pairing ii of RNA I and RNA II Infrequently RNA II Frequently RNA II primes DNA synthesis RNaseH Replication No replication RNA I RNA II duplex RNA II inactivated for primer function Replication: Stringent Relaxed Low copy number plasmid (1 2 copies) High copy number plasmid (>10 copies)

40 Coexistence of twoplasmids of different Incgroups Unequal distribution of two plasmids Each plasmid type regulates its own copy number After division, both plasmids will replicate to reach their copy number

41 Curing of cells of one of two plasmids when they are members of the same Inc group Plasmid A Plasmid B Unequal distribution of two plasmid types Plasmids regulates each other s replication Unequal distribution of plasmids A and B Cured of type A The sum of the two plasmids will equal the copy number, but one may be underrepresented and lost in subsequent divisions. Eventually, most of the cells will contain only one or the other plasmid.

42 Marcas importantes de um vector plasmídico Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpe hospedeiro é sensível

43 Bacteria cell transformation Introduction of recombinant DNA molecules into a host (ex. E. coli) Different procedures: inducing i competence (CaClCl 2, MgCl 2, LiCl) electroporation

44 Transformed cells are isolated in SELECTION MEDIA (a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSFORMATION) Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmid SELECTION MEDIA

45 Recombinant DNA clones Non recombinant DNA plasmid. Bacteria cells harbouring this plasmid will grow, but won t be recombinant clones Ex. ANTIBIOTIC selection of plasmid DNA (recombinant and non recombinant) Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell Cell divides and vectors are passed to progeny Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules

46 Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam G*ATC MboI GATC não cliva G*ATC CTAG sequências metiladas CT*AG Sau3AI GATC cliva G*ATC CTAG sequências metiladas CT*AG

47 Características dos hospedeiros vs metilação Ex. DNA humano *CpG Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição) mcra McrA C m5 CGG mcrbc McrBC G m5 C G h5 C G N4 C

48 Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcra e mcrbc e posteriormente clivá lo com MspI? E com HpaII? Porquê? MspI e HpaII são isoesquizómeros, mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm. MspI I não é sensível là metilação, Dcm ou metilação CpG Gdos mamíferos, ie, C m5 CGG. No entanto não cliva em m4 CCGG, m5 CCGG, C m4 CGG e hm5 C hm5 CGG HpaII não cliva em C m5 CGG, m4 CCGG, m5 CCGG, C m4 CGG e hm5 C hm5 CGG

49 DNA libraries Collection of clones made of the original DNA Genomic DNA library and cdna library

50 Construction of a genomic DNA library using bacteriophage λ as a vector Screening a recombinant library by hybridization Shotgun cloning Hybridization with a radiolabeled probe Packaging into phage particles Bacteria infection Collection of recombinant clones The appropriate phage plaque can then be isolated from the original culture plate

51 Construction of a cdna library cdna library is constructed with cdna, or complementary DNA, which is synthetic DNA made from mrna with the use of reverse transcriptase

52 Synthesis of cdna (in vitro) mrna purification Synthesis of the double stranded DNA Cloning cdna

53 1 mrna purification 2 A Synthesis of the ds DNA mrna is the template for the synthesis of cdna ssdna molecule is used as a template for dsdna synthesis DNA polymerase I

54 2 B Synthesis of the ds DNA Resulting cdna ends in a hairpin loop which becomes a primer for DNA polymerasei 3 Cloning cdna Linkers The loop is then cleaved by S1 nuclease (which acts only on ss loop) to produce a Ds cdna molecule