T E C N O L O G I A D N A R E C O M B I N A N T E. Alfredo J. M. Cravador

Transcrição

1 T E C N L G I A DE D N A R E C M B I N A N T E Alfredo J. M. Cravador

2 T E C N L G I A DE D N A R E C M B I N A N T E Alfredo J. M. Cravador FAR 2001

3 PREÂMBUL estudo da base molecular da vida só muito lentamente pôde progredir comparativamente ao das outras ciências, devido, por um lado, à ausência ou à imperfeição das técnicas de análise e de medida, mas fundamentalmente à complexidade dos sistemas biológicos. Não será todavia por isso que o progressivo desvendar dos mecanismos que regem a organização máxima da matéria deixa de ser um dos capítulos mais apaixonantes da História da Ciência moderna. Foi há cerca de 50 anos que WATSN e CRICK dobraram um dos cabos mais decisivos da história da ciência moderna, ao publicarem a estrutura do ácido desoxirribonucleico (DNA). Desde então, milhares de cientistas e investigadores têm-se interessado pelos diferentes aspectos da estrutura e da função do DNA, com o fim de compreenderem como a informação genética está contida na molécula de DNA, e como ela é tratada de maneira tão ordenada e precisa durante os processos biológicos. A conjugação de todos estes trabalhos de pesquisa levou à acumulação de um volume enorme de informações e de conhecimentos em genética molecular e ao desenvolvimento de uma metodologia nova, a engenharia genética. A engenharia genética ou seja, a pesquisa sobre o DNA recombinante baseia-se num conjunto de técnicas que conferem a possibilidade, até há pouco apanágio exclusivo da química relativamente a pequenas moléculas, de romper e formar ligações covalentes de maneira específica e controlada em moléculas de DNA. material genético pode hoje ser modificado, mutado, transferido, detectado ou sintetizado com as finalidades mais diversas tanto aplicadas como fundamentais. A possibilidade de criar combinações novas, não naturais, a partir de material genético de diferentes origens e de as introduzir em organismos hospedeiros que as perpetuam e multiplicam, deu uma dimensão nova à biotecnologia, dotou-a do refinamento próprio à engenharia genética. À exploração empírica dos fenómenos biológicos contrapõe-se, hoje, a construção racional de sistemas biológicos artificiais elaborados por manipulação genética no laboratório de investigação, antes de serem explorados industrialmente ou na produção agrícola. É neste contexto que deve ser considerada a engenharia genética, não como uma nova disciplina em si, mas antes como um instrumento de investigação poderoso que tem contribuído para um melhor conhecimento e aprofundamento do conceito de gene. Esta disciplina não só permite compreender melhor os mecanismos fundamentais da vida, mas também, pela manipulação dos organismos mais diversos, produzir substâncias úteis para a medicina, a agricultura e a indústria em geral. É de salientar que os extraordinários progressos realizados em engenharia genética só foram possíveis graças aos resultados da investigação fundamental obtidos nos campos da genética, da biologia i

4 celular, da enzimologia, da virologia, da imunologia, da química dos ácidos nucleicos e das proteínas, da cristalografia e que só a interacção das diferentes competências no seio desta área multidisciplinar permite abordar nas melhores condições a tecnologia da clonagem de genes. A racionalidade e os conhecimentos humanos tendo os seus limites, a nova era industrial e agrícola em que entrámos não é destituída da ameaças e só poderá beneficiar as populações humanas a longo termo se a exploração dos recursos biológicos respeitar os grandes equilíbrios naturais, os ciclos biológicos e preservar a riqueza do património biológico terrestre já amplamente enfraquecidos. mecanismo que o homem é agora capaz de manipular é o estado superior da complexidade da matéria e é também o mais frágil. Como corolário, o impacto da acção do homem na natureza passou a ser directo e profundo. As consequências poderão ser catastróficas ou positivas e só dependem de nós. As ciências da vida ao desembocarem no domínio das aplicações, a pequena ou a grande escala, tocaram a ecologia e a ética, dimensões que não podem deixar de estar intimamente associadas à formação científica que têm por missão ministrar. ii

5 ÍNDICE 1.S INSTRUMENTS DE BASE 2 1.a.As enzimas, suas actividades e utilizações 2 Endonucleases de restrição e metilases 2 utras endonucleases 8 Exonucleases e polimerases 9 Fosfatases 12 Ligação de fragmentos de DNA 13 1.b.A sequenciação de DNA Método químico ou de Maxam & Gilbert Método de terminação de cadeia ou de Sanger Utilização da PCR em sequenciação Sequenciação "automática" Sequenciação multiplex utras tendências Sequenciação de oligonucleotídeos Chromosome walking 32 1.c.Síntese química de DNA 32 I. Princípios da síntese química de DNA 33 1) Preparação dos blocos de base para a síntese 34 2) Desprotecção selectiva 40 3) Reacções de condensação 42 4) Construção da cadeia oligodesoxinucleotídica 43 5) Desprotecção 46 Rendimentos 48 6) Isolamento, purificação e caracterização 49 2.VECTRES DE CLNAGEM 50 a. s plasmídeos 50 Concepção de um vector plasmídico 52 b. Bacteriófagos 52 Empacotamento in vitro 54 c. Cosmídeos 55 d. fago M13 56 Conclusões MUTAGÉNESE DIRIGIDA 53 Eliminações 53 Inserções 54 Substituições 54 Mutagénese dirigida com oligonucleotídeos sintéticos 56 Selecção e identificação dos mutantes 59 Aplicações da mutagénese dirigida A TRANSFRMAÇÃ BACTERIANA BANC DE CLNES DE cdna 63 Esquema de construção de um banco de clones de cdna BANCS GENÓMICS MÉTDS DE DETECÇÃ E DE ANÁLISE DE CLNES 67 a) Hibridação in situ entre o DNA dos clones recombinantes e uma sonda de DNA radioactiva 67 b) Carta de restrição 67 c) Sequenciação dos nucleotídeos do inserto nos clones positivos por hibridação 68 d) Selecção do mensageiro específico por hibridação com o DNA recombinante e tradução in vitro 68 iii

6 e) Southern blotting 68 f) Escolha das sondas de DNA sintéticas A SÍNTESE QUÍMICA DE GENES SISTEMAS DE EXPRESSÃ: RGANISMS HSPEDEIRS - VECTRES 74 a. Expressão em E. coli 74 Vectores de expressão em E. coli 74 1) Construção de vectores de expressão 76 2) Vectores baseados no promotor PL de λ 77 3) λgt11 - vector de expressão derivado do fago λ 79 Identificação das placas produtoras 79 Limitações da produção na bactéria 80 Produção da hormona de crescimento humana (hgh) 81 Hormonas de crescimento animais 85 Produção de insulina humana 86 b. Expressão em Bacillus subtilis 88 c. Expressão na levedura 90 s vectores de expressão de S. cerevisiae 91 Exemplos de vectores de expressão para produção de proteínas exógenas em leveduras 92 1) A integração dirigida 95 2) isolamento de alelos mutantes 96 3) Regulação da expressão dos genes na levedura 96 4) Um intrão codifica para uma proteína reguladora 97 5) Estrutura do gene da ferromona de levedura (MFα) 99 d. Expressão nos fungos filamentosos 100 e. Expressão em células de mamíferos 103 Transferência de genes nas células de mamíferos (transfecção) 104 Co-transformação 106 Micro-injecção 106 Isolamento dos genes transferidos 106 Clonagem de oncogenes humanos 107 Vectores virais utilizados para transfectar as células de mamíferos 108 Vector SV a) Substituição da região tardia de SV b) Substituição da região precoce de SV Vector vaivém derivado de SV Vector BPV (Bovine Papilloma Virus) 110 Vectores derivados de retrovírus 110 f. Introdução de genes estrangeiros em óvulos fertilizados. Animais transgénicos 112 Expressão do DNA estrangeiro nos animais transgénicos 113 A utilização dos retrovírus 115 Conclusões e resumo 115 g. Expressão em células de insectos 116 Construção dum vector de transferência do baculovírus 118 Actividade biológica das proteínas recombinantes ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS 120 Agrobacterium tumefaciens 120 plasmídeo Ti como vector 123 Expressão controlada pela luz e específica de órgão, dum gene de trigo em plantas de tabaco 126 Plantas transgénicas 127 a) Resistência a herbicidas 127 b) Resistência a insectos 128 c) Resistência a vírus 130 d) Produtoras de péptidos 133 As plantas monocotiledóneas 134 iv

7 11. DNA RECMBINANTE E DIAGNÓSTIC EM MEDICINA 136 a. Alterações cromossómicas 136 b. Cartografia dos cromossomas humanos 137 c. Mapeamento do genoma humano por RFLP 139 d. Anomalias monogénicas e multifactoriais 141 e. diagnóstico de defeitos genéticos 142 1) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 143 2) Diagnóstico de mutações identificadas 144 ß-talassemias 144 a) Mutações sem sentido e frame shift 145 b) Mutações que afectam a transcrição 145 c) Mutações que afectam a maturação do RNA 146 d) Utilização dos oligonucleotídeos sintéticos 146 e) Anemia falciforme 148 A deficiência hereditária de α1-antitripsina 148 f. Detecção de mutações somáticas 150 g. Amplificação enzimática de DNA (PCR) 152 1) Detecção da anemia falciforme e da hemoglobina C por PCR 154 2) Detecção de doenças infecciosas por PCR 155 Detecção de HPVs 156 Detecção de HIV REGULAMENTAÇÃ SBRE A UTILIZAÇÃ DE RGANISMS RECMBINANTES E A PRTECÇÃ CNTRA S RISCS BILÓGICS 161 ANEX Directivas do Conselho da CEE 163 v

8 METDLGIA D DNA RECMBINANTE A tecnologia do DNA recombinante representa na realidade, um ramo da engenharia genética considerada no seu sentido lato. Ela diz respeito à recombinação in vitro do material genético por meio de enzimas. Estas manipulações in vitro só adquirem realmente um sentido quando o DNA recombinante é introduzido num hospedeiro biológico, onde pode ser mantido e propagado indefinidamente. Uma experiência típica de clonagem requer no mínimo a) um DNA objecto duma pesquisa; b) um vector de clonagem; c) enzimas de restrição; d) DNA ligase; e) células procariotas ou eucariotas que servem de hospedeiro biológico (Fig. 1.II.). Depois da introdução no hospedeiro, as moléculas recombinantes têm que ser isoladas e caracterizadas. Foi através deste processo de caracterização, que o conhecimento do gene foi progredindo. processo de clonagem em si, só fornece um meio de isolar e de identificar rapidamente os genes de interesse. Neste capítulo passaremos em revista os diversos métodos utilizados para clonar um gene. 1

9 1. S INSTRUMENTS DE BASE 1.a.As enzimas, suas actividades e utilizações Endonucleases de restrição e metilases Sempre que um bacteriófago λ se desenvolve numa estirpe de Escherichia coli C, os fagos resultantes da lise deste hospedeiro multiplicam-se muito mal noutra estirpe, de tipo K. Diz-se que o fago é "restrito" pela segunda estirpe bacteriana. Por outro lado, os fagos que escaparam à restrição são capazes de crescer normalmente se forem utilizados para reinfectarem a estirpe K. No entanto, se estes mesmos fagos passarem primeiro por E. coli C, ficam de novo restritos por E. coli K (Fig. 2.II). Portanto, a eficácia com a qual um fago se multiplica num hospedeiro depende da estirpe na qual ele se multiplicou anteriormente. Esta modificação não hereditária, conferida ao fago pela segunda estirpe (K) e que lhe permite voltar a multiplicar-se nesta estirpe sem ser de novo restrito, chama-se modificação. s fagos restritos adsorvem-se sobre os hospedeiros restritores e injectam o seu DNA normalmente. No entanto, este DNA é rapidamente degradado depois da injecção. A enzima responsável por esta degradação é uma endonuclease, também chamada endonuclease de restrição ou enzima de restrição. hospedeiro restritor tem evidentemente que proteger o seu DNA dos efeitos das enzimas de restrição que ele próprio contém; esta protecção é assegurada pela modificação do DNA. Mais precisamente, as modificações resultam da metilação (por metilases) de certas bases num número reduzido de locais do DNA, que constituem as sequências de reconhecimento para a enzima de restrição. É, pois, compreensível a razão pela qual um fago que escapa à restrição num dado hospedeiro, pode em seguida re-infectar eficazmente o mesmo hospedeiro: o DNA do fago ter-se-á replicado em presença da metilase de modificação e será protegido, assim como o DNA do hospedeiro, contra os efeitos de restrição. s processos de restrição e de modificação existem em todos os sistemas nos quais o DNA é transferido duma bactéria para outra. A conjugação, a transformação, a transdução e a transfecção estão todas submetidas ao sistema de restrição-modificação. s genes que especificam os sistemas res-mod podem residir no cromossoma do hospedeiro, ou podem estar localizados num plasmídeo ou num profago. As endonucleases de restrição classificam-se em 3 categorias. As pertencentes à classe I são constituídas por 3 subunidades e requerem como cofactores ATP, Mg2+ e S- adenosilmetionina. Possuem simultaneamente actividades de endonuclease e de metilase situadas em subunidades diferentes. s sítios específicos de reconhecimento, longos de 15 2

10 pares de base, são complexos, situando-se a cerca de 1000 pares de bases de distância do sítio de clivagem ou de metilação. Esta categoria é pouco interessante em tecnologia genética porque o local de clivagem não é específico. As endonucleases de restrição de classe III, constituídas por 2 subunidades têm ATP e Mg2+ como cofactores obrigatórios, mas não necessariamente a S-adenosilometionina. A região de clivagem situa-se de 5 a 10 ou de 25 a 27 pares de bases a jusante do sítio de reconhecimento. As do primeiro tipo clivam em geral sequências não palindrómicas, dando origem a populações heterogéneas com extremidades 5' protuberantes, enquanto que as do segundo tipo clivam o DNA em sítios fixos. As endonucleases de restrição de classe II são constituídas por uma única subunidade activa e requerem unicamente Mg2+ como cofactor. s locais de clivagem situam-se em geral dentro das sequências de reconhecimento compostas de 4 a 8 bases. A clivagem dá origem a extremidades 5' ou 3' protuberantes ou a extremidades rombas ("blunt-end"). Estas enzimas foram isoladas a partir de mais de 200 estirpes bacterianas representando quase todos os grupos de procariotas. Esta diversidade de enzimas torna indispensável a utilização duma nomenclatura apropriada. Cada enzima é representada por um código de 3 letras derivado do nome do género e da espécie da bactéria donde a enzima foi isolada. Hae por exemplo, significa que a enzima foi isolada de Haemophilus aegyptiens. A maioria das sequências de reconhecimento conhecidas é palindrómica, i.é., possui um eixo de simetria de rotação. Por exemplo a sequência de reconhecimento de EcoRI 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' lê-se da mesma maneira nas duas direcções sobre as cadeias opostas. arranjo simétrico dos locais de clivagem tem duas consequências importantes: 1) os cortes em posições desviadas em relação a cada uma das cadeias produzem extremidades monocatenárias que são complementares em orientação anti-paralela, mas idênticas em orientação paralela; 2) as extremidades de uma molécula de DNA criadas por uma enzima dada, com uma dada sequência de reconhecimento, podem formar pares de bases complementares com qualquer outra molécula de DNA que possua extremidades idênticas: 3

11 5'...G papaptptp C...3 ' EcoRI 5'... G H 3' + 5'pApApTpTpC... 3' 3'...C ptptpapap G...5' 3'... CpTpTpApAp5' 3' H G 5' fragmento A (corte 1) 5'... GH 3'... CpTpTpApAp B 5'... G H pa p A p T p T p C... 3' 3'... C p T p T p A p Ap H G...5' A papaptptpc... 3' H G...5' fragmento B (corte 2) Esta associação entre bases complementares pode ser completamente estabilizada, pela formação das ligações covalentes entre as extremidades 3'H e 5'-fosfato de cada uma das cadeias de DNA. Esta reacção de ligação é realizada com uma enzima específica, uma ligase, que tem, como veremos mais adiante, uma utilização importante em metodologia de DNA recombinante. Deve ser, no entanto, referido que nem todas as sequências reconhecidas são simétricas. Devido à existência de ambiguidades nos seus locais de reconhecimento, várias enzimas reconhecem até 4 sequências alvo diferentes. A digestão duma molécula de DNA com este tipo de enzima, pode originar extremidades não idênticas que não podem ser recombinadas ao acaso. Por exemplo, EcoRII reconhece as sequências seguintes: CCAGG GGTCC e CCTGG GGACC 4

12 Várias enzimas denominadas isoesquizómeras possuem sítios de reconhecimento idênticos. HindIII e HsuI por exemplo, partilham as mesmas sequências de reconhecimento e de clivagem AAGCTT. utras isoesquizómeras tais como SmaI (CCCGGG) e Xma I (CCCGGG) possuem a mesma sequência de reconhecimento mas clivam em sítios diferentes indicados por.utras enzimas, denominadas isocaudómeras, podem diferir pelo seu sítio de reconhecimento, mas originar extremidades complementares. Por exemplo, as digestões por BamHI (GGATCC), BglII (AGATCT), Bc1I (TGATCA) e Sau3A ( GATC) conduzem às extremidades coesivas 5'-GATC-3'. Todos os fragmentos de DNA formados por clivagem com qualquer combinação destas enzimas, recombinam-se entre eles. Assim, os fragmentos formados por digestão BamHI e BglII podem recombinar-se entre eles, mas neste caso a sequência recombinante 5'-GGATCT-3' é resistente à digestão por qualquer destas duas enzimas porque as bases externas da sequência hexanucleotídica de reconhecimento de BamHI e de BglII diferem (G/C e T/A respectivamente). BamHI Bg II 5'... G GATCT...3' 3'... CCTAG A...5' 5'...GGATCT...3' 3'...CCTAGA...5' não reconhecida por BamHI nem por BglII mas sim por MboI/Sau3A/DpnI No entanto, as moléculas originais e as recombinantes podem ser clivadas por outras enzimas tais como DpnI, Sau3A e MboI e podem ser facilmente distinguidas. Estas enzimas reconhecem a sequência tetranucleotídica 5'-GATC-3' central e não são influenciadas pelas bases que a ladeiam. As endonucleases de restrição têm certas propriedades particulares: 1) Actividade parasita conhecida por "star" que é uma alteração na especificidade da sequência reconhecida, em condições de ph ou iónicas particulares. Por exemplo, um aumento do ph, um abaixamento da concentração em NaCl, ou a substituição do Mg por Mn alteram a especificidade de EcoRI que passa a reconhecer a sequência tetranucleotídica 5'- AATT-3' que ocorre mais frequentemente. Esta nova especificidade é denominada EcoRI* (Eco star). 5

13 2) Sequências na vizinhança de sequências de reconhecimento podem influenciar a actividade duma enzima, privilegiando a clivagem de certos sítios em relação a outros de mesma especificidade. Por exemplo, a actividade de EcoRI pode variar no plasmídeo pbr322 ao ponto de atingir diferenças de velocidade de 56x, em função da localização do sítio em relação a certas sequências. 3) A temperatura é outro factor que influencia o desenrolar da clivagem. Certos pequenos fragmentos oligonucleotídicos desnaturam-se quando a temperatura da reacção enzimática é superior à sua temperatura de dissociação. Certas enzimas têm a sua actividade óptima de funcionamento a temperaturas elevadas (65-79 C), tais como TaqI, Tth111I, Tth111II isoladas de organismos termófilos. 4) Quando o sítio de reconhecimento de certas enzimas se situa perto de uma extremidade da molécula de DNA a actividade diminui. Quando dois sítios idênticos ficam demasiados próximos só um deles é clivado, porque após a primeira clivagem o segundo sítio fica perto duma extremidade da molécula. Esta propriedade está relacionada com o fenómeno de dissociação mencionado em 3). 5) A probabilidade de uma sequência de restrição estar representada num local com n pares de bases, numa molécula de DNA, composta de 50 % de AT e de 50 % de CG é P = 1 n 4 em que n é o número de bases que comporta o sítio. Uma sequência tetranucleotídica dada aparecerá num DNA em média cada 44=256 pares de base e uma hexanucleotídica cada 46=4096 pares de base. Se for conhecida a composição em GC de um DNA e o seu comprimento, é possível prever o número de vezes que uma sequência de restrição, de composição e comprimento dados, aparece representada. s diferentes fragmentos formados por digestão com uma enzima de restrição podem ser separados por electroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida (Fig. 3.II.). s fragmentos correm no gel em função do comprimento e podem ser visualizados por coloração com o brometo de etídio, que se intercala entre as duas cadeias do DNA. A utilização de várias enzimas isoladamente, ou em combinação, permite estabelecer a carta de restrição duma molécula de DNA (Fig.4.II. e 5.II.). A carta indica as posições em que uma enzima particular cliva o DNA. A distância entre os locais de clivagem expressa-se em pares de bases (medida em relação a um padrão de referência). 6

14 As metilases, ou enzimas de modificação, protegem o DNA de um organismo da actividade endonucleásica ao nível das sequências reconhecidas pela(s) enzima(s) de restrição própria(s) ao organismo. Estas enzimas, que possuem actividades de metilase e ausência de actividade de restrição, são a dam metilase, e a dcm metilase que fixam o grupo CH 3 (m de metilo) em posição N6 da adenina e em posição C5 da citosina respectivamente, no interior dos sítios de restrição. Dam-DNA adenina metilase GAmTC Dcm-DNA citosina metilase CCm A/TGG NHCH 3 NH 2 N N N CH 3 N N N N6-metiladenina C5-metilcitosina Enquanto que certas enzimas de restrição reconhecem unicamente sequências alvo não metiladas, os seus isoesquizómeros clivam tanto os sítios metilados como os não metilados. HpaII (C/CGG), por exemplo, cliva o tetranucleotídeo não metilado, enquanto que o isoesquizómero MspI cliva a mesma sequência não metilada ou metilada (CCmGG). As células de eucariotas contêm habitualmente citosinas metiladas em proporção que pode atingir 10 %. Se bem que de menor importância que no DNA de eucariotas, a metilação da adenina é altamente relevante no DNA dos procariotas. A metilação dos resíduos adenina pode ser testada por enzimas, tais como Sau3A ( GATC), MboI ( GATC) e DpnI (GATC). Enquanto que Sau3A cliva tanto 5'-GATC-3' como 5'-GAmTC-3', MboI cliva unicamente a sequência não metilada e DpnI cliva exclusivamente 5'-GAmTC-3'. Uma sequência hemimetilada, i.é. uma sequência metilada só numa cadeia é resistente à DpnI. Sempre que for necessário clivar DNA de procariotas em qualquer local possível, este DNA tem que ser preparado a partir de estirpes de E.coli que são dam-. Se bem que a maior parte das estirpes de E.coli possua actividades de restrição e de metilação, certas estirpes utilizadas em engenharia genética possuem uma, ou outra, ou nenhuma destas actividades. Ex.: EcoK12 possui actividades de metilase e de restrição 7

15 MM294 possui modificação mas não restrição RRI não possui nem uma nem outra utras endonucleases [para além das que possuem outra(s) actividade(s)] α) Desoxi- (Fig. 6.II.) Desoxirribonuclease I (DNase I) (pâncreas bovino). Actividade: endonuclease, cadeia dupla ou cadeia simples. Com Mg++ ataca cada cadeia independentemente e não gera obrigatoriamente extremidades rombas. Com Mn++ cliva as duas cadeias no mesmo sítio e gera fragmentos com extremidades rombas ou só com um ou dois nucleotídeos protuberantes. Utilização: - na introdução de nicks ao acaso em DNA bicatenário a fim de o preparar para a marcação radioactiva por nick translation; - na introdução dum nick em DNA circular a fim de o preparar para a mutagénese mediada por bissulfito (secção 3); - na criação de clones ao acaso para sequenciação em vectores de bacteriófago M13; - na análise de complexos proteína-dna. ß) Ribonucleases Ribonuclease A (pâncreas bovino)(fig. 7.II.). Actividade: endonuclease - ataca o RNA em 3' de bases pirimidínicas e cliva o fosfato em 5' do nucleotídeo adjacente. Dá origem à formação de nucleotídeos pirimidínicos-3'p e de oligonucleotídeos com pirimidinas-3'p. Utilização: - na remoção de regiões não hibridadas de RNA nos híbridos DNA-RNA; - no mapeamento de mutações singulares em DNA ou em RNA (desemparelhamentos de um par de bases entre RNA e DNA são reconhecidos e clivados pela RNase A). Ribonuclease T1 (Aspergillus oryzae)(fig. 8.II.) Actividade: endonuclease - ataca o RNA em 3' da guanosina e cliva o 5'-fosfato do nucleotídeo adjacente. Dá origem a guanosinas ou a oligonucleotídeos com guanosina-3'p. Utilização: - na remoção de regiões não hibridadas de RNA em híbridos DNA-RNA. 8

16 Exonucleases e polimerases α) DNA polimerase I (E. coli) (Fig. 9.II.) Actividades: exonuclease 5' 3' e 3 ' 5' polimerase 5' 3' reacção de troca Utilização: - marcação de DNA por nick-translation. - Na marcação de DNA com extremidades 3' protuberantes. ß) Fragmento de Klenow da DNA polimerase de E.coli (Fig. 10.II.) Actividades: exonuclease 3' 5' polimerase 5' 3' reacção de troca Utilização: - preenchimento das extremidades 3' retraídas formadas por digestão de DNA com enzimas de restrição; - marcação de DNA por preenchimento das extremidades 3' retraídas, com nucleotídeos trifosfatos 32P; - marcação terminal de DNA com extremidades 3' protuberantes; - síntese da segunda cadeia de cdna em clonagem de cdna; - síntese da segunda cadeia de DNA a partir de matrizes monocatenárias em mutagénese in vitro; - sequenciação de DNA pelo método dos didesoxinucleotídeos (terminação de cadeia). γ) T4 DNA polimerase (Fig. 11.II.) Actividades: exonuclease 3' 5' polimerase 5' 3' Utilização: - como o fragmento de Klenow, é utilizada na marcação de DNA por preenchimento de extremidades 3' retraídas; - na marcação das extremidades de fragmentos de DNA, rombas ou protuberantes em 3' (reacção de troca); 9

17 - na marcação de fragmentos de DNA para uso como sondas de hibridação por digestão parcial de DNA bicatenário utilizando actividade exonuclease 3' 5' seguida por reacção de preenchimento, utilizando a actividade polimerásica e [α32p]dntp; - na conversão de extremidades protuberantes (5' ou 3') de DNA bicatenário, em extremidades rombas; - na extensão do iniciador (primer) oligonucletídico mutagénico hibridado à matriz de DNA monocatenário, em mutagénese in vitro. δ) Taq polimerase (Thermus aquaticus)(fig. 12.II) Actividade: polimerase 5' 3' Utilização: - na amplificação in vitro de sequências específicas de DNA por reacção em cadeia (Polymerase Chain Reaction-PCR); - na sequenciação de DNA ε) RNA polimerases dependentes de DNA de bacteriófagos SP6, T3 e T7 (Fig. 13.II) Actividade : RNA polimerase 5' 3' Utilização: - na síntese de RNA monocatenário para utilização como sondas de hibridação, como mrnas funcionais em sistemas de tradução in vitro, ou como substratos em reacções de splicing in vitro. Cada uma destas três polimerases possui um grau elevado de especificidade para com o seu promotor. - No caso do sistema de transcrição do bacteriófago T7, para expressão de genes clonados em bactérias. ζ) Poli(A) polimerase (Fig. 14.II) Actividade: polimerisa AMP (derivado de ATP) na extremidade 3'-H livre do RNA. Utilização: - preparação de poli (A)- RNA para clonagem; - marcação da extremidade 3' de RNA com [α- 32 P]ATP para preparar sondas de hibridação. η) Reverse transcriptase (transcritase reversa) (Fig. 15.II.) (vírus aviano de mieloblastose) Actividades : polimerase 5' 3' DNA. A matriz tanto pode ser o DNA como o RNA. Exorribonuclease 5' 3' e 3' 5' (RNase H) Degrada especificamente o RNA em híbridos DNA-RNA. 10

18 Utilização: - síntese de cdna para clonagem (1a e 2a cadeia) ou para sondas de hibridação; - marcação de extremidades de fragmentos de DNA protuberantes em 5' (reacção de preenchimento). - Também pode ser utilizada em sequenciação de DNA pelo método de terminação de cadeia com os didesoxirribonucleotídeos. θ) Nuclease Bal 31 (Fig. 16.II.) Actividades: exo e endonuclease 5' 3' e 3' 5' Utilização: - remoção de nucleotídeos das extremidades de DNA bicatenário de maneira controlada. DNA encurtado pode ser ligado a adaptadores (linkers) ou a vectores com T4 ligase; - construção de mapas de sítios de restrição; - mapeamento de estruturas secundárias do DNA, por exemplo junções entre B-DNA e Z-DNA, ou sítios de modificação em DNA bicatenário; - remoção de nucleotídeos de RNA bicatenário para preparação de RNAs recombinantes. ι) Nuclease S1 (Fig. 17.II.) Actividade: nuclease específica de DNA monocatenário ou RNA; utilização: - análise de estrutura de híbridos DNA-RNA; - remoção de extremidades livres (tails) de fragmentos de DNA para produzir extremidades rombas; - abertura do gancho formado durante a síntese de cdna bicatenário; - na análise da estrutura dos híbridos RNA-DNA. κ) Mung-bean nuclease suave. Actividade : nuclease específica de cadeia simples semelhante à nuclease S1 mas mais Utilização: - converter extremidades protuberantes de DNA em extremidades rombas. λ) Exonuclease VII (Fig. 18.II.) Utilização: - recuperação de cdna inserido em vectores plasmídicos por "tailing" dadt; Actividades: exonucleásica sobre cadeia simples de DNA, 3' 5' e 5' 3'; dispensa Mg++ e trabalha em presença de EDTA. 11

19 - construção de mapas dos intrões e dos exões. µ) Exonuclease III (Fig. 19.II.) Actividades: exonuclease 3' 5' de DNA bicatenário com extremidades 3'H retraídas. -3' fosfatase. Utilização: - Preparação de DNA linear como molde para a DNA polimerase (p.ex. na sequenciação pelo método dos didesoxi; vd. secção sequenciação); -preparação de sondas específicas de uma cadeia; -remoção de sequências das extremidades de fragmentos de DNA, criando eliminações unidireccionais a partir da extremidade 3'H retraída; -degradação preferencial da cadeia parental não tiofosfatada, no método de mutagénese específica pontual que recorre a derivados tiofosfato (vd. secção 3) ν) Exonuclease λ (Fig. 20.II) Actividade: exonuclease 5' 3' em cadeia dupla de DNA com um fosfato em 5'. Utilização: -na modificação da extremidade 5'-fosfato dos DNAs substratos ulteriores doutras enzimas (ex.: remoção da extremidade 5'-protuberante do DNA antes do "tailing" com a terminal transferase). Fosfatases Fosfatase alcalina - CAP (intestino de vitela), BAP (bactéria) (Fig. 21.II.) Actividades: catalisa a remoção dos fosfatos em 5' do DNA bicatenário ou monocatenário, do RNA e de trifosfatos dos desoxirribonucleotídeos e dos ribonucleotídeos. Utilização: -eliminação dos grupos fosfato em 5' do DNA ou do RNA para permitir a marcação com 32P em 5' pela T4 polinucleotídeo kinase e [γ32p]atp, numa reacção de troca; - remoção do fosfato em 5' do DNA a fim de impedir a auto ligação. T4 polinucleotídeo Kinase (Fig. 22.II.) Actividades: catalisa a transferência de fosfato γ de ATP para a extremidade 5'H do DNA mono ou bicatenário e do RNA por reacção de fosforilação de 5'H ou de troca com 5'P. Utilização: - marcação da extremidade 5' do DNA para a sequenciação pela técnica de Maxam-Gilbert; 12

20 - fosforilação de oligonucleotídeos sintéticos, ou de outro DNA, para ligação; - marcação de oligonucleotídeos para serem utilizados como sondas de hibridação; Ligação de fragmentos de DNA Existem dois métodos que permitem estabelecer ligações covalentes de DNA in vitro. primeiro utiliza uma enzima que intervém na replicação do DNA, a que já nos referimos anteriormente, a DNA ligase (extraída de E.coli ou de células infectadas pelo fago T4). A enzima derivada do fago T4 é até capaz de realizar a ligação entre moléculas de DNA com extremidades rombas, reacção que é estimulada pela RNA ligase de T4. T4 DNA ligase (Fig. 23.II.) Actividade: ligação de extremidades coesivas e de extremidades rombas. Utilização: -catalisa a ligação covalente de moléculas de DNA com extremidades coesivas complementares; - ligação covalente de extremidades rombas em moléculas de DNA bicatenário, umas com as outras, ou com adaptadores ("linkers") sintéticos (observação: a T4 ligase é mais eficaz nas ligações de extremidades rombas). T4 RNA ligase (Fig. 24.II) Actividade: catalisa a ligação covalente de extremidades 5' fosforiladas de DNA monocatenário ou de RNA, a extremidades 3'H de DNA monocatenário ou de RNA. Utilização: -marcação radioactiva das extremidades 3' de RNA (pequenas moléculas tais como os pnps são substratos eficazes); - síntese de oligodesoxirribonucleotídeos. segundo método utiliza uma enzima que é capaz de adicionar extremidades coesivas aos fragmentos de DNA. Quando por vezes é necessário ligar fragmentos de DNA desprovidos de extremidades coesivas complementares, recorre-se a uma enzima que permite adicionar, in vitro, sequências homopoliméricas complementares, aos fragmentos de DNA. método baseia-se na utilização duma enzima isolada de timo de vitelo, a terminal desoxirribonucleotidiltransferase (terminal transferase). Em presença de um nucleotídeo trifosfato, a enzima adiciona este nucleotídeo de maneira repetida às extremidades 3' do DNA. 13