Protocolos LabDros. Organizado por: Gabriel da Luz Wallau, Meio de Cultura Estoque para Drosophila. Meio de Drosophila Especial

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1 Protocolos LabDros Organizado por: Gabriel da Luz Wallau, kg de Farinha de milho grossa; - 200g de germe de trigo; - 1 xícara de açúcar; - 2 colheres de leite em pó; - 1 colher de sal; - 800g de Farinha de milho média. Meio de Cultura Estoque para Drosophila - 9g de farinha - 0,5g de ágar - meio pote de banana - 100ml de H 2 O - 0,26g de nipagim - diluir em álcool - diluir em água - misturar tudo Para 100ml de meio Meio de Drosophila Especial Meio de cultura de bactérias - 1g de Peptona. - 1g de NaCl. - 0,5g de Extrato de levedura. - Completar até 100ml de H 2 O destilada

2 Acertar ph=7 *Para meio sólido acrecentar Ágar correspondente da concentração desejada (geralmente 1,5%). Autoclavar. Crescer bactérias com plasmídeo 10,5ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 3ml 17,5ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 5ml 75ul de ampicilina (20mg/ml) para meio de 30ml Extração de plasmídeo (lise alcalina) Colocar bactérias (ex.: PBS) a crescer em meio de 30ml com ampicilina, overnight a 37ºC. Solução de ressuspenção (A): 5ml - 0,4ml de TRIS 1M ph=8-0,1ml de EDTA 0,5M - 4,5ml de H 2 O destilada Solução de lise (B): 5ml - 1ml de NaOH 1M - 0,5ml de SDS 10% - 3,5ml de H 2 O destilada - Centrifugar (5min.) de meio já semeado em tubo falcon (várias vezes), retirando o sobrenadante. - Ressuspender em 1ml de solução (A). Vortex. - Acrescentar 1ml de solução (B). Misturar com cuidado. - Acrescentar 1ml de Acetato de Potássio 5M. Misturar com cuidado. - Deixar (10 a 15 min.) no freezer. - Centrifugar (15min.). Retirar o sobrenadante para o tubo de vidro e descartar o tubo falcon. - Acrescentar 2 volumes de etanol gelado ou 1 volume de isopropanol. Misturar bem. - Overnight no freezer. - Centrifugar (20min.).

3 - Retirar o etanol virando o tubo. - Secar o plasmídeo na estufa (menos de 40 o C). - Acrescentar 200ul de TE (varia conforme a quantidade de plasmídeo) esperar ressuspender. - Colocar 1ul de RNAse. Deixar no banho maria (30 a 60 min.) 37 o C, passar para eppendorf. - Correr em gel de agarose 0,8% para purificação. Extração de plasmídeo (lise alcalina) Mini-prep - Colocar bactérias (ex.: PBS) a crescer em meio de 3ml com ampicilina, overnight a 37ºC. Solução de ressuspenção (A): 5ml - 0,4ml de TRIS 1M ph=8-0,1ml de EDTA 0,5M - 4,5ml de H 2 O destilada Solução de lise (B): 5ml - 1ml de NaOH 1M - 0,5ml de SDS 10% - 3,5ml de H 2 O destilada - Centrifugar (1min.) de meio já semeado em um eppendorf (várias vezes), retirando o sobrenadante. - Ressuspender em 200ul de solução (A). Vortex. - Acrescentar 200ul de solução (B). Misturar com cuidado. - Acrescentar 200ul de Acetato de Potássio 5M. Misturar com cuidado. - Deixar (10 a 15 min.) no freezer. - Centrifugar (15 min.). Retirar o sobrenadante para novo tubo. - Acrescenatr 2 volumes de etanol ou 1 volume de isopropanol. Misturar bem. - Overnight no freezer. - Centrifugar (10 min.) - Descartar o etanol virando o eppendorf. - Secar plasmídeo na estufa (menos de 40 o C). - Acrescentar 30ul de TE (varia conforme a quantidade de plasmídeo) esperar ressuspender. - Colocar 1ul de RNAse. Deixar no banho maria (30 a 60 min.) 37 o C. - Correr em gel de agarose 0,8% para purificação. Purificação de bandas com vidro ¹

4 - Correr no gel o produto de PCR ou DNA genômico. - Cortar as bandas desejadas. - Coloca-se 300ul de NaI 6M + 2ul de TRIS 1M ph=8 no eppendorf com as bandas. - Deixar (15 min.) à 60 o C, mexer cuidadosamente. - Colocar 50ul de vidro, mexer durante 2 minutos. - Deixar (10 min.) na geladeira - Centrifugar (1 min.), descartar o líquido, com pipeta. - Acrescentar 150ul de etanol 70% no eppendorf. - Mexer, centrifugar mais (1 min.), descartar o líquido. - Acrescentar 150ul de etanol 70%. - Mexer, centrifugar mais (1min.), descartar o líquido. - Deixar secar na estufa, 40 o C por 1:30h. - Ressuspender em 10 ou 15ul de H 2 O miliq (dependendo da intensidade da banda purificada). Deixar (15 min.) à 60 o C. - Centrifugar (3 min.). Retirar sobrenadante para eppendorf novo. - Aplicar certa quantidade no gel. Purificação de Plasmídeo com PEG - Certa quantidade de amostra e acrescenta-se 1 volume de PEG. - Deixar na geladeira por 30 min, mas pode-se deixar por 5 a 6 horas - Centrifugar (15 min.). - Descartar o sobrenadante. - Lavar com etanol 70%, duas vezes. Em cada vez centrifugar (1 min.) - Descartar o sobrenadante, deixar secar e ressuspender o pelet com H 2 O miliq. Purificação de Plasmídeo com Clorofórmio/PEG - Acrescentar 1 V de clorofórmio, agitar no vortex. - Centrifugar (10 min.), passar sobrenadante para eppendorf novo. - Acrescentar 10ul de Acetato de Amonia 7,5M, misturar bem. - Colocar 2 V de etanol absoluto, misturar. - Overnight no freezer. - Centrifugar (15 min.), secar na estufa. - Ressuspender com 30 ul de TE. - Colocar PEG (1 V) - Deixar ressuspender durante (20 min.) na bancada. - Centrifugar (20 min.). - Passar etanol 70% uma ou duas vezes (centrifugar 5 min.). - Ressuspender com 30 ul de H 2 O miliq.

5 Purificação de PCR com PEG - Certa quantidade de amostra e acrescenta-se 1 volume de PEG. - Deixar na geladeira overnight. - Centrifugar 30 min na centrífuga de placa. - Descartar cuidadosamente o sobrenadante com pipeta - Acrescentar 150ul de etanol 70%. - Centrifugar 15 min. - Descartar sobrenadante com pipeta, deixar secar e ressuspender em 8ul com H 2 O miliq. Purificação de plasmídeo com Fenol/Clorofórmio - Colocar 1 volume de fenol. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadante para tubo novo. - Colocar ½ volume de fenol mais ½ de clorofórmio. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadantepara tubo novo. - Colocar 1 volume de clorofórmio. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Retirar sobrenadante para tubo novo. - Acrescentar 10% de NaCl 5M ou AcK 5M. - Acrescentar 2 volumes de etanol 100% gelado. - Overnight no freezer. - Centrifugar (5 min.). - Descartar o etanol virando o eppendorf. - Secar os plasmídeos, no máximo (40 o C) - Ressuspender em TE ou H 2 O miliq. - 10ul de DNA - 6ul de H 2 O - 2ul de Tampão React-3-2ul de Eco R-1 - Deixar overnight a 37 0 C Clivagem de DNA genômico com Eco R-1 Clivagem do Plasmídeo para fazer vetor

6 - 5ul de Plasmídeo. - 2ul de tampão (buffer D ) da Eco R ul Eco R ul H 2 O miliq. - Deixar overnight à 37 o C. - Deixar (10 min.) no banho a 60 0 C para inativar a enzima. - 20ul de Plasmídeo clivado. - 5ul de Buffer. - 0,2ul do T. - 3ul de MgCl ul de Taq Polimerase. - 39,8ul de H 2 O miliq. - Deixar (3 h) à 60 o C. - 1ul de ligase T4. - 1ul de vetor. - 2ul de produto de PCR. - 1ul de tampão de ligação (buffer). - 5ul de H 2 O miliq. - Deixar na geladeira overnight. Acrescentar T no plasmídeo Reação de ligação para clonagem Transformação de bactérias Todos os procedimentos devem ser realizados na mesa de fluxo - Inocular 3ml de pré-cultura (XL1-Blue) em 30ml de meio, crescer a 37 o C em agitação (1 à 2 h). - Centrifugar (5 min.) toda a cultura, descartar o sobrenadante. - Ressuspender as bactérias em 5ml de MgCl 2 0,1M. Vortex. - Centrifugar (5 min.), descartar sobrenadante. - Ressuspender em 5ml de CaCl 2 0,1M. Vortex. Deixar (30 min.) em banho com gelo à 0 o C. - Centrifugar (5 min.) e deixar um pouco de sobrenadante. Ressuspender no Vortex.

7 - Colocar 100ul em tubo estéril com toda a ligação (se for clonagem) ou 1ul do plasmídeo a ser transformado. - Choque térmico: (20 min. à 0 o C), (2 min. à 42 o C), (5 min. 0 o C). - Colocar 600ul de meio líquido novo (autoclavado) no eppendorf. - Incubar à 37 o C com agitação por (1 h). - Prepararas placas com 75ul de ampicilina e se for clonagem acrescentar também 30ul de X-Gal e 15 ul de IPTG. - Colocar 200ul da cultura do eppendorf na placa, espalhando bem. Incubar a 37 o C. Se for clonagem pode-se fazer duas placas para cada ligação plaqueando todo o volume de bactérias. Extração de ácidos nucléicos de pequena amostra com Fenol Digestão com proteína K - Mix de digestão: - 300ul de TNE 1X - 30ul de Tris-HCl ph 8 (1M) - 8ul de SDS 25% - 20ul de Proteinase K (20mg/ml) colocar depois em cada tubo. TNE 20X (500ml) - Tris 6,05g - NaCl 5,84g - EDTA 1,86g TE (ph 7,5) - 10 mm Tris, ph 7,5-0,1 mm EDTA Proteinase K - 20mg/ml em água miliq - Incuba-se o material agitando de vez em quando, à 37 o C por pernoite ou 55 o C por 3-4 horas; - Extração orgânica: - adicionar um volume de Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico 25:24:1 (360ul) (pegar a fase de baixo); - vortexar; - Centrifugar à velocidade máxima por 10 min.;

8 - Retirar sobrenadante com ponteira cortada, passar para outro tubo e nesse tubo adicionar no máximo 2 volumes de etanol absoluto, misturar suavemente (720ul); - Centrifugar a velocidade máxima por 30 min. e descartar o sobrenadante; - Adicionar 500ul de etanol 70%; - Centrifugar a velocidade máxima por 10 min. e descartar o sobrenadante; - Secar; - Ressuspender em TE ph 7,5. Extração de ácidos nucléicos-fenol/clorofórmio² Tampão de lise para extração de ác. Nucléicos: - 0,5ml de TRIS 1M - 1ml de EDTA 0,5M - 60ul de NaCl 5M - 3,44ml de H 2 O destilada - Colocar em um eppndorf de 1,5ml, Drosophila até a marca de 0,5ml. - Acrescentar 400ul de tampão de extração p/ ác. Nucléicos. - Homogeneizar bem. Lavar homogeneizador com H 2 O 2 e depois com H 2 O destilada. - Acrescentar mais 200ul de tampão de lise. - Adicionar 60ul de SDS 10%. Misturar o SDS com a lise e colocar no banho maria por (45 min.), a uma temperatura entre 50 o C e 60 o C. - Colocar 300ul de fenol). Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). - Passar sobrenadante para novo eppendorf, desprezar o pellet. - Colocar 150ul de fenol, 150ul de clorofórmio. Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). Passar sobrenadante para novo eppendorf, desprezar o pellet. - Adicionar 300ul de clorofórmio. Agitar (10 min.), cuidadosamente. - Centrifugar (10 min.). Passar sobrenadante para novo eppendorf. - Colocar 2 volumes de etanol absoluto gelado, misturar suavemente, esperar (10 min.) ou overnight. - Centrifugar (1 min.), descartar o álcool, secar bem na estufa, no máximo (30 min.). - Colocar 100ul de TE. Extração de ác. Nucléicos com Coalho¹

9 - Utilizar 20 moscas (tamanho de D. simulans), homogeneizar em 200ul de tampão de lise (o mesmo tampão utilizado na extração por Fenol/Clorofórmio). - Acrescentar mais 200ul de tampão de lise e 40ul de SDS 10%. - Deixar (45 min.) à 60 o C. Fazer 2ml de qualho: 0,5g de pó de Coalho/ 2ml de H 2 O destilada. - Acrescentar 50ul de coalho, misturar. - Deixar (1 h) a 37 o C, as vezes mexer. - Acrescentar 50ul de KAc 3,0 M. - Deixar (15 min.) no freezer. - Acrescentar 400ul de clorofórmio, misturar (10 min.). - Centrifugar (5 min.). - Passar sobrenadante para novo eppendorf. - Acrescentar 1 volume de isopropanol ou 2 volumes de estanol, misturar, aparecerá fiapos. - Centrifugar (2 min.). - Retirar sobrenadante. - Ressuspender em 30ul de TE, deixar overnight na geladeira. - Colocar 1ul de RNAse e deixar a 37 o C por (1 h). Solução de lise: - 100ul de TRIS (100mM ph=8) - 200ul de EDTA (100mM ph=8) - 12ul de NaCl (60mM) - 688ul H 2 O destilada Extração de ác. Nucléicos com coalho/vidro¹ - Homogeneizar 20 a 30 (tamanho de D. simulans) moscas em 400ul de tampão de lise. - Colocar 50ul de SDS 10%. - Deixar (1 h) em banho-maria à 60 o C. - Adicionar 50ul de coalho (0,5g de pó de coalho/2ml de H 2 O) e manter no banho a 37ºC por 1h. - Adicionar 30ul de Acetato de Potássio 3M. Misturar levemente e colocar 15 minutos no freezer. - Adicionar 300ul de clorofórmio e misturar por 10 min. Centrifugar por 10 min. e remover o sobrenadante para um novo tubo. - Colocar 600ul de NaI 6M + 80ul de vidro. Misturar por 2 min. - Centrifugar por 1 min. e descartar o sobrenadante. - Passar 1 vez em etanol 70%. - Centrifugar (2 min.).

10 - Secar 50ºC (20-35 min.). - Ressuspender totalemente o vidro em H 2 O miliq, após deixar 15 min. a 60ºC. - Centrifugar 1 min. e colocar sobrenadante em outro eppendorf. Extração de ác. Nucleicos com Acetato de Amônio - Macerar as moscas em 600ul de tampão de lise, mais 60ul de SDS 10%. Deixar (1 h) no banho-maria entre (50 e 60 o C) - Acrescentar 100ul de coalho. Deixar a 37 o C por (1 h). - Deixar no banho-maria a 55 o C por mais (30 min.). - Colocar as amostras no freezer por mais (5 min.). - Acrescentar 400ul de Acetato de Amônio. - Agitar cuidadosamente (10 min.). - Centrifugar (10 min.). - Colocar o sobrenadante em eppendorf de 2ml. - Acrescentar 1 volume de isopropanol ou antes passar 1 volume de Clorofórmio, agitar, centrifugar e passar para novo eppendorf. - Centrifugar (2 min.). Desprezar o pellet. - Adicionar etanol 70%, misturar e deixar na geladeira por (15 min.). Centrifugar. - Repetir esse procedimento 5 vezes. - Secar o DNA, ressuspender e passar RNAse. Extração de RNA com Trizol - Homogeneizar moscas em 1ml de Trizol (50-100mg tecido). - Deixar (5 min.) a T.A. - Colocar 200ul de clorofórmio. - Misturar virando o tubo (15 s). - Deixar (3 min.) a T.A. - Centrifugar (15 min.). - Retirar sobrenadante para novo eppendorf. - Colocar 500ul de isopropanol. - Deixar (10 min.) a T.A. - Centrifugar (10 min.). - Descartar sobrenadante. - Lavar o pelet de RNA com etanol 75%, colocando 1ml de etanol 75%. Vortex. - Centrifugar (5 min.). - Deixar secar (5 a 10 min.). - Ressuspender em H 2 O DEPC. - Inocular (10 min. a 55 o C-60 o C.

11 Isolamento de RNA mitocondrial - Congelar cerca de moscas a 20 o C, durante 20 min.; - Homogeneizar delicadamente em eppendorf, em 300ul de TES (no gelo); - Acrescentar mais 700ul de TES, misturar suavemente; - Centrifugar a 2500 rpm por 10 min.; - Transferir o sobrenadante para outro tubo e repetir a centrifugação (por mais 2-3 vezes, até ficar sem material particulado). - Centrifugar a 9000 rpm por 25 min.; - Jogar o sobrenadante fora; - Ressuspender o precipitado em 350ul de TES; - Adicionar 50ul de SDS e misturar delicadamente; - Incubar 15 min. a 65 o C; - Adicionar 100ul de AcK 5M ph=5,0, e misturar delicadamente; - Incubar a -20 C por 15 min.; - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm; - Transferir o sobrenadante para um novo eppendorf; - Extrair com 1 volume de fenol:clorofórmio (250ul:250ul); - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm, tirar a fase aquosa; - Tratar com 1 volume de clorofórmio (500ul); - Centrifugar 5 min. a 9000 rpm, tirar fase aquosa (de cima); - Precipitar com 2 volumes de etanol 100%, deixar o precipitado pelo menos 30 min. a -20 C; - Centrifugar min. a rpm, lavar o precipitado com etanol 70%, secar na estufa 50 C; - Dissolver em 20-30ul de TE. Deverá haver material suficiente para uma digestão, que após a corrida do gel 0,8% deve permitir a visualização das bandas diretam,ente, após coloração com Brometo de Etídio; - Colocar 1ul de RNase, deixar em banho-maria 37 C por min.; - Migrar em gel de eletroforese, visualizar. Solução de TRIS 1M PM: 121,11 Ph=8 - Para 200ml Massa Molecular M - 24,22g de TRIS X quantos molar quer - Completar com 150ml de H 2 O destilada X ml - Acertar Ph=8 (com HCl) X quantos ml quer

12 - Completar para 200ml - Autoclavar Ph=8 Solução de EDTA 0,5 M PM: 372,24 - Para 200ml - 37,24g de EDTA - Colocar 100ml de H 2 O destilada - Acertar Ph=8 (com NaOH) - Autoclavar Proteinase K - 200mg de proteinase K; - Completar com H 2 O MQ autoclavada; Obs: estocar a -20 C. Utilizar 50ug/ml na extração de DNA genômico, incubando a C +/- 1h. Solução de KCl 3M PM = 74,55 g) - 22,36 g de KCl - Completar para 100ml de H 2 O MQ autoclavada. - Autoclavar. - Para 50ml - 20g de NaOH - Completar para 50ml com H 2 O Solução de NaOH 10M PM:40 Solução de Glicose 1M (PM = 180 g) - 18g de glicose; - Completar para 100ml com H 2 O MQ autoclavada; - Filtrar através de um filtro de 0,22 microns. Solução de HCl 10% - Para 50ml - 13,5ml de HCl(37%)

13 - Completar com H 2 O - 48ml de clorofórmio; - 2ml de álcool isoamilico; Clorofórmio : Álcool Isoamil (24:1) Obs: o clorofórmio desnatura proteínas e facilita a separação aquosa/orgânica. O álcool reduz a formação de espuma durante a extração. Álcool com Nipagim - Dissolver 1g de nipagim em 10ml de álcool. - Colocar no vidro do nipagin. - Completar de água. Solução de ampicilina 20mg/ml - 200mg de ampicilina - completar até 10ml com H 2 O destilada - *Filtrar em ambiente estéril Para usar: C 1. V 1 = C 2. V V = 70. volume do meio Solução de NaCl 5M PM:58,44 - Para 200ml - 58,44g de NaCl - Comletar para 200ml com H 2 O destilada Autolavar Solução de Wash Buffer - 400ul de NaCl; - 200ul Tris; - 100ul de EDTA; - Completar até 5ml com H 2 O destilada e até 10 ml com etanol absoluto. - 1ml de TRIS (10mM) Solução de TE

14 - 100ul de EDTA 0,5M (0,5mM) - Completar para 100ml de H 2 O destilada - Autoclavar - 4,84g de TRIS - 2ml de EDTA 0,5M - 1,15ml de Ácido Acético Glacial - Completar para 1 L com H 2 O TAE 1X TEB 20X ph = 8,00 (para 1l) - 1,77 M de Tris-base - 216g de Tris-base - 0,025 M de EDTA - 9,3g de EDTA 50ml de EDTA 0,5M ph = 8,00-111,2g de ácido bórico - Completar volume apropriado com H 2 O MQ autoclavada; - Aproximar ph = 8,00 Obs: TEB é recomendado para separação de DNA de baixo peso molecular. Brometo de Etídio - 1g de Brometo de Etídio - Completar para 100ml com H 2 O desticlavada; - Agitar até certificar-se que o corante está dissolvido, armazenar a 4 C. - 0,4g de agarose - 20ul de brometo de etídio (luvas) - 50ml de TAE 1X Gel de Agarose 0,8% Solução de Acetato de Potássio 3M PM: 98,14 - Para 100ml - 29,44g de Acetato de Potássio em 60ml de H 2 O

15 - 11,5ml de Ácido Acético Glacial - Completar para 100ml com H 2 O destilada - 7,85g para 10ml de solução - 8,7g para 15ml de solução Acetato de Potássio 8M Acetato de Amônio 7,5M PM: 77,08 Solução de X-Gal (20mg/ml) - 40mg de X-Gal - 2ml de formamida Obs: Agitar a solução de X-Gal em vortex, filtrando-a, posteriormente, em ambiente estéril. Cobrir o tubo com alumínio para prevenir danificação por luz. Armazenar a -20 C. IPTG (isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside) 200 mg/ml (pm = 238,3 g) - 0,4g de IPTG - 2ml de H 2 O MQ autoclavada; - Esterelizar por filtração através de filtro de 0,22 microns. Dispensar em al - Para 100ml - 2g de MgCl 2 - Autoclavar Solução de MgCl 2 0,1M PM: 203,3 - Para 100ml - 1,47g de CaCl 2 - Autoclavar - 1,3g de PEG *filtrar Solução de CaCl 2 0,1M PM: 147,01 Solução de PEG 13%, NaCl 1,6M

16 - 0,94g de NaCl - Completar para 10ml de H 2 O destilada Solução de PEG 20% - 20 g de PEG (polyethylene Glycol 8000); - 14,6 de NaCl; - 100ml de H 2 O (vol. final). Solução de NaI 6M - Para 5ml - 4,5g de NaI *colocar 10ul de TRIS 1M Ph=8 - completar com H 2 O miliq Tampão fosfato 10X (para RNA) - Fazer 500ml de 100mM de Fosfato de Sódio dibásico e 500ml de Fosfato de Sódio monobásico. - Dissolver 7,1g de Fosfato de Sódio dibásico em 500ml de H 2 O. - Dissolver 6,9g de Fosfato de Sódio monobásico em 500ml de H 2 O. - Usando um medidor de Ph calibrado dissolva a solução de Fosfato de Sódio monobásio no solução de Fosfato de Sódio dibásico até que o Ph=7. Autoclavar e armazenar a T.A. Southern Blot - Clivar o DNA (= 7ug). - Correr o Dna em gel de agarose 0,8% (novo, com TAE 1X novo), overnight, a aproximadamente 10v ( de 9v a 15v). - Despurinizar o gel em HCl 0,2N por (20 min.) sem agitação. HCl 0,2N: 3,8ml de HCl completar para 200ml de H 2 O. - Lavar com H 2 O destilada após desprezar o HCl - Colocar solução desnaturante, (45 min.) com agitação. Para 500ml: 10g de NaOH (0,5M) 43,83 g de NaCl (1,5M) - Descartar solução e lavar com H 2 O. - Colocar solução neutralizante, (30 min.) com agitação Para 500ml: 38,28g de TRIS 87,66g de NaCl

17 * Acertar ph=7 - Montar suporte de transferência: - Solução de SSC 20X: 175,32g de NaCl 88,2g de Citrato de Sódio Colocar 800ml de H 2 O. * Ajustar ph=7 - Completar para 1 litro com H 2 O. *Autoclavar - Deixar transferindo overnight. - Marcar os slots - Retirar membrana do gel com pinça, colocar sobre um papel filtro e secar na estufa a 80 o C por (2 h). - Fazer solução pré-hibridização. 5ml de SSC 20X 1ml de Dextran Sulfato 25% 1ml de Blocking Agent 200ul de SDS 10% completar para 20ml com H 2 O - Aquecer a solução a 60 o C Hibridização

18 - Colocar a membrana em um saco plástico com 10ml a 20ml da solução de préhibridização. - Selar o saco plástico e deixar em agitação a 60 o C por no mínimo (1 h). Preparação da Sonda - Método Random Prime: - Diluir o DNA (sonda) para uma concentração de 25ng/ul em um volume no mínimo 20ul. - Desnaturar esse DNA fervendo (5 min.) e depois colocando no freezer por mais (5 min.) - Para a reação de marcação usa-se: 30ul de H 2 O 10ul de NTPs 5ul de primer 4ul do DNA denaturado 1ul de enzima * Pode-se fazer meia reação - Deixar no banho a 37 o O por (1 h). - Desnaturar a sonda já marcada. - Fazer um pequeno furo no saco da membrana, acrescentar a sonda à solução de pré-hibridização. Selar o saco novamente, retirando bolhas. - Deixar hibridizando overnight. Lavagem da Membrana - Retirar a membrana do plástico, colocando-a em um pote. - Aquecer a 60 o C uam solução de: 5ml de SSC 20X 1ml de SDS 10% completar com 100ml de H 2 O - Colocar a solução com a membrana a 60 o C, com agitação, por (15 min.). Após retirar solução. - Repetir o procedimento com uma solução aquecida de: 2,5ml de SSC 1ml de SDS 10% completar para 100ml de H 2 O - Deixar (15 min.) à 60 o C, com agitação. - Retirar solução. - Deixar por (1 h) a membrana com a solução: 10ml de Blocking Agent 90ml de Buffer A

19 - Deixar (1 h) a temperatura ambiente, com agitação. - Solução de Buffer A : para 500ml 6,05g de TRIS 8,76g de NaCl *Acertar ph=9,5, autoclavar. - Retirar essa solução e colocar outra solução: 150mg de albumina bovina 6ul de antifluresceina AP 30ml de Buffer A - Deixar (1 h) com esta solução agitando a temperatura ambiente. - Ocupar o que sobrou do Buffer A para fazer uma solução com Tween 20 para ficar 0,3%. para 300ml de Buffer A - 0,9ml de Tween Dar três banhos com esta solução, agitando (10 min.) a temperatura ambiente. - Desprezar a solução. - Secar a membrana com uma folha de papel filtro. - Na sala escura, com pouca luz, espalhar bem 1ml do reagente detecton e esperar (3 min.). - Secar o excesso de reagente em papel filtro. - Colocar num saco plástico a membrana e selar. - Colocar a membrana no hipercassete e fixar com fita adesiva. *Não esquecer de cortar ponta. - No escuro colocar o filme e fixar. - Tempo de exposição variado. - Para revelar: revelador-h 2 O-fixador - Deixar no revelador até aparecer as bandas. - Passar rapidamente na H 2 O. - Colocar no fixador por (5 a 10 min.). - Lavar bem o filme com H 2 O. Gel de Poliacrilamida -Lavar bem as placas de vidro e passar silicone líquido para dificultar a aderência do gel nas placas. -Após ajustar as placas com os bastões e selar as laterais com silicone. -Colocar o gel de poliacrilamida na placa e esperar a acrilamida polimerizar. -Após colocar a quantidade de DNA e corante e colocar o marcador de peso molecular nas extremidades. -Colocar a correr com uma voltagem de 40v. -Após correr o tempo necessário fazer os seguintes procedimentos.

20 Revelação³ - Solução de Etanol 10% + Ac. Acético 0,5% (200ml). - Aquecer até em torno de 60ºC; - Colocar no gel, durante 1 min; - Lavar 2x com água destilada; - Solução de AgNO3 0,2%; - Aquecer até em torno de 60ºC; - Deixar imerso 10 minutos; - Lavar 2x com água destilada; - Solução de revelação, NaOH 3% + 3ml/L de formaldeido 37%; - Aquecer até em torno de 60ºC; - Deixar revelando até a coloração desejada; - Lavar 2x com água destilada; - Solução de fixação, Ac. Acético 6%. Acrilamida 30% -15g de Acrilamida. -0,4g de Bis-acrilamida. -Água destilada até completar 50 ml. Reagentes Gel de Poliacrilamida -7ml de Acrilamida 30%. -30ul de TEMED -1 pitada de persulfato de amônio. -3ml de TAE 10x. -completar com H 2 O destilada para 30ml. Nitrato de Prata -Nitrato de Prata 0,2% - 0,4g de Nitrato em 200ml de água. Protocolo para corar genitália - KOH 10% deixar overnight ou 4h a 60ºC; - Lavar com água destilada;

21 - Deixar overnight com corante a 37ºC; (Fuxina Ácida 5mg, 300ml de H 2 O, Ácido Clorídrico 10% 10ml); - Passar no álcool 70% para tirar o excesso de corante; - Dissecar em glicerina. - Guardar moscas em etanol 70%. Teste de ligação do DNA ao vidro - Colocar em um eppendorf 5ul de DNA de alto peso molecular (DNA genômico) e de baixo peso molecular (Marcador caseiro); - Acrescentar em cada tubo 95ul de H 2 O; - Acrescentar 200ul de NaI + 40 ul de vidro a ser testado. Mexer durante 1 min; - Deixar 10 min. na geladeira; - Centrifigar 1 min. e descartar o sobrenadante; - Deixar secar o pelet 1:30 min. a temperaturas < 40 o C; - Ressuspender em 10 ul; - Aplicar os 10ul das amostras purificadas mais 5ul das originais não purificadas no gel de agarose 0,8%. Referências: ¹ Oliveira, L.F.V., Wallau, G.L., Loreto, E.L.S Isolation a high quality DNA: a protocol combining "rennet" and glass milk. Electronic Journal of Biotechnology. 12(2): 1-6. ² Sassi, A.K., Herédia, F., Loreto, E.L.S., Valente, V.L.S Transposable element P and gypsy in natural populations of Drosophila willistoni. Genetics and Molecular Biology. 28: ³ Sanguinetti, C.J., Dias Neto, E., Simpson, A.J.G Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17:

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