MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MOLECULAR. Artur Alves, Isabel Henriques, Ana Santos, Marta Tacão & António Correia. Tipagem Genética de Microrganismos

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1 MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MOLECULAR Artur Alves, Isabel Henriques, Ana Santos, Marta Tacão & António Correia Tipagem Genética de Microrganismos AVEIRO

2 A. ALVES, I. HENRIQUES, A. SANTOS, M. TACÃO & A. CORREIA Tipagem Genética de Microrganismos Lab. de Diversidade Microbiana Centro de Biologia Celular Dep. de Biologia, U. de Aveiro Aveiro Tel: Fax i

3 Índice Introdução 1 Protocolos experimentais 9 RFLP's - Ribotipagem 2 Extracção de DNA total bacteriano 9 Digestão de DNA com endonucleases de Rep - PCR 3 restrição 10 Transferência por vácuo 12 Electroforese em campo pulsado 4 Marcação por PCR da sonda de DNA 16S 13 Hibridação e Detecção 14 Sequências nucleotídicas 6 Preparação de DNA em blocos de agarose 16 Digestão de DNA embebido em agarose 17 Electroforese em campo pulsado 17 BOX-PCR 18 Ligação de produtos de PCR a vector 19 Transformação 19 Extracção de DNA plasmídico 20 Preparação de um gele de agarose 21 Referências 23 i

4 Introdução A correcta identificação e classificação de microrganismos é de extrema importância prática, não só no aspecto clínico mas também na fitopatologia, biotecnologia e estudos ambientais. Os métodos usados na discriminação de géneros, espécies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em métodos fenotípicos e genotípicos. Os métodos fenotípicos baseiam-se em fenómenos bioquímicos, fisiológicos e biológicos, enquanto os métodos genotípicos detectam polimorfismos ao nível dos ácidos nucleicos, ou variação alélica ao nível de enzimas. A tipagem de microrganismos, i.e., a capacidade de os identificar ao nível da espécie, e de discriminar entre indivíduos da mesma espécie conheceu grandes avanços nos últimos anos, tendo sido galvanizada por uma série de novos métodos que fazem uso da tremenda variação encontrada no DNA destes microrganismos. O desenvolvimento de técnicas moleculares de tipagem de microrganismos, abriu novas possibilidades nos campos da classificação, identificação e diagnóstico. O conhecimento sobre a filogenia e evolução dos microrganismos foi também grandemente ampliado. Figura 1: Capacidade discriminatória de diferentes métodos de tipagem genética de microrganismos. Qualquer método de tipagem genética deve permitir a diferenciação clara de estirpes, e principalmente, deve ter uma elevada reprodutibilidade. Nem todos os métodos moleculares de tipagem são igualmente eficazes, diferindo nomeaedamente na capacidade discriminatória em diferentes níveis taxonómicos (Fig 1). Como tal, a escolha do método a ser aplicado deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida (e.g. identificação, diferenciação), entre outros aspectos, (reprodutibilidade, poder discriminatório, custos envolvidos, etc). 1

5 RFLP s - Ribotipagem RFLP s - Restriction Fragment Length Polymorphisms, polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição Este método tem por base a digestão de DNA com endonucleases de restrição (ER s), e posterior separação dos fragmentos obtidos por electroforese em gel de agarose, originando padrões de restrição. Os padrões de restrição obtidos podem ser característicos ao nível da espécie ou mesmo da estirpe, dependendo do grau de heterogeneidade genómica intraespecífica. Este é um dos primeiros métodos de tipagem de DNA utilizado para avaliar a relação entre estirpes. A detecção de fragmentos comuns a estirpes pertencentes a uma mesma espécie, ou mesmo perfis típicos de determinados grupos, tornam esta técnica de grande interesse taxonómico. Assim, podem ser identificados fragmentos de restrição que passam a funcionar como marcadores moleculares diagnosticantes, por exemplo ao nível da espécie. A técnica de RFLP s apresenta como vantagens o facto de ser altamente reprodutível e de não necessitar de informação prévia sobre a sequência de DNA. Recorre-se à designação de RFLP s directos quando se analisam directamente os perfis obtidos por electroforese. Embora esta análise seja dificultada pelo elevado número de fragmentos, é possível restringi-la a uma gama de pesos moleculares correspondentes à zona de maior resolução do gel. Obviamente apresenta-se uma desvantagem, que é o facto de apenas uma fracção do genoma ser analisada. A combinação da análise de fragmentos de restrição com hibridação, usando sondas específicas de modo a reduzir o número de bandas a analisar, é a versão mais utilizada desta técnica. Como os genes de rdna estão presentes em várias cópias no genoma, a utilização dos rdna s como sondas permite detectar, após hibridação, vários fragmentos de restrição (Fig. 2). Algumas sequências desta região genómica são altamente conservadas que mesmo sondas heterólogas hibridam fortemente com elas, enquanto outras regiões genómicas variam consideravelmente, mesmo entre níveis taxonómicos próximos. Esta variante dos RFLP s recebe a designação de ribotipagem. Kb 23.1 M Figura 2: Padrões de bandas resultantes de ribotipagem. O DNA total das estirpes 1 a 6 foi digerido com EcoRI e os fragmentos resultantes, após separação electroforética, foram transferidos para uma membrana de nylon. A hibridação com uma sonda para rdna 16S resultou nos padrões da figura. 1 a 6 - estirpes de Brevibacterium linens; M - marcador de peso molecular. 2

6 rep-pcr Método de tipagem baseado na amplificação via PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos. A técnica de rep-pcr faz uso de primers complementares de sequências de DNA repetitivas altamente conservadas, e presentes em múltiplas cópias nos genomas da maioria das bactérias Gram-negativas e várias Gram-positivas. Três famílias de sequências repetitivas foram identificadas, incluindo a sequência REP ( Repetitive Extragenic Palindromic ) de pb, sequência ERIC ( Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus ) de pb, e o elemento BOX de 154 pb. Estas sequências parecem estar localizadas em posições intergénicas distintas no interior do genoma. Os elementos repetitivos podem estar presentes em ambas as orientações, e os primers foram desenhados de modo a promover a síntese de DNA a partir da repetição invertida nos REP e ERIC, e da subunidade boxa nos BOX, amplificando assim regiões genómicas distintas localizadas entre os elementos repetitivos. Os protocolos correspondentes são designados REP-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR, e rep- PCR colectivamente. A amplificação com os primers REP ou ERIC pode ser efectuada com um só primer, ou com um ou vários conjuntos de primers. No caso do elemento BOX utiliza-se um único primer (Fig. 3). A aplicação de diferentes abordagens a uma amostra aumenta o poder de discriminação. Kb M Figura 3: Padrões obtidos por ampliação de DNA total de várias estirpes do género Brevibacterium com o primer BOX A1R. 1 a 6 - estirpes de B. linens; 7, 8 - estirpes de B. casei; 9, 10 - estirpes de B. iodinum; M - marcador de peso molecular. O método de tipagem designado por rep-pcr é extremamente fiável, reprodutível, rápido e altamente discriminativo. Esta técnica tornou-se uma ferramenta valiosa na identificação e classificação de bactérias, e em estudos epidemiológicos de patogénicos de humanos e fitopatogénicos. 3

7 Electroforese em campo pulsado PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" Com o advento da técnica de PFGE, que permite a separação de fragmentos de DNA de grande tamanho (desde as centenas de quilobases até às megabases), surgiram novas abordagens ao estudo da organização de genomas. A electroforese convencional limita a análise de DNA a fragmentos que poderão ter no máximo, 20 a 50 kb, necessitando o uso de agarose a muito baixa concentração para a separação de fragmentos de mais de 20 kb. Acima destes tamanhos, não há diferenças de mobilidade que permitam a separação de fragmentos de acordo com o peso molecular. Com a alternância periódica do campo eléctrico, as moléculas são permanentemente forçadas a modificar a orientação em que se movem. Quanto mais longa for a molécula, maior o tempo que necessita para que encontre uma orientação que favoreça o movimento ao longo do gel. Estes são os princípios que determinaram a criação de configurações que permitissem a aplicação de dois campos eléctricos, com diferente orientação, a um gel de agarose. Foram desenvolvidos aparelhos com diversos tipos de configurações de eléctrodos. O sistema de campo eléctrico homogéneo, (CHEF, "contour-clamped homogeneous electrical field") é actualmente o mais usado e apresenta uma série de eléctrodos dispostos nos lados de um hexágono e com os dois campos eléctricos formando um ângulo de 120º (Fig. 4). Ao longo de cada um dos lados do hexágono forma-se uma distribuição gradual de potenciais, resultando num campo eléctrico homogéneo em todo o gel e, consequentemente, carris perfeitamente rectos. Este tipo de configuração é actualmente muito usada para tipagem de estirpes bacterianas, nomeadamente bactérias entéricas. Outras aplicações, incluem a elaboração de mapas físicos de pequenos genomas e a cariotipagem electroforética de pequenos organismos eucariotas Figura 4: Funcionamento do sistema CHEF. Os campos eléctricos funcionam alternadamente segundo cada uma das diagonais do gel. Como resultado, as moléculas de DNA migram num percurso rectilíneo ao longo do gel. 4

8 Os perfis de restrição obtidos com endonucleases de baixa frequência de corte (Fig. 5) têm sido usados por diversos autores para diferenciar estirpes da mesma espécie. O procedimento pode revelar-se interessante para análise de estirpes com interesse comercial, para comparação de isolados ambientais com interesse agrícola, ou inclusivamente encontrar aplicações na análise epidemiológica de isolados clínicos. A electroforese de campo pulsado utiliza uma matriz de agarose, com o gel submerso num tampão de alta força iónica, normalmente TBE. O ideal é correr o gel a uma temperatura compreendida entre 12 e 15 ºC: temperaturas superiores originam bandas mal definidas e a temperaturas muito baixas são necessárias electroforeses muito prolongadas. A concentração de agarose ideal é de 1%, não apresentando concentrações superiores qualquer melhoria na resolução. Kb Figura 5: Perfis de restrição PacI (TTAATTAA) de Corynebacterium lactofermentum (3) e C. glutamicum (4) resolvidos por PFGE. 1 - Cromossomas de S. cerevisiae; 2 - concatâmeros de DNA do fago ë. Para moléculas de tamanhos na ordem de várias megabases, pode ser útil baixar a concentração de agarose para valores da ordem dos 0.5% de modo a diminuir o tempo de electroforese, embora com obtenção de bandas menos definidas. Para separação de fragmentos lineares até 1 Mb, o potencial do campo eléctrico é em geral de 6 V/cm. Para moléculas de grande tamanho como por exemplo cromossomas de fungos, usam-se valores de 2 a 2.5 V/cm. As moléculas de DNA de topologia circular, apresentam uma mobilidade em campo eléctrico pulsado que parece não depender directamente do tempo de alternância de campo. 5

9 Sequências nucleotídicas Discriminação e/ou identificação através de sequências de DNA A discriminação entre microrganismos superficialmente semelhantes pode também ser efectuada através da determinação das sequências nucleotídicas de genes evolutivamente conservados. Desta forma, é possível detectar diferenças subtis entre estirpes. A sequenciação de DNA tem vindo a ser aplicada por exemplo, na epidemiologia molecular de doenças bacterianas. Para esse efeito, utiliza-se a reacção de PCR para amplificar os genes a sequenciar. As sequências alvo incluem genes para proteínas de superfície, genes de resistência a antibióticos, "housekeeping genes" e mais frequentemente, os genes codificando para rrna 16S. Para cada situação pode ser necessário determinar empiricamente qual o gene cuja sequenciação é mais indicada. Por vezes, a sequenciação é usada em conjunto com outros métodos de tipagem, nomeadamente PFGE, permitindo examinar a transferência horizontal de genes entre estirpes da mesma espécie. Este método, embora mais dispendioso é muito útil para identificar e discriminar microrganismos difícieis de cultivar. O método pode ser aplicado a culturas complexas, em que por vezes alguns dos componentes da população são difíceis ou impossíveis de cultivar. Para esse efeito, ujma colecção de fragmentos representando a sequência-alvo e resultantes de amplificação por PCR a partir de uma população mista, podem ser clonados num vector apropriado, introduzidos em E. coli e após selecção dos transformantes, os insertos presentes em diferentes clones são sujeitos à determinação da sequência nucleotídica. AMOSTRA Clínica, ambiental, industrial PCR ii) Ligação ao Vector Transformação de E. coli i) Sequenciação directa Sequenciação de insertos Análise de sequências Figura 6: Os dois procedimentos mais utilizados para caracterizar sequências nucleotídicas com fins de identificação e/ou discriminação de microrganismos. i 6

10 Assim são possíveis dois procedimentos alternativos (Fig. 6): i) amplificação por PCR e sequenciação directa dos fragmentos amplificados, sem necessidade de clonagem; ii) clonagem dos fragmentos amplificados procedendo-se depois à determinação da sequências de insertos individuais. O primeiro procedimento é normalmente utilizado para microrganismos em cultura pura e abundante, o segundo, para culturas mistas ou para microrganismos de difícil cultivo. LIGAÇÃO AO VECTOR A ligação dos produtos de PCR é feita na presenca de DNA ligase e de um vector apropriado. Existem vectores plasmídicos que replicam em E. coli particularmenbte adequados à clonagem de fragmentos obtidos por amplificação por PCR A figura 7 apresenta o mapa de um desses vectores, pcr 2.1, da Invitrogen. O vector contém uma regioão com múltiplos locais de restrição, genes de resistência a antibióticos para seleccionar os transformantes que adquiriram o plasmídeo e um gene lacz, cuja sequência é interrompida pela presença de um inserto, passando o gene a ser não-funcional. pcr 2.1: 3929 nucleotides LacΖα gene: M13 Reverse priming site: Multiple Cloning Site: T7 promoter: M13 (-20) Forward priming site: f1 origin: Kanamycin resistance ORF: Ampicillin resistance ORF: puc origin: Figura 7: Mapa do vector de E. coli pcr 2.1, para clonagem de fragmentos de DNA obtidos por PCR. TRANSFORMAÇÃO A transformação é o tipo mais simples de transferência de genes: uma célula receptora adquire genes de moléculas de DNA solúveis no meio. É este o procedimento usado em laboratório para transferir para E. coli o produto de uma reacção de ligação. O processo de transformação, embora ocorrendo nos ambientes naturais, é optimizado no laboratório com a preparação prévia das células: a cultura de E. coli a utilizar é tratada de forma a ser tornada "competente", tornando-se mais eficiente na aquisição de DNA exógeno. 7

11 Após a transformação, as células são semeadas em placas de meio de cultura com agente selectivo adicionado (um antibiótico, normalmente ampicilina ou canamicina, por vezes ambos) e incubadas durante cerca de 18 horas a 37 ºC. Neste tipo de meio, apenas se irão dividir as células que receberam vector. As células não transformadas, não terão oportunidade de formar colónias. A diferenciação entre colónias contendo plasmídeo com inserto das que contêm plasmídeo sem inserto é feita pela cor: branca e azul respectivamente (Fig. 8). A coloração azul resulta da presença do composto X-Gal, que é alterado pelo gene LacZ, como se de lactose se tratasse. Por isso, nas colónias em que a presença de inserto interrompe o gene LacZ, não há lugar ao desenvolvimento de cor azul. Figura 8: Colónias brancas e azuis resultantes do crescimento em meio selectivo de E. coli transformada com um vector com selecção pelo LacZ. 8

12 Protocolos Experimentais Extracção de DNA total bacteriano Genomic DNA purification kit MBI Fermentas 1. Inocular meio TSB com uma colónia isolada e incubar a 37 C com agitação, durante 15 a 18 horas ( overnight ). 2. Transferir 2 ml de cultura para um microtubo e sedimentar as células centrifugando 5 min. à velocidade máxima ( rpm). 3. Retirar todo o sobrenadante. 4. Ressuspender o sedimento em 200 µl de TE. Procedimento utilizado para bactérias Gram -. Para bactérias Gram, adicionar lisozima (25 ml de solução stock a 10 mg/ml; 1 hora a 37ºC). 5. Adicionar 400 µl de solução de lise e incubar a 65 ºC durante 5 min. 6. Adicionar 600 µl de clorofórmio e misturar por inversão (3 a 5 vezes). 7. Centrifugar durante 3 min. à velocidade máxima. 8. Preparar a solução de precipitação misturando 720 µl de água desionizada com 80 µl de solução concentrada 10 vezes. 9. Transferir a fase superior aquosa de DNA para outro tubo e adicionar 800 µl de solução de precipitação. 10. Misturar suavemente à temperatura ambiente durante 1 a 2 min. 9

13 11. Centrifugar durante 2 min. à velocidade máxima ( rpm). 12. Remover o sobrenadante e dissolver o DNA em 100µl de solução de NaCl 1.2 M. 13. Adicionar 2 µl de solução de RNase e incubar a 37 C durante 10 min. Solução stock de RNase a 10 mg/ml, previamente fervida. 14. Adicionar 300 µl de etanol absoluto, frio (-20 ºC). 15. Precipitar o DNA a 20 ºC durante 10 min. 16. Centrifugar durante 3 a 4 min. à velocidade máxima. 17. Descartar o etanol. 18. Lavar o sedimento com etanol a 70 %, frio (centrifugar 3 min. à velocidade máxima). 19. Desprezar o etanol e secar o DNA sedimentado. 20. Ressuspender o DNA em 100 µl de TE. Digestão de DNA com endonucleases de restrição Que quantidade de DNA digerir? O DNA digerido pode ter por destino apenas o registo da imagem do gel (gel analítico) ou pode ser usado para extrair uma banda do gel de agarose (gel preparativo). Em qualquer das situações é necessário que a(s) banda(s) sejam visíveis ao UV após coloração pelo EtBr. Para este efeito, é necessário que cada banda contenha pelo menos 50 ng de DNA. Exemplo 1: digere um plasmídeo recombinante que inclui 3 kb de vector e 2 kb de inserto; usa uma enzima de cuja acção resultam três fragmentos: o vector linearizado (3 kb), o extremo 5' do inserto (0.5 kb) e o extremo 3' do inserto (1.5 kb). A menor banda (0,5 kb) representa 1/10 do plasmídeo. Para visualizar esta banda terá que digerir 10 x 50 ng ou seja, 500 ng de DNA (0.5 mg). As três bandas presentes no gel conterão 300 ng, 50 ng e 150 ng de DNA, respectivamente. Serão claramente visíveis no gel e a banda maior deverá ter uma intensidade 6 x superior à da banda menor. Exemplo 2: digere o mesmo plasmídeo com uma enzima que efectua apenas um corte. Se digerir 500 ng de DNA obtém uma banda no gel demasiado intensa; o gel estará sobrecarregado. Demasiado DNA pode resultar num 10

14 padrão de migração alterado, tornado difícil calcular as dimensões dos fragmentos. A. Protocolo típico: 1. Marque os microtubos onde vai efectuar as digestões. 2. Em cada microtubo prepare uma reacção do tipo da indicada na tabela I. Tabela I: Reacção típica de digestão com enzima de restrição. Volume Tampão 10x 1 µl ddh2o 6.5 µl DNA a digerir 2 µl Enzima 0.5 µl 3. Adicione primeiro o volume de água, depois o tampão. ddh2o: Água bidestilada; é conveniente misturar primeiro o tampão e a água. Se a enzima for colocada directamente em água, pode desnaturar irreversivelmente. 4. Dissolva bem o DNA a digerir. 5. Adicione o volume de enzima. Enzima: 0.5 a 1 ml de enzima é em geral suficiente; não se deve usar um volume de enzima superior a 10 % do volume final da reacção, já que as preparações comercias de enzimas de restrição contêm glicerol, o qual, em excesso, pode inibir a reacção. 6. Incubar a 37 ºC durante 3 a 5 horas. A maioria das enzimas de restrição têm uma temperatura óptima de 37 ºC; no entanto, existem enzimas que devem ser incubadas a temperaturas diferentes (25 º C, 50 ºC, etc.); verificar as instruções do fabricante. B. Precipitação do DNA após a digestão (opcional) 1. No final da incubação, adicione 2, 5 volumes de EtOH a 20 ºC. 2. Misture bem. 3. Coloque o tubo a 20 ºC durante pelo menos uma hora. 11

15 As digestões podem ser conservadas por períodos longos em EtOH a 20 ºC. 4. Centrifugue à velocidade máxima durante 10 a 15 minutos para recolher o DNA precipitado. 5. Seque totalmente de modo a eliminar todo o EtOH. 6. Dissolva em TE. Transferência por vácuo Adaptado de Sambrook et al., Tratar o gel com solução despurinizante durante 10 minutos, com agitação suave. O volume de solução deve ser suficiente para manter o gel submerso. 2. Retirar a solução despurinizante e adicionar aproximadamente o mesmo volume de solução desnaturalizante. 3. Manter durante 30 minutos com agitação suave. 4. Retirar a solução anterior e adicionar o mesmo volume de solução neutralizante. 5. Manter durante 30 minutos com agitação suave. 6. Entretanto cortar uma membrana de nylon cujas dimensões sejam superiores em 1 cm às dimensões do gel. 7. Humedecer a membrana em água destilada. 8. Colocar a membrana na unidade de transferência e efectuar a montagem do sistema de acordo com as instruções do fabricante. 9. Colocar suavemente o gel sobre a membrana. Evitar que se formem bolhas de ar entre o gel e o filtro. 10. Com o auxílio de uma pipeta de vidro, deitar sobre o gel a solução de transferência (SSC 20X). 12

16 11. Transferir durante 60 minutos aplicando uma pressão de 50 mbar. 12. Retirar todo o líquido; remover o gel e, finalmente, a membrana. 13. Lavar o filtro em SSC 2X durante 5 minutos. 14. Secar e fixar o DNA durante 5 minutos num transiluminador de UV. Solução despurinizante: 0.25 N HCl Solução desnaturalizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M NaOH Solução neutralizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M Tris-HCl, ph 7.2; 1 mm EDTA SSC 20x: 3 M NaCl; 0.3 M Citrato de sódio; ph 7.0 Marcação por PCR da sonda de DNA 16S Durante as reacções de PCR a enzima Taq DNA polimerase tem a capacidade de incorporar DIG-dUTP nas cadeias de DNA que são sintetizadas de novo. 1. Preparar a reacção de PCR de acordo com a tabela II. Tabela II: Reacção de marcação por PCR (50 µl) Quantidade [ ] final H2O Variável Tampão de PCR 10X, sem MgCl2 2.5 µl 0.5 X Tampão de PCR 10X, com (NH4)2SO4 2.5 µl 0.5 X MgCl2 6 µl 3 mm PCR DIG Labeling Mix 5 µl 200 µm Primer fd1 1.5 µl 0.3 µm Primer rd1 1.5 µl 0.3 µm DNA molde variável, ng Taq polimerase 1U/µl 1 µl 1 U PCR DIG Labeling Mix (Roche): 2 mm datp, 2 mm dgtp, 2 mm dctp, 1,9 mm dttp e 0,1 mm DIG-11-dUTP; Primer fd1: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' ; Primer rd1: 5' AAG GAG GTG ATC CAG CC 3' (Weisburg et al, 1991) 13

17 2. Após a reacção de amplificação, carregar 5 µl da reacção num gel de agarose, usando marcadores de peso molecular adequados. Apenas uma banda deve estar presente no gel de agarose após coloração com EtBr; quantidades mínimas de produtos secundários podem resultar em sinais inespecíficos na reacção de hibridação. 3. Verificar a qualidade da reacção de amplificação e quantificar o DNA obtido. 4. Caso necessário, purificar a banda a partir do gel de agarose. Hibridação e Detecção Pré-hibridação: O processo de pré-hibridação tem como objectivo bloquear locais de ligação inespecíficos na membrana. 1. Colocar a membrana num tubo de hibridação. 2. Adicionar 20 ml de solução de hibridação por cada 100 cm 2 de filtro. Solução de hibridação: SSC 5X; Agente bloqueador 1 %; Sarcosil 0,1 %; SDS 0,02 %. 3. Manter à temperatura de hibridação durante 2 horas. Hibridação: A temperatura de hibridação é estimada com base no tamanho da sonda marcada e da percentagem de homologia esperada entre o DNA do fragmento sonda e o DNA alvo. Geralmente para sondas 100 % homólogas, a hibridação deverá decorrer a ºC na ausência de formamida, ou a 42-45ºC na presença de 50 % de formamida. 4. Desnaturar a sonda, fervendo durante 10 minutos. 5. Colocar em gelo o tubo contendo a sonda. 6. Desprezar a solução utilizada na pré-hibridação. 7. Adicionar o mesmo volume de solução de hibridação na qual foi previamente diluída a sonda marcada. 8. Colocar no forno de hibridação, à temperatura de hibridação, durante horas. 14

18 9. Após a hibridação, retirar a membrana. A solução de hibridação pode ser reutilizada; para esse efeito, deve conservar-se a -20ºC. 10. Lavar a membrana em solução I, duas vezes, durante 5 min. à temperatura ambiente. 11. Lavar a membrana em solução II, duas vezes, durante 15 min. à temperatura de hibridação. Solução I: SSC 2 X; SDS 0.1 %. Solução II: SSC 0.5 X; SDS 0.1 %. 12. Após a hibridação e lavagens, equilibrar a membrana durante 5 minutos em tampão de ácido maleico. Detecção: A detecção de sequências homólogas é efectuada com o Sistema DIG de Marcação e Detecção Não-radioactiva de Ácidos Nucleicos (Roche). 13. Bloquear a membrana em solução bloqueadora durante 30 minutos. 14. Diluir o conjugado anti-digoxigenina-fosfatase alcalina (Roche) em solução bloqueadora (1:5 000). 15. Remover a solução bloqueadora. 16. Incubar a membrana com a solução contendo anticorpos, durante 30 minutos. 17. Descartar a solução de anticorpos. 18. Lavar a membrana duas vezes, durante 15 minutos com tampão de ácido maleico. Estas lavagens permitem remover o anticorpo não ligado. 19. Equilibrar a membrana em tampão de detecção durante 5 minutos. 20. Entretanto, preparar a solução corante adicionando 200 µl de solução concentrada de NBT/BCIP (Roche) a 10 ml de tampão de detecção. 21. Incubar a membrana com solução corante, na ausência de luz. 22. Observar periodicamente para verificar o desenvolvimento das bandas. 23. Parar a reacção lavando a membrana com água ou TE, quando o desenvolvimento do sinal for satisfatório. 15

19 Tampão de ácido maleico: ácido maleico 0.1 M; NaCl 0.15 M; ph 7.5 Solução bloqueadora: 1% de Agente bloqueador (Roche) em Tampão de àcido maleico Tampão de detecção: Tris-HCl 0.1 M; NaCl 0.1 M; MgCl2 50 mm; ph 9.5 Preparação de DNA em blocos de agarose Adaptado de Gautom, Crescer a estirpe em meio TSB a 30 ºC, com agitação. 2. Determinar a DO da cultura, e calcular o volume a utilizar de modo a usar na preparação dos blocos 5 x 10 8 células/ml de agarose (considerar que no caso de bastonetes 1 DO = 8 x 10 8 células). 3. Sedimentar as células por centrifugação. Lavar em 1/10 de TE. Ressuspender em 500 µl de TE. 4. Adicionar um volume de agarose de baixo ponto de fusão (preparada a 1 % em TE), previamente aquecida a 42 ºC. 5. Misturar e distribuir imediatamente por moldes. Deixar solidificar a 4 ºC. 6. Colocar os blocos de agarose em 10 volumes de solução de lise. Incubar durante 24 horas a 37 ºC. 7. Descartar a solução de lise e adicionar 10 volumes de solução EPS. Manter a 50 ºC durante 24 horas. 8. Incubar os blocos em TE 2 x 1 hora, com agitação suave. 9. Conservar os blocos em 20 mm Tris-HCl ph 8.0; 50 mm EDTA, a 4 ºC. Solução de lise: Lisozima 1 mg/ml; Tris-HCl ph 7.2, 10 mm; NaCl 50 mm; EDTA 100 mm; Deoxicolato sódico 0.2 %; Sarcosil 0.5 % Solução EPS: EDTA, ph 8.0, 100 mm; Sarcosil 1 %; Proteinase K 50 mg/ml TE: Tris-HCl 10 mm, ph 7.5; EDTA 1 mm 16

20 Digestão de DNA embebido em agarose Utilizam-se enzimas de restrição que reconhecem sequências pouco frequentes, de modo a obter fragmentos de DNA de grande tamanho. Na preparação das reacções de hidrólise devem ser tomadas precauções de forma a evitar a quebra do DNA embebido em agarose. 1. Colocar o bloco a digerir em TE, durante 2 horas a 4 ºC. 2. Retirar o TE e adicionar 1 ml de tampão de digestão; manter 2 horas a 4 ºC. 3. Renovar o tampão de digestão até um volume final de cerca de 100 µl. 4. Adicionar 10 a 25 U de enzima. 5. Manter 12 a 16 horas a 4 ºC. 6. Incubar à temperatura recomendada para cada enzima durante 3 horas. 7. Retirar o tampão e adicionar 500 µl de TE. 8. Lavar durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação. 9. Carregar o bloco tratado no gel ou renovar o TE e conservar a 4 ºC Electroforese em campo pulsado 1. Preparar o gel TBE 0.5 X e com uma concentração de agarose de 1%. 2. Ajuste a temperatura do sistema de arrefecimento do aparelho para uma temperatura entre os 10 e os 14 ºC. 3. Carregue os blocos de agarose digeridos nos poços do gel, com o gel fora da tina. 4. Selar os poços com agarose de baixo ponto de fusão. 5. Coloque o gel na tina e ajuste as condições de electroforese. 6. Verifique a temperatura do tampão e a sua circulação na tina. 7. Inicie a corrida. 17

21 BOX-PCR 1. Preparar a reacção de amplificação de acordo com a tabela III: Tabela III: Reacção para BOX-PCR (50 µl) Volume [ ] final H2O variável 10x PCR buffer sem MgCl2 2.5 µl 0.5 x 10x PCR buffer com (NH4)2SO4 2.5 µl 0.5 x MgCl2 6 µl 3 mm dntp s 5 µl 200 µm Primer BOX A1R * 2 µl 0.4 µm DNA molde variável ( ng) Taq polimerase 1 U/µl 1 µl 1 U * Primer BOX A1R - 5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3' (Versalovic et al, 1994) 2. Proceder à amplificação por PCR. Perfil de temperatura para a amplificação: desnaturação inicial de 7 min. a 95 ºC; 30 ciclos: desnaturação a 94 ºC, 1 min.; annealing a 53 ºC, 1 min.; extensão a 65 ºC, 8 min; extensão final de 16 min. a 65 ºC. No final, manter os tubos a 4 ºC. 3. Observar uma alíquota de cada reacção de PCR num gel de agarose a 1% em TAE 1X. 18

22 Ligação de produtos de PCR a vector 1. Num microtubo preparar a reacção de ligação, segundo a composição indicada na tabela IV. Tabela IV: Reacção de ligação de produtos de PCR. Vector pcr 2.1 (25 ng/µl) 2 µl Quantidade Produto de PCR 0.5 a 1 µl Tampão de ligase 10x 1 µl Ligase do fago T4 dh2o estéril até volume final de 10 µl 4 U 2. Incubar a reacção a 14 ºC durante 12 a 16 horas. 3. A reacção pode ser imediatamente utilizada ou armazenada a -20 ºC. Transformação 1. Descongelar em gelo uma alíquota ( µl) de células competentes de E. coli. 2. Adicionar 2-10 µl da reacção de ligação às células competentes misturando suavemente. 3. Manter em gelo por 30 minutos. 4. Submeter as células a um choque térmico durante 30 segundos a 42 ºC. 5. Colocar novamente em gelo durante 2 minutos. 6. Adicionar 250 µl de meio SOC. 7. Incubar durante 1 hora a 37 ºC e com agitação. 8. Semear µl da transformação em placas de meio LA suplementado com o antibiótico adequado, e quando necessário X-Gal e IPTG. 9. Incubar as placas a 37 ºC durante 15 a 18 horas. 10. Com palitos estéreis, replicar clones positivos para uma nova placa. 11. Proceder a caracterização do DNA plasmídico dos transformantes. 19

23 X-Gal: solução stock preparada a 20 mg/ml em dimetil-formamida; usar a 40 m g/ml IPTG: solução stock preparada a 100 mm, em água; usar a 0.05 mm Extracção de DNA plasmídico 1. Inocular uma colónia com um palito estéril em 1.5 ml de meio LB, suplementado com o antibiótico adequado. 2. Incubar a 37 ºC durante 15 a 18 horas, com agitação. 3. Sedimentar as células por centrifugação, a rpm, durante 5 minutos. 4. Ressuspender em 350 µl de STET. 5. Adicionar 10 µl de solução de lisozima. Solução de lisozima preparada a 10 mg/ml 6. Deixar a lisozima actuar 1 minuto. 7. Colocar o microtubo em água a ferver durante 45 segundos. 8. Centrifugar 5 minutos a rpm. 9. Retirar o sedimento com um palito estéril. O sedimento é constituído por resíduos celulares e DNA cromossómico. 10. Adicionar 1 volume de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M, ph Misturar e manter à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar o DNA plasmídico. 12. Centrifugar a rpm, 5 minutos. 13. Lavar o precipitado com etanol a 70 %. 14. Ressuspender em 30 µl de TE. STET: 0.1 M NaCl; 5 % Triton X-100; 10 mm Tris-Hcl, ph 8.0; 1 mm EDTA TE: 10 mm Tris-HCl, ph 7.5; 1 mm EDTA 20

24 Preparação de um gel de agarose Para um gel a 0.7 % com um volume de 100 ml 1. Pesar 0.7 g de agarose (Fig. 9-A). 2. Com uma proveta (Fig. 9-B), medir 100 ml de tampão (TAE ou TBE). 3. Num Erlenmeyer misturar a agarose e o tampão (Fig. 9-C). A B C Figura 9: A - Pesagem da agarose. B - Medição do volume apropriado do tampão. C - A agarose não solubiliza no tampão, formando uma solução turva. 4. Ferver num forno de micro-ondas até clarear a solução (Fig. 10-A). 5. Entretanto, efectuar a montagem da plataforma do gel e do respectivo pente (Fig 10- B). A B Figura 10: A - Uso do micro-ondas para solubilizar a agarose; B- Preparação da plataforma para o gel, com o respectivo pente. 21

25 6. Esperar que a temperatura da agarose baixe até cerca de 50 º C. 7. Verter a agarose na plataforma (Fig. 11-A). 8. Deixar solidificar à temperatura ambiente. 9. Colocar o gel na tina, submergido em tampão. A B C Figura 11: A- Vertendo a agarose na plataforma; B - O pente é retirado com o gel já submerso em tampão, dentro da tina (C). 10. Retirar o pente (Fig 11-B, C). 11. Adicionar tampão de carga às amostras (Fig. 12-A). 12. Carregar o gel, uma amostra em cada poço. (Fig 12-B). A B Figura 12: A - Adição do tampão de carga, normalmente contendo corantes azuis; B - Carregando uma amostra. 13. Ligar a tina à fonte, tendo em atenção a polaridade correcta. 14. Ajustar a voltagem e iniciar a corrida. 22

26 15. Seguir a evolução da corrida através da migração dos corantes presentes no tampão de carga. 16. Terminada a electroforese, retirar o gel. 17. Corar com EtBr (5 ìg/ml) durante cerca de 15 minutos. 18. Observar num transiluminador de UV. 19. Registar os resultados, fotograficamente ou com um sistema de análise de imagem. TAE: 40 mm Tris-HCl; 5 mm acetato de sódio; 2 mm EDTA; ph 8.0 TBE: 90 mm Tris-HCl; 90 mm ácido bórico; 2 mm EDTA; ph 8.3 Tampão de carga (6X): 0.02 % azul de bromofenol; 0.02 % xileno cianol; 60 % sacarose; M EDTA EtBr: Brometo de etídeo. Solução stock a 500 ìg/ml, em água. Referências Gautom R.K Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia coli O157:H7 and other gram-negative organisms in 1 day. Journal of Clinical Microbiology 35: Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T Molecular cloning - a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Versalovic J.,Schneider M.,de Bruijn F.J., Lupski J.R Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and Cellular Biology 5: Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lupski J.R S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173:

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