O pbr322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade científica, tendo permitido identificar recombinantes por selecção negativa

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1 O pbr322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade científica, tendo permitido identificar recombinantes por selecção negativa

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3 Validação de colónias seleccionadas - Miniprep (Extracção e isolamento de plasmídeo a partir de uma cultura em meio líquido), Colony PCR (reacção de PCR com pequena amostra da colónia) ou Electroforese directa Miniprep Análise de Restrição PCR PCR Electroforese directa

4 1. Isolation of Plasmids from E. coli by Alkaline Lysis Purification of plasmid DNA from Escherichia coli using alkaline lysis (1,2) is based on the differential denaturation of chromosomal and plasmid DNA in order to separate the two. Bacteria are lysed with a solution containing sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium hydroxide. During this step, chromosomal as well as plasmid DNA are denatured. Subsequent neutralization with potassium acetate allows only the covalently closed plasmid DNA to reanneal and to stay solubilized. Most of the chromosomal DNA and proteins precipitate in a complex formed with potassium and SDS, which is removed by centrifugation. The plasmid DNA is concentrated from the supernatant by ethanol precipitation. Using this procedure, 2 5 μg of DNA can be obtained from a 1.5-mL culture of E. coli containing a pbr322-derived plasmid, and three- to five-fold higher yields can be expected from puc-derived plasmids (3).

5 2. Isolation of Plasmids from E. coli by Boiling Lysis The boiling lysis procedure (1) is quick to perform and, therefore, especially suitable for screening large numbers of small-volume Escherichia coli cultures. It is described with different adaptations in a variety of protocol books (2,3). The quality of the isolated plasmid DNA is lower than that from an alkaline lysis miniprep, but it is sufficient for restriction analysis. The bacteria are lysed by treatment with lysozyme, Triton, and heat. The chromosomal DNA remains attached to the bacterial membrane and is removed by centrifugation. The plasmid DNA remains in the supernatant from which it is then precipitated with isopropanol.

6 3. Isolation of Plasmids from E. coli by alkaline lysis followed by anion-exchange resin Plasmid purification protocols are based on a modified alkaline lysis procedure, followed by binding of plasmid DNA to a anionexchange resin under appropriate low-salt and ph conditions. RNA, proteins, dyes, and lowmolecular weight impurities are removed by a medium-salt wash. Plasmid DNA is eluted in a high-salt buffer and then concentrated and desalted by isopropanol precipitation.

7 MiniPrep (baseado em lisozima) Extracção de DNA plasmídico (MINIPREP) Perto da chama transferir cerca de 1,5 ml de cultura bacteriana para um tubo de 1,5 ml estéril Centrifugar à velocidade máxima durante 1 minuto para recolher as bactérias no fundo do tubo Ressuspender o sedimento em 200 μl de STET e adicionar 4 μl de lisozima (50 mg/ml) Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos Ferver durante 45 segundos Centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima Remover o sedimento com um palito ou ponta estéril Adicionar 200 μl de isopropanol e agitar o tubo Centrifugar à velocidade máxima durante 10 minutos Eliminar o sobrenadante e deixar secar até desaparecer o odor do isopropanol, evitando que o sedimento seque em demasia Ressuspender em μl de água destilada estéril agitando a base do tubo com os dedos Conservar a preparação de DNA a -20 ºC ou em gelo se for utilizada de imediato

8 As colónias seleccionadas têm sempre que ser sujeitas a validação Validação por Análise de restrição EcoRI 1 cdna (800 bp) PstI 700 EcoRI Plasm colónia branca1 + PstI Plasm colónia branca2 +PstI Plasm colónia branca3 +PstI

9 As colónias escolhidas têm sempre que ser sujeitas a validação( miniprep ou colony PCR ) Validação por PCR e/ou Sequenciação SP6, T7, T3, M13, SÃO SEQUÊNCIAS (PROMOTORAS OU NÃO), A PARTIR DAS QUAIS SE PODEM FAZER PRIMERS, E QUE ESTÃO ESTRATEGICAMENTE POSICIONADAS EM PLASMÍDEOS PARA AMPLIFICAR REGIÃO DO INSERT (FLANQUEIAM O MCS).

10 Validação por PCR e/ou Sequenciação: SP6 T7 T3 M13

11 Validação por PCR e/ou Sequenciação:

12 Operações associadas a clonagem de genes - Resumo 1. Digestão de restrição 2. (Introdução de um local de restrição - > PCR) 3. Converter uma extremidade coesiva em não-coesiva

13 Operações associadas a clonagem de genes - Resumo 4. Desfosforilação do vector 5. Fosforilação do insert 6. Ligação do vector ao insert

14 Mas afinal que aspecto tem um plasmídeo?

15 Mas afinal que aspecto tem um plasmídeo?

16 Os plasmídeos podem ser caracterizados pela densidade de super-enrolamentos (σ), fenómeno que origina diferentes topoisómeros. Valores crescentes de σ indicam estruturas com carácter de super-enrolamento crescente.

17 A ramificação é outra característica estrutural de plasmídeos e aumenta linearmente com o tamanho

18 Migração de fragmentos lineares de DNA em gel de agarose

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21 a) Fill in the blanks with the identities of the uncut DNA bands labeled A, B, and C: A B C b) How many times does XhoI cut the DK15 DNA? Justify your answer in one sentence. c) How many times does SspI cut the DK15 DNA? How do you know? You are a bit puzzled by the SmaI result, and show your gel to Kate to get her input. Kate concludes that the DK15 DNA contains two SmaI sites even though you observed three bands on your gel. d) Assuming that Kate is correct, propose a simple explanation for your observation of three bands. Explain your answer by stating the probable identity of each band you observed, and how you deduced this.

22 λ/bsteii puc19 puc19/ HindIII λ λ/bsteii λ/hindiii A sequência de reconhecimento da HindIII é A AGCTT, a qual ocorre 1 vez no puc19 e 7 vezes no fago λ.

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