Capítulo 3 Clonagem de plantas proliferação de meristemas e organogénese Introdução Tipos de meristemas

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1 Sumário 7 Apresentação Lista de abreviaturas Capítulo 1 Introdução Geral O problema da alimentação à escala planetária O conceito de Biotecnologia A utilização das plantas e o aparecimento da agricultura Perspectiva histórica e métodos de estudo em Biotecnologia Vegetal...34 Capítulo 2 Cultura in vitro de plantas Introdução Totipotência da célula vegetal Multiplicação vegetativa Métodos convencionais de multiplicação vegetativa A cultura in vitro de plantas Condições de cultura Os recipientes Assepsia Factores físicos O meio de cultura Elementos minerais Vitaminas e aminoácidos Outros compostos Hidratos de carbono Hormonas vegetais Auxinas Citocininas Giberelinas Ácido abscísico Etileno... 71

2 8 Capítulo 3 Clonagem de plantas proliferação de meristemas e organogénese Introdução Tipos de meristemas Meristema apical da raiz Meristema apical do caule Objectivos da cultura de meristemas caulinares Funcionamento do meristema Propagação em larga escala Preparação da planta mãe Iniciação e estabelecimento das culturas Multiplicação Alongamento e enraizamento dos rebentos Aclimatização das plantas regeneradas Multiplicação de plantas isentas de vírus Conservação de germoplasma Vantagens da cultura de meristemas Limitações da técnica Indução de organogénese Capítulo 4 Embriogénese somática Introdução Embriogénese zigótica Embriogénese não zigótica Embriogénese somática Tipos de embriogénese somática Fases da regeneração de plantas por embriogénese somática Indução Desenvolvimento e maturação dos embriões somáticos Germinação dos embriões somáticos e conversão em plantas Sementes artificiais Estudos genéticos, bioquímicos e moleculares

3 4.7. Considerações finais Capítulo 5 Embriogénese polínica e obtenção de haplóides Introdução Ocorrência natural de haplóides Métodos de obtenção de haplóides Embriogénese polínica Desenvolvimento do pólen Vias androgénicas Dimorfismo polínico e culturas ab initio Factores que afectam a indução de androgénese Níveis de ploidia das plantas regeneradas Duplicação do número de cromossomas dos haplóides Utilização de colchicina Duplicação via formação de um calo Os haplóides e o melhoramento vegetal Problemas e limitações Albinismo Variabilidade das plantas regeneradas Capítulo 6 Suspensões celulares e metabolitos secundários Introdução Obtenção de suspensões celulares Medidas de viabilidade e crescimento celular Suspensões celulares e produção de metabolitos secundários Optimização de rendimentos Adição de precursores Biotransformação Elicitação Selecção de linhas celulares Transformação genética de plantas e produção de metabolitos secundários Produção de metabolitos em hairy roots Produção de metabolitos noutros órgãos Sistemas de cultura imobilizados Considerações finais

4 10 Capítulo 7 Protoplastos e hibridação somática Introdução Breve resenha histórica Isolamento de protoplastos Purificação de protoplastos Contagem e determinação da viabilidade Cultura de protoplastos Evolução das culturas Fusão de protoplastos Produtos de fusão Selecção dos produtos de fusão e caracterização das plantas obtidas Aplicações e limitações da utilização de protoplastos Capítulo 8 Transformação genética de plantas Introdução Transferência de genes por cruzamento e selecção Plantas geneticamente modificadas por engenharia genética Agrobacterium tumefaciens Mecanismo de infecção das células vegetais com Agrobacterium tumefaciens Ligação das bactérias às células vegetais Indução dos genes vir Processamento do T-DNA Transporte e integração do T-DNA nas células vegetais A utilização de A. tumefaciens na transformação experimental de plantas Genes quiméricos A transformação genética de plantas com A. tumefaciens Outros métodos de transformação Transformação de organitos citoplasmáticos Expressão dos genes nas plantas Capítulo 9 Plantas com novas características obtidas por transformação genética Introdução

5 9.2. Plantas tolerantes a herbicidas Plantas resistentes a insectos Plantas resistentes a agentes patogénicos Plantas resistentes a factores abióticos Produção de compostos de interesse Alteração das propriedades dos alimentos Alterações no amadurecimento dos frutos Alterações na coloração das flores Alterações nos teores de lenhina Rendimento das culturas Tecnologia terminator Outras características Capítulo 10 Impacto das plantas geneticamente modificadas Introdução Eventuais impactos em termos de saúde Eventuais impactos ambientais Eventuais impactos sócio-económicos Bibliografia Endereços internet

6 12

7 13 Apresentação Este livro tem uma história. A história começa em 1995 quando após a conclusão do doutoramento propus à comissão científica do então Departamento de Botânica a criação de uma disciplina de opção na área da Biotecnologia Vegetal. A proposta foi aceite e a disciplina foi incluída nos planos de curso das Licenciaturas em Biologia e Bioquímica Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra (FCTUC), com o nome de Introdução à Biotecnologia Vegetal tendo funcionado, pela primeira vez, no ano lectivo de 1996/97 e, com a excepção de uma interrupção no ano lectivo de 2002/03, de forma ininterrupta até ao presente. Na altura iniciavam se as primeiras culturas de plantas geneticamente modificadas com alguma expressão em termos globais e a bibliografia disponível para os alunos era muito limitada. Para além disso, ela encontrava se dispersa por diferentes livros e essencialmente disponível em língua inglesa. Este contexto levou me a elaborar uma sebenta onde reuni um conjunto de informação sobre os diferentes temas abordados nas aulas. Numa época em que a ciência evolui de forma tão acelerada a sebenta foi se adaptando a novas realidades. A componente mais relacionada com a clonagem de plantas reduziu se enquanto outros temas, como a obtenção de plantas haplóides e a engenharia genética de plantas ganharam protago nismo, muito em função do seu maior impacto em termos práticos no melhoramento das plantas. A minha inclusão no Centro de Estudos Farmacêuticos da Universidade de Coimbra permitiu me contactar com outras realidades e realizar alguma investigação na área dos metabolitos secundários das plantas, actualmente mais designados como produtos naturais.

8 14 O grande potencial da biotecnologia nesta área começa agora a ser explorado de forma mais consistente. Como consequência esta área do conhecimento passou a ter um peso mais alargado no funcionamento da disciplina e foi também incorporada na sebenta. O resultado desta evolução é o livro actual. No primeiro capítulo é feita uma introdução geral à biotecnologia e à sua importância no melhoramento de plantas Os fundamentos da cultura in vitro de células, tecidos ou órgãos vegetais são analisados no capítulo 2. O capítulo 3 trata das técnicas de clonagem in vitro relacionadas com a proliferação e formação de novo de meristemas. A embriogénese somática, também um método de clonagem mas igualmente com uma importância determinante em estudos de desenvolvimento embrionário é tratada no capítulo 4. As técnicas de obtenção de plantas haplóides e a sua importância no desenvolvimento de novas variedades são analisadas no capítulo 5 com um destaque particular para o potencial embriogénico do pólen. O capítulo 6 é sobre a cultura de células e o seu potencial de produção de metabolitos secundários. O interesse industrial destes compostos é também analisado tal como o potencial das raízes na formação de metabolitos secundários. O capítulo 7 é sobre os métodos de obtenção de protoplastos e o potencial das células desprovidas de parede na obtenção de novas combinações genéticas, os chamados híbridos somáticos. As técnicas de transformação genética de células vegetais, com particular destaque para o mecanismo de transferência de genes utilizando Agrobacterium tumefaciens são tratadas no capítulo 8. Segue se um capítulo onde são indicados vários exemplos de plantas com novas características obtidas por transformação genética. Essas novas características vão desde resistência a insectos ou herbicidas à produção de biofármacos. Finalmente, o último capítulo (10) tem como objectivo clarificar alguns conceitos que erroneamente têm sido divulgados na opinião pública lançando a confusão sobre as plantas geneticamente modificadas. No final é fornecida uma lista onde se descriminam os livros, artigos e teses que serviram de base para a elaboração deste livro bem como uma lista de endereços internet onde se pode obter informação complementar sobre os assuntos aqui abordados. Os capítulos 2 a 9 são essencialmente técnicos. Nos capítulos 1 e 10 são referidos alguns assuntos mais ou menos controversos relacionados com

9 as plantas geneticamente modificadas e onde a minha opinião está expressa. Como é de esperar essa opinião apenas me compromete a mim. O livro serve de suporte à actual disciplina de Biotecnologia Vegetal do curso de Biologia da FCTUC podendo ser usado em disciplinas similares de outras instituições do ensino superior. A sua preparação teve também o propósito de chegar a outros públicos alvo nomeadamente pessoal técnico ligado a empresas agrícolas, hortícolas ou florestais, professores do ensino secundário da área da biologia, pessoas cuja actividade profissional esteja de algum modo ligada ao melhoramento de plantas e mesmo o cidadão comum que apenas pretende manter se informado sobre este assunto em particular. Nesta perspectiva optou se, em algumas situações, por utilizar uma linguagem menos técnica que fosse de mais fácil acesso a pessoas sem grande formação específica na área. Um livro científico é como um gadget. Quando se leva para casa já está desactualizado. O autor agradece antecipadamente todas as correcções e sugestões que possam melhorar futuras edições desta publicação. 15

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