Genética e Melhoramento de Plantas. Universidade de Évora 2005

Transcrição

1 Genética e Melhoramento de Plantas Universidade de Évora 2005

2 Estrutura dos ácidos nucleicos Ácido Desoxirribonucleico (DNA) Ácido Ribonucleico (RNA) Dos genes às proteínas (eucariotas): transcrição e tradução Engenharia Genética de Plantas Identificação de genes de interesse Extracção de RNA total e purificação de mrna Isolamento e clonagem de genes de interesse Desenho de primers degenerados Desenho de primers específicos para isolamento das extremidades (5 e 3 de um gene) Construção de Vectores de Clonagem Avaliação de colónias recombinantes com enzimas de restrição

3 DNA: Ácido DesoxirriboNucleico Constituído por uma sequência de apenas quatro nucleótidos. Os diferentes nucleótidos apresentam uma estrutura comum: Um grupo fosfato ligado por uma ligação fosfoester a uma pentose (desoxirribose), a qual se liga a uma base azotada resultando num desoxirribonucleótido. As bases azotadas podem ser purinas (adenina e guanina) ou pirimidinas (citosina e timina). Os desoxirrinucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiester originando uma cadeia simples.

4 Duas cadeias simples ligam-se entre si devido à complementaridade das suas bases azotadas (A=T, G=C), através de ligações por pontes de hidrogénio, originando uma cadeia dupla. James Watson and Francis Crick (1953): Estrutura em dupla hélice com orientação das duas cadeias antiparalela.

5 RNA: Ácido RiboNucleico Constituído por uma sequência de apenas quatro nucleótidos. Os diferentes nucleótidos apresentam uma estrutura comum: Um grupo fosfato ligado por uma ligação fosfoester a uma pentose (ribose), a qual se liga a uma base azotada resultando num desoxirribonucleótido. As bases azotadas podem ser purinas (adenina e guanina) ou pirimidinas (citosina e uracilo). Apresenta uma estrutura em cadeia simples. Os ribonucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiester originando uma cadeia simples.

6 Estrutura de um gene: Promotor: Região do DNA à qual se liga a enzima RNA polymerase antes de iniciar a transcrição do DNA em RNA. Determina: região de início da transcrição; a cadeia de DNA que servirá como template; número de transcritos; frequência da transcrição. Gene: Segmento de DNA constituído por um conjunto de intrões e exões que será transcrito em mrna, codificando os exões a síntese proteica. Terminador: Região terminal que bloqueia a enzima RNA polimerase e induz a sua dissociação. 5 Promoter UTR Exon1 Intron1 Exon2 UTR Terminator 3 GENE Transcription Poly A

7 Transcrição (decorre no núcleo): síntese de uma cadeia de RNA mensageiro (mrna) pela enzima RNA polimerase que decorre de 5 para 3 tendo como modelo apenas uma das cadeias de DNA. A nova cadeia resultante será complementar à cadeia de DNA que lhe serviu de molde apresentando uracilo em vez de timina:

8 Modificações pós-transcrição: 5 capping: ligação de uma molécula de 7-metilguanilato à extremidade 5 do mrna durante a transcrição, tendo como objectivo a protecção da nova cadeia.

9 Clivagem da extremidade 3 e adição de uma cauda Poly (A) Ainda no núcleo o mrna transcrito primário sofre a clivagem da extremidade 3 e posterior adição de uma cauda poly(a). A dimensão da cauda poly(a) varia entre 100 a 250 adeninas. No citoplasma a dimensão da cauda diminui. A funçãon da cauda poly(a) não é ainda bem conhecida.

10 Splicing: clivagem dos intrões no inteior da cadeia de mrna e simultânea ligação dos exões, correspondendo à última fase do processamento das moléculas de mrna no núcleo.

11 Genoma Total conjunto de genes de um organismo Transcritoma Conjunto de sequências transcritas (mrna) Proteoma Conjunto de proteinas codificado pelo genoma

12 Código genético: envolve o reconhecimento de tripletos (conjunto de três nucleótidos) do mrna denominados codões pelos complementares anticodões do trna. Codão de iniciação: AUG (Met) Codões stop: UAA; UAG; UGA O código genético é universal e degenerado (61 codões codificam para a síntese de apenas 20 aa): vários codões = 1 aa 1 codão vários aa

13 Início da tradução: ão reconhecimento do codão de iniciação (mrna) AUG pelo anticodão (trna) UAC transportando o aminoácido inicial Meteonina. O ribossoma (rrna+proteina) movendo-se ao longo da cadeia de mrna (de três em três nucleotidos) cataliza a síntese proteica. Final da tradução: ão reconhecimento do codão de terminação (mrna) UAG pelo anticodão (trna) AUC com a consequente separação das duas subunidades que constituem o ribossoma.

14 Melhoramento genético: Consiste na adição ou subtracção de um ou mais genes de um organismo, introduzindo ou silenciado uma determinada característica. Vantagem: Ultrapassar a barreira da espécie: um gene que codifica uma característica numa determinada espécie pode ser introduzido numa outra espécie mesmo que filogenéticamente muito afastada recorrendo a técnicas de biologia molecular. Interesse: Criar plantas tolerantes ou resistentes a determinadas condições de stress biótico e/ou abiótico.

15 Exemplo: Introdução de Resistência ao Fungo Uncinula necator (Oídio) em Videira (Vitis vinifera) O fungo em questão possui parede de quitina pelo que as proteínas com capacidade de a hidrolizar quitinases podem conferir à planta potencialidade para resistir a esse stress biótico.

16 1º PASSO: Pesquisar na bibliografia a existência de espécies vegetais resistentes a este fungo. Ex.: Vitis rupestris 2º PASSO: Pesquisar na base de dados se o gene está descrito para a espécie classificada como resistente. Caso não esteja, será objectivo isolar este gene na espécie resistente para introduzir na espécie sensível (

17 3º PASSO: Isolamento de RNA total do organismo do qual se pretende isolar o gene (espécie resistente V. rupestris) e purificação de mrna. 4º PASSO: Transcrição Reversa 5º PASSO: Desenho de primers degenerados permitindo-nos amplificar uma sequência correspondente ao gene que se pretende isolar. Para tal seleccionam-se na base de dados as sequências ORF (Open Reading Frame) de várias espécies, ou seja, a região estritamente necessária para a codificação da síntese da proteína. A ORF inicia-se com a sequência Kozak (CCGCCATGGG) e finaliza com um dos codões stop, correspondendo sempre à maior sequência encontrada; 6º PASSO: Alinhamento das diferentes sequencias de um mesmo gene codificando a mesma proteína em diferentes espécies e desenho de um primer degenerado (sequencia de 20 a 30 oligonucleótidos) forward (extremidade 5 ) e outro reverse (extremidade 3 ); 7º PASSO: Amplificação de uma sequência de cdna por PCR utilizando os primers degenerados.

18 Extracção de RNA total (Protocolo do Hot Borate ) A integridade do RNA é avaliada em gel de agarose onde devem ser visíveis duas bandas mais fortes correspondentes ao RNA ribossomal (28S e 18S); Pode ocorrer contaminação com DNA; O trabalho com RNA requer mais cuidados, uma vez que este é mais instável que o DNA; A grande desvantagem de trabalhar com o RNA será a de não existir forma de o amplificar. 28S 18S DNA mrna Purificação do mrna Permite isolar genes que se estejam a expressar (constitutivos ou de expressão diferencial, que só se expressem sob uma determinada condição de stress); A incapacidade de o amplificar levou ao desenvolvimento de técnicas (Transcrição Reversa) que permitiram converter este novamente em DNA (DNA complementar ou cdna).

19 Transcrição Reversa Enzimas denominadas Transcriptases Reversas, descobertas por Temin e Baltimore (1960) em retrovírus, catalizam a síntese de cdna a partir de RNA.O cdna é mais estável e apresenta a vantagem de poder ser amplificado por técnica de PCR.

20 Transcrição Reversa mrna template AAAAAAA ( ) Poly(A) VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) VIAL 8 AAAAAAA ( ) Poly(A) VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) Degradação da cadeia de mrna com RNase AAAAAAA ( ) Poly(A) VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) Amplificação por PCR VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) GTCGACATCGATACGCGTGGTC VIAL 9 Pefw PeRev VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) AAAAAAAAAAAAAAAGTCGACATCGATACGCGTGGTC A transcrição (reversa) do cdna tem a vantagem de permitir posterior amplificação de um gene de interesse limpo de intrões. O conhecimento da sequência das extremidades do cdna permite a posterior amplificação das extremidades de um gene. Para tal deverá utilizar-se um primer específico que emparelhe com uma das extremidades e um outro primer que emparelhe com uma zona específica da nossa sequência.

21 Primer: Sequência de oligonucleótidos (16-24 nucleótidos) complementar a uma região do DNA que ao emparelhar permite o funcionamento da enzima Taq polimerase e consequente formação de uma nova cadeia de DNA complementar à existente. Forward (5 ) Reverse (3 )

22 AGGCTA( ) GGCAAT( ) 5 3 AGGCTA( ) Fw CCGTTA( ) Rv 5 AGGCTA( ) 5 ( )ATTGCC Reverse complement Os primers devem ser desenhados tendo em conta os seguintes pontos: a) primer Forward próximo da extremidade 5 com a sequência igual àda cadeia modelo; Reverse próximo da extremidade 3 com a sequência complementar à da cadeia modelo, sendo a sua sequência colocada em reverse devido a efeitos de encomenda; b) cada primer não deverá exceder os 25 nucleótidos; c) o número de nucleótidos de um primer depende da sua temperatura de emparelhamento, determinada da seguinte forma: [2x(A+T)]+[4x(G+C)]; d) a extremidade 3 de cada primer deverá ser mais rica em G e/ou C.

23 Polymerase chain reaction (PCR) Amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA, determinada pelo emparelhamento dos primers. Condições necessárias para a reacção: a) sequência de DNA que servirá de template b) um par de primers (forward e reverse) c) DNA polimerase (Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus) d) dntps (C, T, G, A) c) tampão de PCR com MgCl 2 Programa de PCR: Programa de PCR: 1º: Desnaturação: temperatura de C 2º: Emparelhamento: temperatura varia com primers 3º: Temperatura de síntese: temperatura C

24 Mix de PCR: 1. cdna.. 1µl 2. PCR Buffer (10x)... 5µl 3. MgCl (50mM).. 2µl 4. dntps (10mM)... 1µl 5. Primer forward (10mM).. 1µl 6. Primer reverse (10mM) 1µl 7. H 2 O Milli-Q estéril. 38.5µl 8. Taq DNA polimerase.. 0.5µl 50µl Programa de PCR: 35 ciclos

25 330 pb 800 pb Fw 3 5 Rv 5 ± 1000 pb 1500pb 600pb 500pb 100pb MM PCR ± 500 pb A utilização de primers degenerados permitenos amplificar fragmentos específicos da espécie em estudo (± 500pb); Por vezes ocorre a amplificação de outros fragmentos denominados inespecíficos dado o emparelhamento inespecífico do primer (se existir uma pequena sequência na extremidade 3 do primer, sobretudo G ou C, que emparelhem com alguma zona complementar no templete, ocorrerá igualmente síntese de DNA).

26 Sequenciação do fragmento amplificado Na reacção de sequenciação (PCR com apenas 1 primer) o fragmento vai ser amplificado com nucleótidos marcados que o sequenciador vai reconhecer, sendo o resultado da leitura dado por uma cor diferente para cada nucleótido; A leitura do fragmento de DNA amplificado permite determinar se este corresponde de facto a um fragmento do gene que se pretende isolar.

27 Isolamento das extremidades 5 e 3 do gene Desenho de primers específicos 5 (330pb)GGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCC TAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACT ATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATC ATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGG ATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAG GTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTT AGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCC(800pb)...3 Ta=(4x15)+(2x9)-10=78 10=78-10= 68 Ta=(4x17)+(2x8)-10=84 10=84-10= 74 cdna ± 500pb 5 AAAAAA GGG 3 5 PCR primer Fw Rv Poly(A) Poly(T) 3 CCC 5 ± 700pb

28 Clonagem do Gene Completo A enzima Taq DNA polimerase possui a capacidade adicional de terminal transferase (para além de DNA polimerase), ou seja, adiciona ao final da cadeia amplificada uma base de adenina (A). Esta capacidade permite a ligação do fragmento amplificado a um vector de clonagem linearizado possuindo extremidades de timina (T). 5 AATGGGGTTGTGGGCATTGGTAGCTTTCTGTCTGTTGTCATTAATACTGGTTGGCTCAGCAGAGCAATGTGGAGGGCAAGCTGG GGGTAGAGTTTGCCCAGGGGGGGCATGCTGCAGCAAGTTTGGTTGGTGTGGCAACACTGCTGATTACTGTGGCAGTGGCTGCCA AAGCCAGTGCAGTTCCACTGGTGACATTGGCCAGCTTATTACCAGGTCCATGTTCAATGATATGCTTAAGCATAGAAATGAGGGG AGTTGCCCTGGCAAGGGCTTCTACACCTATGACGCTTTCATAGCTGCTGCTAAGGCCTTTCCTGGCTTTGGAACAACTGGTGATAC CACTACTCGTAAAAGGGAAATCGCAGCCTTCTTGGCTCAAACTTCTCATGAAACCACTGGGGGGTGGGCTAGTGCACCTGATGGC CCATACGCTTGGGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCG CTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAG ACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTC ACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTT GGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATA AGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCCTCCTGCT GGACACCATCTAAA3

29 Vector de Clonagem Ampicilina Permite a selecção de bactérias transformadas. Apenas as bactérias transformadas, ou seja, que possuam o vector plasmídico no seu interior apresentam resistência a este antibiótico. Origem de replicação Responsável pela iniciação da síntese proteica. MCS Gene LacZ Responsável pela síntese do fragmento ω da enzima β- galactosidase que por complementação com o fragmento α sintetizado pelo cromossoma bacteriano produz actividade da enzima. No meio da sequência deste gene é conhecida uma zona com vários locais de restrição identificados (Multiple Cloning Site). Qual a importância desta região?

30 Vector de Clonagem: Qual a importância da MCS? Os locais de restrição identificados nesta região são únicos no vector, o que significa que as enzimas de restrição específicas deste locais apenas cortarão o vector uma única vez. As extremidades que se geram no vector após digestão com uma determinada enzima de restrição são compatíveis com as extremidades geradas num fragmento digerido com a mesma enzima, permitindo assim a integração desse fragmento no vector. Estando a região MCS inserida no meio da sequência do gene LacZ (responsável pela síntese da enzima β-galactosidase e consequente expressão azul das colónias bacterianas) a interrupção do gene por inserção de um fragmento, leva à inibição da expressão do gene. As bactérias que possuam plasmídio com um fragmento inserido na região MCS (transformadas recombinantes) possuem coloração branca.

31 Transformação de bactérias Introdução de um vector plasmídico, integrando o gene de interesse, em bactérias desprovidas de qualquer DNA desta natureza (bactérias competentes). O objectivo desta técnica consiste obter milhares de cópias do vector introduzido na bactéria e assim do gene inserido neste.

32 Screening de bactérias recombinantes com enzimas de restrição O screening de bactérias recombinantes portadoras do fragmento de interesse pode ser efectuados de duas formas: 1. Por PCR utilizando os primers específicos do gene ou do vector; 2. Por digestão com enzimas de restrição que flanqueiem o local de inserção do gene. Neste caso é necessário a incubação prévia das colónias seleccionadas em LB líquido para posterior extracção do DNA plasmídico (protocolo da aula). Somente após esta extracção é que se poderá efectuar a digestão do DNA utilizando enzimas de restrição específicas da zona MCS (podendo ser apenas uma enzima com dois locais de restrição, um na zona 5 do fragmento e outro na zona 3 ou duas enzimas diferentes). Mix Digestão: 1. DNA plasmídico extraido. 10µl 2. Buffer (10x).. 2µl 3. Enzima µl 4. Enzima µl 5. H 2 O Milli-Q estéril.. 7.4µl 20µl Incubar 2-3h a xºc (a temperatura óptima varia com as enzimas, sendo na maior parte dos caso 37ºC)

33 Screening de bactérias recombinantes com enzimas de restrição 1. A reacção de digestão não foi completa, pois observam-se no gel bandas correspondentes a formas circulares e superenroladas; 2. Apenas as colónias 2 e 4 apresentam o fragmento de interesse (1000 pb); 3. A colónia 1 apresenta um fragmento clonado de peso inferior ao desejado; 1500 pb 600 pb MM cl.1 cl.2 cl.3 cl.4 Polissacáridos DNA circular com nicks DNA linear DNA circular superenrolado Fragmento linear digerido 4. A colónia 3 apesar de apresentar uma banda correspondente a um fragmento de 1000 pb, apresenta uma outra banda correspondente a um fragmento de peso inferior a 100 pb. Como o vector não possui mais locais de restrição para as enzimas utilizadas, as duas bandas corresponderão a um fragmento de peso total de 1050pb que possui um local de restrição para uma das enzimas utilizadas a 50 pb de uma extremidade. 100 pb SacI 5 (0pb) KpnI 3 (1000pb)

34 Alguns Mecanismos de Transferência de genes de interesse Construção de Vectores de Expressão Agrobacterium Bombardeamento de Partículas Mecanismos de selecção de transgénicos Melhoramento Clássico vs. Biotecnologia Melhoramento genético: potencialidades, benefícios e riscos

35 Construção de Vector de Expressão Um vector de expressão corresponde a um vector plasmídico integrando uma sequência denominada cassete de expressão - sequência de DNA linear que inclui para além dos genes, um promotor e um terminador que controlam a expressão de cada gene em particular. Na cassete de expressão podem existir: a) apenas o gene de interesse (ex.: chitinase), não existindo forma de selecção; b) o gene de interesse e o gene de selecção (resistência a antibiótico ou herbicida); c) o gene de interesse, o gene de selecção e um gene repórter: - β-glucuronidase (GUS); - Green Fluorescent Proteins (GFP). CHITINASE Vitis rupestris GUS phktl1 ( Kb)

36 Agrobacterium tumefaciens É uma bactéria que existe naturalmente no solo infectando um grande número de dicotiledóneas. Penetra nas raízes através de feridas provocando uma reacção no tecido que se traduz numa multiplicação anormal das células dando origem a tumores. Os tumores resultam da transferência, integração e expressão nas células da planta de um segmento específico do DNA bacteriano designado de T-DNA (DNA transferido). Esta capacidade faz da bactéria A. tumefaciens um instrumento natural de engenharia genética.

37 O T-DNA constitui parte do plasmídio Ti (tumour inducing) que ocorre naturalmente nas células de A. tumefaciens e é responsável pela capacidade infecciosa da bactéria. A forma de explorar a capacidade do A. tumefaciens consiste em: alterar a zona de DNA que é transferida (T-DNA), eliminando os genes tumorais e o gene para a opina (aminoácido modificado utilizado como fonte de carbono e azoto pela bactéria), substituindo-os pelo gene ou genes que se pretendem introduzir; as sequências dos limites são os únicos elementos que é necessário manter (LE e LD) permitindo a transferência da sequência do T-DNA para as células do hospedeiro. Mapa genético do plasmídio Ti.

38 Devido às grandes dificuldades em manipular grandes moléculas de DNA como o plasmídeo Ti, foram desenvolvidos vectores em que toda a manipulação é feita recorrendo à Escherichia coli. Esquema do plasmídeo Ti utilizado para transformação de células vegetais mediada por A. tumefaciens.

39 Etapas da Transformação Genética mediada por Agrobacterium: 1. O vector plasmídico Ti retirado da bactéria e manipulado por alteração a região T-DNA. Esta manipulação envolve enzimas de restrição específicas que permitem a digestão do vector em zonas conhecidas; 2. A digestão do vector permite a inserção nessas zonas dos genes de interesse (flanqueados por um promotor e um terminador): vector recombinante; Agrobacterium Ti plasmid Genomic DNA Restriction enzyme A Empty plasmid + Genomic DNA (carries the gene of interest) Vitis Vitis rupestris Plant rupestris cells cells c Restriction enzyme A Gene of interest : chitinase 3. Transformação da estirpe de bactéria Agrobacterium com o vector Ti recombinante, originando bactérias recombinantes; Ti plasmid with the gene of interest

40 4. Infecção (co-cultura que decorre em média 2 dias) do hospedeiro com transferência do vector Ti para as células desse (o material vegetal utilizado depende do sistema de regeneração seguido); 5. Transferência da região T-DNA (suporta os genes de interesse) do vector Ti da bactéria para o genoma do hospedeiro; 6. Integração do T-DNA no genoma da planta: células transformadas; 7. Multiplicação da região T-DNA integrada no genoma da planta originando uma nova planta integrando esse(s) gene(s): planta transgénica. Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid with the new gene Agrobacterium cell s + DNA Transformation Plant cell The new gene 8. Expressão dos genes introduzidos no hospedeiro quando sob a condição de stress que se tentou combater. Transgenic plant Cell division

41 Selecção de Plantas Transgénicas nicas Calli embriogénicos transformados A regeneração de plantas (embriogénese somática) a partir de zonas integrando o genes GUS origina plantas transformadas. A análise histoquímica realizada em plantas permite detectar por expressão da coloração azul as plantas que integram este gene repórter. A análise histoquímica com X-Gluc permite verificar a eficiência da transformação. A área azul corresponde a zonas onde ocorreu a integração do gene GUS e sua expressão com síntese da proteina β-glucoronidase.

42 Limitações da TécnicaT Apesar de ser utilizado com sucesso na transformação de muitas dicotiledóneas, apresenta como grande limitação: a reduzida capacidade na transformação de monocotiledóneas. Na tentativa de incrementar esta capacidade de transformação testaram-se diferentes estirpes de Agrobacterium, condições fisiológicas da bactéria e hospedeiro, bem como técnicas de co-cultura (Godwin et al., 1992), não se conseguindo ainda assim resultados favoráveis. A transformação de monocotiledóneas requer um sistema alternativo de transformação genética, como por exemplo o bombardemanto de particulas ou a fusão de protoplastos. A integração de genes pelo Agrobacterium dá-se unicamente ao nível do DNA genómico do hospedeiro. Caso se pretenda introduzir informação noutro qualquer organelo celular, terá de se recorrer a outras técnicas, como por exemplo o bombardeamento de partículas.

43 Bombardeamento de Partículas, Gen Gun ou Biolística Métodologia que permite transformar geneticamente plantas de espécies que o Agrobacterium não infecta (como por exemplo o arroz, o milho, a cevada, etc.). A técnica t basea-se em: projectar a uma pressão elevada (variando esta com o material vegetal em causa, para calli de videira é utilizada uma pressão entre 1100 e 1550 psi) partículas de ouro ou tungsténio de diâmetro variável (1.00µm) com o DNA (vector plasmídico com a cassete de expressão ou apenas a cassete de expressão) agregado. A força mecânica gerada por uma velocidade elevada permite que sejam quebradas barreiras biológicas, podendo ocorrer integração do DNA estranho no genoma das células bombardeadas (DNA nuclear). Para além deste, esta técnica possibilita a integração ao nível do genoma dos cloroplastos (Ye et al., 1990; Daniell, 1993) e das mitocondrias. A aplicação desta técnica requer: - uma preparação prévia muito cuidada; - DNA circular ou linear de boa qualidade; - existência de um protocolo de regeneração optimizado.

44 O aparelho utilizado: Câmara de Bombardeamento

45 Suporte do disco de ruptura (1) Estrutura onde se colocam os macrocarriers, respectivos suportes e stopping screen (2) Suporte do material Vegetal (3)

46 O disco de ruptura determina a pressão à qual serão projectadas as partículas com o DNA agregado. Existem diferentes discos de acordo com a pressão que suportam: um disco de 1550psi significa que suporta pressões inferiores a esta e que ao atingir este valor rompe, permitindo que as partículas sejam projectadas sob o material vegetal. (1) Disco de ruptura Suporte do disco de ruptura

47 Suportes do Macrocarrier (2) Tampa Macrocarrier Stopping Screen

48 (3) O material vegetal utilizado no bombardeamento de partículas depende do sistema de regeneração utilizado para a espécie vegetal que se pretende transformar, podendo ser calli, embriões, discos foliares, etc.

49 Análise histoquímica 2 dias após o bombardeamento permite determinar o sucesso da transformação. O número de pontos azuis corresponde aos pontos em que ocorreu integração do gene GUS e sua expressão. As primeiras células do material vegetal a serem bombardeadas são normalmente destruídas, no entanto, junto a essas existe uma área de células envolvente em que as partículas penetraram sem as destruir. Algumas destas células vão sobreviver à agressão provocada pela ferida das partículas e incorporar no genoma o DNA transportado. Após a incorporação do(s) gene(s) no genoma da planta, as células podem expressá-lo com a consequente produção da proteína por ele codificada.

50 Vantagens relativamente ao Agrobacterium: Possível utilização em dicotiledóneas e monocotiledóneas; Inexistência de falsos positivos, correspondentes a plantas não transformadas mas que possuindo a bactéria utilizada como vector da transformação, manifestam a presença do gene; Necessidade de apenas um antibiótico para selecção das plantas transformadas. A utilização de A. tumefaciens requer a utilização de dois antibióticos, um para eliminar a bactéria e um outro para a selecção das plantas transformadas.

51 Limitações da técnica: t Elevada destruição celular: as camadas celulares mais externas são denominadas de zona de morte por serem destruídas devido ao impacto ou fragmentação das partículas ou à rajada de ar produzida (Birch and Franks, 1991); Baixa estabilidade dos transformante: apesar de ocorrer integração de um gene no genoma de uma célula que poderá regenerar uma planta, esta integração não é estável, apenas 1-5% das células expressam integração estável (Finer and McMullen, 1990); Limitado na dimensão das construções genéticas: quanto maior o vector de expressão menor a possibilidade de sucesso; Permite repetições: existe a possibilidade de integrar várias vezes o mesmo gene no genoma da célula vegetal, dando origem a repetições e consequente expressão diferencial do mesmo gene; Desconhecimento do efeito que a velocidade das partículas pode causar, bem como da composição das mesmas, partículas de tungsténio podem oxidar resultando tóxicas para as células.

52 Selecção de tecidos geneticamente transformados Após transformação, mediada por Agrobacterium ou Bombardeamento de Partículas, o material vegetal será transferido para meio de cultura suplementado com antibiótico ou herbicida (depende do marcador de selecção utilizado. Ex.: se na cassete de expressão se integrou o gene que confere resistência ao antibiótico higromicina, o agente de selecção adicionado ao meio de cultura será este antibiótico). Apenas as células expressando o gene de selecção conseguem sobreviver ao agente utilizado originando plantas resistentes a esse. Assume-se que estas plantas, por possuírem o gene de selecção possuem também o gene de interesse (ambos os genes foram integrados na cassete de expressão utilizada).

53 A integração dos genes no genoma das plantas requer a extracção de DNA cromossomal das plantas putativamente transgénicas e sua análise por PCR. Na reacção de amplificação são utilizados primers específicos que permitem amplificar um fragmento do gene de interesse, ou qualquer zona presente na cassete de expressão (zona dos promotores, terminadores, gene de selecção, repórter ou de interesse). O resultado do PCR é observado por electroforese, onde a separação dos fragmentos de DNA ocorre de acordo com o seu peso molecular, através de uma corrente eléctrica, migrando do pólo negativo para o positivo. Hygromycin (HPTII) β-glucuronidase (GUS)

54 A obtenção de resistência a determinadas condições de stress biótico ou abiótico é possível utilizando métodos tradicionais ou convencionais. cruzamento entre espécies sensíveis (Vitis vinifera) e espécies resistentes a esse stress (V. rupestris) originando híbridos, alguns dos quais possuindo a característica desejada. No entanto, este método é muito moroso e não está isento de forte controvérsia, já que os híbridos assim obtidos podem colocar em causa a tipicidade do produto final. A biotecnologia, através dos seus métodos de propagação e transformação genética, apresenta grande potencial para o melhoramento de diversas espécies vegetais. Esta metodologia apresenta, relativamente aos métodos de melhoramento convencionais, as seguintes vantagens: - melhoramento de grande precisão, em que apenas o gene pretendido é introduzido no genoma da planta; - redução do tempo de obtenção da nova variedade; - inexistência de barreiras quanto à proveniência do gene responsável pela característica que se pretende introduzir, podendo ter origem em qualquer outra planta.