LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA MOLECULAR. Protocolos de Técnicas de Biologia Molecular

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1 LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA MOLECULAR Protocolos de Técnicas de Biologia Molecular Brasília, Fevereiro de 2011

2 Este trabalho foi elaborado para que fosse possível um melhor acompanhamento nas técnicas de Farmacologia Molecular aplicadas a esse Laboratório. Para que fosse possível sua realização, contei com a colaboração de muitos colegas, alguns, verdadeiros amigos que passaram pelo. Assim como Karime Bicas, Alessandra Menezes, Gustavo Barra, Angélica Amato, Rutnéia Pessanha, Raniere e Cristina. Agradeço também aos professores que fazem parte do Farmol. A sua versão atual está sendo revisada pela Profa. Dra. Marie Togashi e está sujeita à alterações. A todos que ajudaram os meus agradecimentos, pois a elaboração desse trabalho foi muito gratificante e com certeza contribuirá a todos que ainda irão passar pelo Farmol. ii

3 Dedico este trabalho aos meus filhos Murilo e Isabella. Espero muito em Deus que eles cresçam e se tornem adultos maduros e responsáveis, que tenham iniciativas, sejam idôneos e tenham sempre Deus em primeiro lugar. Creio que estas são as virtudes do alicerce da vida. iii

4 ORAÇÃO DO BIÓLOGO Credo Molecular Creio no DNA todo poderoso Codificador de todos os seres vivos E no RNA, seu único filho que foi concebido pelo poder da RNA polimerase Nasceu como transcrito primário padeceu sob RNAses Foi processado, modificado e transportado Desceu ao citoplasma Foi traduzido em proteína Subiu pelo Retículo Endoplasmático ao complexo de Golgi E está ancorado à direita de uma proteína G na membrana plasmática De onde há de vir a controlar a transdução de sinais em células normais e apoptóticas Creio na Biologia Molecular Na terapia gênica e na biotecnologia no sequenciamento do genoma humano na correção de mutações na clonagem da Dolly na vida eterna. Amém iv

5 Índice Preparo de Células Competentes 4 Introdução Teste de Controle de Qualidade das Células Competentes 5 Teste de Esterilidade das Células Competentes 6 Teste de Eficiência das Células Competentes 6 Preparo de Células Competentes - CaCl 7 Preparo de Células Competentes TB 8 Tampão TB 1x Preparo de Células Competentes MgCl2 / CaCl2 9 Preparo de Células Competentes Cloreto de Rubídeo - RbCl 10 Soluções Preparo de Células Eletrocompetentes 11 Preparo de Células de Baixa Competência 12 Preparo do Tampão TSS1x. Transformação de DNA plasmidial em Células Competentes 13 Introdução Transformação de DNA plasmidial em Células Competentes 14 Procedimento Estoque em Glicerol 30% Teste para simples verificação do plasmídeo 15 STE ph 8.0 Extração e Purificação de DNA plasmidial 16 Introdução Extração e Purificação - kit Miniprep da Promega. 18 Extração e Purificação - Miniprep modificado por Marie/Joaquim 19 Extração e Purificação - kit Midiprep da Promega. 20 Extração e Purificação - Maxprep com PEG 30% 21 Purificação de DNA com Fenol Clorofórmio 23 Soluções PEG 30% 24 Extração e Purificação - kit Maxprep da QIAGEN 26 Soluções Maxpreps da QIAGEN 28 Extração e Purificação - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz 30 Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani) 31 Meio de cultura 2x YT Medium Meio de cultura SOB Medium 32 Meio de cultura SOC Medium Meio de cultura NZY Top Agarose 33 v

6 M9 Minimal Medium Preparo do 10x M9 Salt 34 Eletroforese de DNA em gel de agarose 35 Quantificação do DNA 36 Manuseio do espectrofotômetro. Diluição do DNA - 1/100 ou 1/50 Cálculo da leitura do DNA dupla fita Fórmula Preparo do Gel de agarose 1% (100mL) 37 Aplicando o gel de Agarose 38 Preparo das amostras de DNA reciclagem de gel de Agarose 39 Preparo de reagentes e soluções 40 Manipulação da Sala de Cultura 41 Introdução Origem das Células Hela 43 Origem das células U Reação da Transfecção 47 Experimento programad Check list Transfecção / UV por 30 minutos 48 Transfecção de Células Aderentes Hela 49 Contagem das Células na Câmara de Newbauer 51 Leitura de Transfecção de Células Aderentes 52 Descongelamento 53 Cultivo e Replicação de Células Aderentes Congelamento de Células Aderentes 54 Transfecção em Células em suspensão U Leitura da Transfecção de Células em suspensão - U Cultivo das Células em Suspensão 58 Congelamento de Células em Suspensão 59 Antibiótico / Soluções para cultura de Células 60 Solução de Congelamento I e II Tampão de Lise _ modificado PBS (1000 ml) Tampão de Fosfato e Salina) 61 PBS com cálcio e glicose Tripsina 62 Meio de Cultura DMEM 63 Meio de Cultura RPMI 64 vi

7 Preparo de Células Competentes Introdução As linhagens de E.coli mais comumente empregadas para construção e propagação de plasmídeos em biologia molecular são DH5α e XL1 Blue. O protocolo que permite a preparação de bactérias aptas para serem transformadas com DNA plasmidial é chamado competência. Basicamente as bactérias podem ser tornadas competentes por tratamentos químicos (quimiocompetência) ou por descargas elétricas (eletrocompetência). Ambos têm em comum a necessidade de obtenção de culturas bacterianas em crescimento exponencial e, a partir desse ponto, os protocolos diferem de acordo com o método de competência. O mecanismo de captação da molécula do DNA pela bactéria competente tem como a hipótese de que as moléculas do DNA passam através de canais situados nas chamadas zonas de adesão, que são locais onde as membranas interna e externa da célula bacteriana unem-se formando poros. Estes poros só estão presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condições naturais, a captação do DNA torna-se difícil devido à repulsão eletrostática existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipídeos da membrana bacteriana e dos grupos fosfato da molécula do DNA. Um dos métodos mais usados para transformação bacteriana é o método que utiliza cloreto de cálcio. Neste método as células bacterianas são previamente tratadas com solução de cloreto de cálcio para tornarem-se competentes, ou seja, mais aptas a receberem DNA exógeno. Todo o tratamento é feito sob banho de gelo. O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0oC a fluidez da membrana celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca +2 formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico da transformação complementa este processo de captação, provavelmente criando um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA através da zona de adesão. É possível aumentar a eficiência do processo por recurso a outros íons monovalentes (K+ ou Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou Mn 2+). 4

8 Teste de Controle de Qualidade das Células Competentes Concentrações dos antibióticos somente para controle de qualidade das células competentes estoque 100ug/mL Ampicilina - 100mg/mL 50ug/mL Kanamicina - 50mg/mL 15ug/mL Tetraciclina - 15mg/mL 20ug/mL Clorafenicol - 20mg/mL 100ug/mL Streptomicina - 100mg/mL 1º dia - estriar Plaquei as células a serem testadas em meio de cultura sem antibiótico e Ou no antibiótico no qual ela é resistente. 2º dia - isolar Escolha de algumas colônias para teste. (pode-se escolher umas 4 colônias) Diluir 1 colônia em 1000uL de H2O estéril e plaquei 10uL em meio sem antibiótico e Ou no antibiótico no qual ela é resistente. 3 º dia selecionar Estriar 1 colônia da placa isolada (fazer a mesma diluição do passo anterior) em placas com antibióticos, testando os vários antibióticos, concentrações acima. Marque na placa a colônia testada. 4º dia - verificar se houve crescimento A colônia que não tiver crescido em nenhum dos antibióticos, é a colônia certa para proceder com a o preparo de células competentes, ela esta livre de contaminações. No caso de células resistentes a algum antibiótico, proceda com uma colônia crescida no antibiótico no qual ela é resistente. 5

9 Teste de Esterilidade das Células Competentes Controle negativo Estrie as células preparadas em meio de cultura LB com todos os antibióticos, se possível veja tabela de antibióticos de Controle de Qualidade. Não deve crescer em nenhum dos antibióticos, exceto se a célula for resistente a algum antibiótico. Libere a célula para uso só após fazer este teste. Teste de Eficiência das Células Competentes 1. Em um tubo no gelo coloque 50uL das células preparadas 2. Adicione 10 ng de DNA plasmidial (conhecido) 3. Incube 30 minutos no gelo 4. Dê um choque térmico de 42ºC por 45 segundos a 1 minuto e meio 5. Retorne para o gelo por 2 minutos 6. Adicione 950uL de meio de cultura ambiente estéril 7. Incube 37ºC por 1 hora 8. Plaquei 100uL (1ng) em placa com antibiótico de interesse. 9. Incube 37ºC overnight 10. No dia seguinte faça a contagem de colônias 11. Deve-se contar 1000 colônias para que a células estejam com uma boa eficiência 6

10 Preparo de Células Competentes - CaCl2 1. Plaquei as células de interesse XL1 Blue ou DH5 ou outra (estoque 80ºC) em meio LB agar ou meio mínimo. (com antibiótico de resistência ou s/ antibiótico) 2. Incube 37ºC por 16 horas ou overnight, no meio mínimo incube mais tempo. 3. Inocule uma colônia em 3 ou 5 ml de meio LB sem antibiótico 4. Incube a 37ºC 16 horas ou overnight 5. Transfira 3 ml da cultura overnight para 100 ml de LB sem antibiótico 6. Incube a 30ºC 250 rpm até OD - 0.4/0.5, 600nm 7. Transfira para tubos de 50 ml estéries 8. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4ºC e descarte o sobrenadante 9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 ml de CaCl 2 gelado (50mM) 10. Incube no gelo por 15 minutos 11. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante 12. Ressuspenda o pellet gentilmente em 2,85 ml de CaCl2 gelado (50mM) 13. Adicione 150 L de glicerol puro estéril 14. Faça aliquotas de 100 e 300 L 15. Freeze em nitrogênio líquido (opcional) 16. Armazene imediatamente a 80ºC Se for usar as células a fresco ressuspenda apenas em 3 ml de CaCl2 gelado (50mM) e use em seguida. OBS.: use soluções estéreis e geladas. 7

11 Preparo de Células Competentes TB 1. Plaquei as células de interesse (estoque 80ºC) em meio LB agar ou meio mínimo. (com antibiótico de resistência ou s/ antibiótico) 2. Incube 37ºC por 16 horas ou overnight, no meio mínimo incube mais tempo. 3. Inocule uma colônia em 3 ou 5 ml de meio LB sem antibiótico 4. Incube a 37ºC 16 horas ou overnight 5. Transfira 3 ml da cultura overnight para 100 ml de LB sem antibiótico 6. Incube a 30ºC 250 rpm até OD - 0.4/0.5, 600nm. Incube no gelo por 10 minutos 7. Transfira para tubos de 50 ml estéries 8. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4ºC e descarte o sobrenadante 9. Ressuspenda o pellet gentilmente em 32 ml de TB gelado 10. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante 11. Ressuspenda o pellet gentilmente em 8 ml de TB gelado 12. Adicione DMSO para concentração final de 7% (560 L). Incube no gelo por 10 minutos 13. Faça aliquotas de 100 e 300 L 14. Freeze em nitrogênio líquido (importante) 15. Armazene imediatamente a 80ºC Tampão TB 1x. p/ 250mL HEPES (10mM final) mg CaCL2 (15mM final) mg KCl (250mM final) g Ajuste ph 6.7 MnCl2 (55mM final)...2.8g Esterelize filtrando 0,22um Estoque a 4ºC 8

12 Preparo de Células Competentes MgCl2 / CaCl2 1. Plaquei as células de interesse (estoque 80ºC) em meio LB agar ou meio mínimo. (com antibiótico de resistência ou s/ antibiótico) 2. E.Coli TOP 10 Resistente a Streptomicina 3. Incube 37ºC por 16 horas ou overnight, no meio mínimo incube mais tempo. 4. Inocule uma colônia em 5 ml de meio LB - Streptomicina [ ] final 60μg/mL 5. Incube a 37ºC 16 horas ou overnight 6. Transfira 2 ml da cultura para 300 ml de LB - Streptomicina [ ] final 60μg/mL 7. Incube a 30ºC 250 rpm até OD - 0.4/0.5, 550nm 8. Transfira para tubos de 50 ml estéries 9. Centrifugue 2500 rpm 15 minutos a 4ºC e descarte o sobrenadante 10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 15 ml de MgCl2 gelado (100mM) 11. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante 12. Ressuspenda o pellet gentilmente em 20 ml de CaCl2 gelado (100mM) 13. Incube no gelo por 20 minutos 14. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante 15. Ressuspenda o pellet gentilmente em 6 ml de CaCl2 gelado (100mM) 16. Adicione 15% de Glicerol 900 L de glicerol puro estéril (novo) 17. Faça alíquotas de 100 e 300 L 18. Freezer em nitrogênio líquido por 1 minuto 19. Armazene imediatamente a 80ºC 9

13 Preparo de Células Competentes Cloreto de Rubídeo RbCl 1. Transfira 400 L da cultura ON /37ºC para 200mL de LB ou SOB 2. Incube a 30ºC 200rpm até OD nm 3. Centrifugue a 4000 rpm por 5 minutos de possível a 4ºC. Despreze sobrenadante 4. Ressuspenda o pellet em 30mL RF1 gelado 5. Incube no gelo por 15 minutos. 6. Centrifugue novamente e descarte sobrenadante 7. Ressuspenda o pellet em 8mL RF2 gelado 8. Incube no gelo por 15 minutos 9. Faça alíquotas de 100 e 300 L 10. Freeze no nitrogêneo líquido (opcional) 11. Armazene a 80ºC. Soluções: Acetato de Potássio - C 2 H 3 O 2 K 1M 9,8g para 100mL H 2 O. Ajuste ph 7.5 com ácido acético MOPS 0.5M 2,1g para 20mL H 2 O. Ajuste ph 6.8 RF1 RF2 g/100ml RbCl 10mM 1,2g MnCl 2 2H 2 O 50 mm 1g C 2 H 3 O 2 K 30mM 3mL 1M ph 7.5 ( acetato de potássio) CaCl 2 2H 2 O..10mM 1,5g Glicerol 15% 15mL Ajuste ph 5.8 com ácido acético 0,2 N Esterilize por filtração 0,22 m Armazene a 4ºC g/100ml MOPS 10mM 2mL 1M RbCl 10 mm 0.12g CaCl 2 2H 2 O..75mM 1,1g Glicerol 15% 15mL Ajuste ph 6.8 com NaOH Esterilize por filtração 0,22 m Armazene a 4ºC 10

14 Preparo de Células Células Eletrocompetentes 1. Plaquei as células de interesse BL21 DE3 (cloranfenicol) ou outra (estoque 80ºC) em meio LB agar ou meio mínimo. (com ou s/ antibiótico) 2. Incube 37ºC por 16 horas ou overnight, no meio mínimo incube mais tempo. 3. Inocule uma colônia em 3 ou 5 ml de meio LB sem antibiótico 4. Incube a 37ºC 16 horas ou overnight 5. Transfira 2 ml da cultura overnight para 200 ml de LB sem antibiótico 6. Incube a 30ºC 250 rpm até OD a 0.7, 600nm 7. Incube no gelo por 15 minutos 8. Transfira para tubos de 50mL estéries 9. Centrifugue 3000 rpm 10 minutos a 4ºC e descarte o sobrenadante completamente. 10. Ressuspenda o pellet gentilmente em 200mL 10% de glicerol gelado 11. Incube no gelo por 15 minutos 12. Centrifugue novamente e descarte o sobrenadante completamente. 13. Repita a lavagem com 10% de glicerol gelado com 100mL, 4mL e 1mL ressupenda gentilmente e centrifugando a cada passo. 14. Faça aliquotas de 100 e 300 L 15. Freeze em nitrogênio líquido (opcional) 16. Armazene imediatamente a 80ºC * Trabalhe no gelo. 11

15 Preparo de Células de Baixa Competência Células BL21 DE 3 de Baixa Competência. 1 Preparo da placa Em uma placa com meio Mínimo + Cloranfenicol plaquei a célula BL21 DE3 Incube a 37ºC por 16 horas ou overnight 2 - Inoculo em 3ml. Em um tubo estéril p/ cultura de células coloque assepticamente 3mL de meio de cultura (ex: 2 YT) inocule uma colônia das células da placa Incube 37ºC por 24horas ou overnight em um shaker. 3 - Inoculo em 25ml. Da cultura obtida do inoculo de 3ml transfira 500μL para: 25ml de meio (2 YT ou LB) sem antibiótico em um Erlen meyer de 100ml. Incube 37ºC em um shaker até OD 590nm (absorbância de 0.3 ou 0,4) 4 - Centrifugue 4000rpm, por 5 minutos 5 - No Gelo ressuspenda o pellet em 2 ml do tampão TSS 1x, (equivalente a 1/10(um décimo) do volume original) 6 - Incube por 5 a 15 minutos no gelo 7 - Faça pequenas alíquotas de 100μL em eppendorfs de 0,5mL 8 - Freeze a 80ºC ou nitrogêneo líquido 9 - Estoque a 80ºC Preparo do Tampão TSS1x. Para 100ml para 10ml LB ou 2YT...95mL... 9,5mL PEG (10%)...10g...1g (polietilene glicol) 2M MgCl2...2mL...200μL (20-50 mm final) DMSO 5%... 5mL μl Esterilize filtrando 0,22μm.. Armazene a 4ºC. 12

16 Transformação de DNA plasmidial em Células Competentes Introdução A competência natural das bactérias para receber o DNA plasmidial do meio circundante é um fenômeno raro (verificando-se apenas em determinadas espécies e em condições fisiológicas específicas). Assim, é necessário desenvolver essa capacidade, ou seja, é necessário tornar as células competentes para viabilizar a introdução do DNA recombinante no hospedeiro selecionado. Ao processo de entrada de DNA livre (isto é, DNA em solução, fora do invólucro celular) na célula dá-se o nome de transformação. A introdução de DNA em células bacterianas (como por exemplo na linhagen da Escherichia coli DH5 α ou XLI-Blue) pode ser realizada recorrendo às técnicas de transformação clássica ou à eletroporação Na transformação química (ou clássica) as células (principalmente de E. coli) são tornadas competentes, por tratamento com uma solução fria de cloreto de cálcio ou outros íons carregados positivamente. Os íons Ca +2 formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas da membrana celular e assim facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico da transformação complementa este processo de captação, provavelmente criando um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA através da zona de adesão a que se segue um choque térmico de curta duração. Este DNA exógeno passa a fazer parte do material genético bacteriano que será herdado pelas novas células à medida que a bactéria se multiplica. As bactérias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma ou mais características novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibiótico permitindo o processo seletivo. 13

17 Transformação de DNA plasmidial em Células Competentes Procedimento: 1. Identifique os tubos a serem usados e coloque-os no gelo. 2. Coloque de 0,5uL a 1uL de DNA plasmidial (de 100ng a 1ug). 3. Retire as células competentes do freezer 80ºC e desconge-as no gelo. 4. Homogeneize bem e transfira 50uL de células competentes para os tubos com os plasmídeos aliquotados. 5. Incube no gelo por 30 minutos. Ligue o banho maria. 6. Choque térmico: Coloque a 42ºC. por 1 minuto e 30 segundos. 7. Volte para o gelo por 2 minutos 8. Imediatamente, adicione com assepsia 500uL de meio de cultura LB sem antibiótico. Use o bico de busen. 9. Incube a 37ºC por 1 hora. 10. Plaquei 50uL em meio agar com antibiótico no qual o plasmídeo confere resistência. 11. Incube a 37ºC por 16 horas ou overnight com o meio de cultura voltado para cima 12. No dia seguinte passe um parafilme na placa e transfira 4ºC Estoque em Glicerol 30% O estoque de plasmídeo dentro da bactéria e conservado em glicerol pode ser armazenado por tempo indeterminado, desde que não descongele. Também pode ser feito estoque em glicerol da própria célula competente vazia. A partir da cultura crescida 37ºC overnight contendo o plasmídeo de interesse dentro da bactéria prepare o estoque em 30% de glicerol ul da cultura e 300 ul de glicerol. 2- Homogeneíze bem até misturar completamente 3- Armazene imediatamente no freezer 80ºC 4- Evite que o estoque descongele quando for reutilizar. 5- Prepare tudo que for precisar antes de retirar o estoque do 80ºC 6- Trabalhe no gelo e seja rapidíssimo. 14

18 Teste para simples verificação do plasmídeo O teste de verificação do plasmídeo deve ser feito antes do processo de extração e analisado em gel de agarose m confirmar se o DNA em estudo esta presente na colônia inoculada, evitando o processo de extração e purificação de colônias vazias e consequentemente o gasto de reagentes Procedimento 1 Colete 500 L da cultura 2 Centrifugue rpm 2 minutos 3 - Ressuspenda o pellet em 40 L de STE ( TE + 0,1 % de NaCl) 4 Adicione 20 L de fenol ph Adicione 20 L de Clorofórmio/Acool isoamílico (24:1) 6 Centrifugue rpm 5 minutos 7 Aplique 20 L em gel de agarose 1% (pode ser reciclável) * Se aparecer uma banda nítida de acordo com o peso/tamanho de seu plasmídeo, proceda com a purificação. Solução de STE ph 8.0 Maniatis 3 B20 10 mm Tris HCl (ph8.0) 1 mm EDTA (ph8.0) 0,1 % de NaCl 15

19 Extração e Purificação de DNA plasmidial Introdução Entre as técnicas de DNA recombinante normalmente utilizadas, a purificação de plasmídeos consiste naquela mais básica e fundamental, necessária para quase todos os fins, seja para clonagem, sequenciamento, transfecção, introdução de modificações em sequências, mutagênese sítio-dirigida, entre outras. O princípio básico de isolamento consiste em primeiro passo na transformação bacteriana (inserir o plasmídeo de interesse dentro de uma bactéria a mais comumente empregadas em biologia molecular são as linhagens de E.coli; DH5α e XL1 Blue.) e o crescimento de uma colônia contendo o plasmídeo de interesse em condições que maximize o número de cópias do plasmídeo por célula bacteriana. O método mais utilizado para o isolamento e purificação de DNA de plasmídeo se baseia na lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos Entretanto, o tamanho do plasmídeo não deve ser muito grande (<20 kb). O método de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferença em desnaturação, em condições alcalinas (ph ~12) entre o DNA plasmidial circular e o cromossomal de alto peso molecular. Plasmídeos grandes apresentam propriedades mais próximas ao DNA cromossomal dificultando a separação entre eles. O método de extração inicia-se com a ressuspensão das células, coletadas através de centrifugação, com a solução I (Tris, EDTA e glicose como tampão e osmótico). O EDTA é responsável por seqüestrar o magnésio, impedindo que a cascata da DNase inicialise As células tambem podem ser lisadas incluindo lisozima na Solução I.que produz orifícios nas membranas originando estado hipotônico A solução II contém SDS e NaOH. O SDS (detergente) possui a função de lisar as membranas da célula e desnaturar as proteínas celulares (incluindo enzimas), enquanto que o NaOH eleva o ph do extrato para valores muito alcalinos (ph 12 a 12,5). Nessas condições, ocorre a desnaturação diferencial do DNA, com o DNA cromossomal sendo desnaturado, enquanto que o DNA plasmidial circular é menor permanecendo inalterado. Ao incorporar o Acetato de Potássio (ou Acetato de Sódio) com ph 5,5, o extrato é neutralizado sob condições de alta concentração de sais, fazendo com que o DNA cromossomal precipite, enquanto que o DNA plasmidial permaneça em solução. A adição dessa solução também causa a precipitação de proteínas complexadas ao SDS, incorporado pela adição da solução II. A centrifugação final produz um extrato claro com o 16

20 DNA plasmidial em solução. O DNA é ressuspenso em TE, faz-se tratamento com RNase. Para reduzir a contaminação do DNA purificado com proteínas, pode-se empregar a extração com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e/ou clorofórmio:álcool isoamílico. O DNA é então precipitado através da adição de alcool (0,8 1,0 X volume de isopropanol ou 2,5 x volumes de etanol gelado) na presença de sais. Após a lavagem com etanol 70% para remoção do excesso de sais e RNAses. Para algumas aplicações, tais como o sequenciamento ou transfecção de células, existe um requerimento alto para pureza do DNA plasmidial. Tradicionalmente, empregava-se a purificação por gradiente com cloreto de césio. Esse método requer uma ultracentrífuga, além de ser oneroso e usar grandes quantidades de brometo de etídeo. Por essas razões, houve uma tendência a usar cada vez menos esse método, passando a utilizar outros métodos que empregam resinas de afinidade com DNA plasmidial e disponíveis em kits comerciais. Outra alternativa viável consiste no emprego de precipitação em polietilenoglicol (PEG). Os Kits comerciais prontos para extração e purificação de plasmídeo, tais como o Wizard Plus Minipreps da Promega; ou Qiagen são baseados no emprego de resinas de sílica, específicas para a purificação dos plasmídeos. De modo geral, esses Kits comerciais iniciam a purificação do plasmídeo utilizando o mesmo protocolo de Lise Alcalina até a obtenção do lisado, seguido de ligação do plasmídeo com uma resina específica que após a lavagem da coluna e remoção das impurezas e contaminantes, o plasmídeo pode ser eluído com água Milli Q ou TE de forma pura. Após a purificação de um plasmídeo, é sempre recomendável analisar a identidade e características do plasmídeo através da digestão com enzimas de restrição, para confirmar o tamanho dos fragmentos esperados, ou em simples eletroforese de gel de Agarose 17

21 (5 a 10 ml de Cultura) Extração e Purificação - kit Miniprep da Promega. *Para purificação com cultura de 10 ml use 400ul das soluções 1, 2 e A partir da placa transformada inocule uma colônia em 5 ou 10 ml de Cultura LB com antibiótico, incube 37ºC overnight. 2. Transfira a cultura para tubos de centrífuga 14 ml ou tubos eppendorfs 1,5mL 3. Centrifugue a rpm por 3minutos e descarte o sobrenadante. 4. Se usar tubos eppendorfs 1,5 ml repita o procedimento no mesmo tubo 5. Adicione 200uL da solução I (cell resuspension solution) 6. Resuspenda por fricção ou com uma pipeta, até ficar homogêneo. Incube 5 minutos a temperatura ambiente. 7. Transfira para tubo eppendorfs de 1,5mL (se for o caso) 8. Adicione 200uL da solução II (cell lysis solution). 9. Homogeneize por inversão várias vezes (lentamente) incube 5 minutos a temperatura ambiente. (não ultrapasse de 5 minutos) nesta fase o aspecto ficará viscoso. 10. Adicione 200uL da solução III (cell neutralization solution). Homogeneize por inversão várias vezes, incube 5 no gelo. 11. Agite bem a resina e coloque a 37ºC por 10 minutos para entrar em solução. 12. Centrifugue os tubos rpm por 5 minutos. 13. Identifique uma coluna para cada amostra. 14. Adicione 1 ml da solução de resina (agite antes de usar). 15. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado. 16. Filtre a vácuo. 17. Adicione 2 ml da solução de lavagem de coluna. 18. Continue filtrando (não deixe a coluna secar) 19. Retire a parte inferior da coluna introduza em tubo eppendorf 1.5mL 20. Centrifugue a rpm por 1 minuto (para retirar o excesso) 21. Transfira a coluna para outro eppendorf. 22. Adicione 30uL de H 2 O Milli Q ou TE (se possível aquecido a 65º) 23. Espere de 1 a 3 minutos. 24. Centrifugue a rpm por 1 minuto. 25. Faça leitura no espectrofotômetro. Armazene o DNA extraído a 20ºC. 18

22 Extração e Purificação - Miniprep modificado por Marie/Joaquim 1. A partir da placa transformada inocule uma colônia em 5 ou 10 ml de Cultura LB com antibiótico, incube 37ºC overnight. 2. Transfira a cultura para tubos de centrífuga 14 ml ou tubos eppendorfs 1,5mL 3. Centrifugue por 5 minutos 4000 rpm 4. Ressuspenda o pellet em 200 L de solução I, mais 2 L de lisozima (50mg/mL) incube 5 minutos 37ºC 5. Adicione 400 L solução II, incube 5 minutos temp. ambiente 6. Adicione 200 L solução III, incube 5 minutos no gelo. 7. Centrifugue por 5 minutos à rpm. 8. Transfira o sobrenadante para outro tubo, acrescente 750 L isopropanol. Incube por 5 minutos à temperatura ambiente. 9. Centrifugue por 5 minutos à rpm. Descarte sobrenadante. Retire bem todo o álcool. 10. Ressuspenda em 200 L de TE (incube à 37ºC, se precisar). 11. Adicione mesmo volume de acetato de amônio 5M (200 L) agite forte. 12. Centrifugue por 10 minutos à rpm. Transfira o sobrenadante para outro tubo. 13. Adicione 750 L de etanol 100%.Centrifugue por 10 minutos à rpm. Descarte sobrenadante. 14. Adicione 500 L de etanol 70%. Centrifugue por 2 minutos à rpm. Descarte sobrenadante e espere o pellet secar. 15. Ressuspenda em e200 L de TE. Adicione 1 L de RNAse (10mg/mlL) para cada 100 L de TE. 16. Incube a 37ºC por 30 minutos. 17. Proceda com fenol /clorofórmio 19

23 (200mL de Cultura) Extração e Purificação - kit Midiprep da Promega. 1. A partir da placa transformada inocule uma colônia em 5 ou 10 ml de Cultura LB com antibiótico, incube 37ºC overnight. 2. Transfira a cultura para tubos de centrífuga. 3. Centrifugue a rpm por 10 minutos. Decante o sobrenadante. 4. Adicione 3ml da solução (cell resuspension solution) em cada tubo. 5. Resuspenda com a pipeta, até que não haja mais glóbulos e fique homogêneo. 6. Incube 5 minutos a temperatura ambiente. 7. Adicione 3ml da solução (cell lysis solution). 8. Homogenize por inversão (lentamente) até ficar viscoso. Incube 5 minutos a temperatura ambiente. (não ultrapasse de 5 minutos). 9. Adicione 3ml da solução (cell neutralization solution) Homogeneize por inversão 10. Incube 5 minutos no gelo 11. Centrifugue a rpm por 15 minutos a 4ºC. 12. Transfira o sobrenadante para outro tubo 13. Identifique uma coluna para cada amostra. (identifique a parte inferior) 14. (Agite a resina antes de usar se preciso incube a 37ºC por 10 minutos). 15. Adicione 10 ml da solução de resina. 16. Adicione na mesma coluna o sobrenadante do tubo centrifugado. 17. Filtre a vácuo. 18. Adicione 25 ml da solução de lavagem de coluna. 19. Filtre a vácuo novamente. 20. Corte a parte inferior da coluna e introduza em eppendorf identificado. 21. Centrifugue a rpm por 30 segundos. (retirar o excesso). 22. Transfira a coluna para outro eppendorf. 23. Adicione 200 de H 2 O Milli Q ou TE (se possível aquecido a 65ºC). 24. Espere de 1 a 3 minutos. 25. Centrifugue a rpm por 1 minuto. 26. Faça quantificação no espectrofotômetro 27. Armazene o DNA extraído a 20ºC 20

24 Extração e Purificação - Maxprep com PEG 30% Procedimento: 1 A partir da placa transformada inocule uma colônia em 5 ml de meio LB com antibiótico - incube 37ºC overnight 2 - Transfira para um erlen de 1 litro com 500 ml de meio LB e antibiótico -incube 37ºC overnight 3 - Colete as células: - transfira a cultura para tubos de centrífuga, centrifugue rpm por 10 minutos. * Obs.: retire 500 ul para teste fenol e 1000uL para estoque glicerol - centrifugue 5700 rpm por 10 min * se não for continuar frize o pellet a -20ºC 4 - Adicione 20 ml da solução I - ressuspenda até que não haja mais gumos, - adicione 10mg de lisozina diluída em água - incube 5 min a temperatura ambiente 5 - Adicione 40 ml de solução II (fresca) - homogeneíze por inversão delicadamente, cerca de 6 a 10 vezes -incube a temperatura ambiente por 5 minutos * não deve ultrapassar 5 minutos 6 - Adicione 20 ml da solução III - homogeneíze por inversão de 6 a 10 vezes - incube 20 min no gelo * veja se os tubos estam com o mesmo volume/ peso 7 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos - Filtre o sobrenadante em gaze em outro tubo identificado 8 - Adicione 60 ml de isopropanol a temperatura ambiente (espere de 2 a 40 minutos opicional), balanceie os tubos 9 - Centrifugue 5700 rpm por 20 minutos - descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 ml de água - transfira para tubos de 50 ml 21

25 Purificação 10 - Adicione um volume NH4Ac 5M (acetato de amônio) e agite bem - centrifugue 4000 rpm por 15 minutos - transfira o sobrenadante para tubos de 50 ml 11 - Adicione 2 ½ o volume de etanol absoluto -incube a temperatura ambiente 5 minutos - centrifugue 4000 rpm por 15 minutos - descarte o sobrenadante -ressuspenda o pellet em 4 ml de água, - adicione (4 ul RNAse 10mg / ml) Incube 37ºC por 1 hora * se não for continuar pode frizar -20ºC após RNAse 12 - Adicione 4 ml de PEG 30% + 1.5M NaCl, incube no gelo 40 minutos * pode substituir a incubação no gelo por geladeira 4ºC overnight - transfira para TUBOS TAMPA ROXA OU AMARELA - centrifugue por 40 minutos 4 ºC a rpm 13 - Ressuspenda o pellet em 400 ul de água Milli Q - adicione 40 ul buffer 10 X e 4 ul PK 10 mg/ ml - incube 37º C por 30 minutos 14 - Proceda com Fenol/Clorofórmio 22

26 Purificação de DNA com Fenol Clorofórmio Ao trabalhar com fenol use luvas e óculos protetores se possível, evite contato com a pele e roupa, evite respirar vapores. Se possível use capela de exaustão química. Considerando que tenha 200uL de amostra.obs: Pipete a fase inferior do fenol. 1. Acrescente mesmo volume de fenol ph8 em cada eppendorf 200 L). 2. Agite bem ou vortex. Centrifugue a 13000rpm por 10 minutos. 3. Retire a 1ª fase e passe para outro eppendorf. Tome cuidado para não pipetar as impurezas, deve formal um anel entre as duas fazes. Se necessário repita o tratamento com fenol. 4. Acrescente o mesmo volume de fenol (clorofórmio e álcool isoamílico 24:1) 1:1, ou seja 100 L de um e 100 L do outro. Agite bem ou vortex. 5. Centrifugue a rpm por 10 minutos 6. Retire a 1ª fase e passe para outro eppendorf. 7. Certifique que não haja mais impurezas para proceder com clorofórmio. 8. Acrescente igual volume de clorofórmio e álcool isoamílico (200 L). 9. Agite bem ou vortex. Centrifugue a rpm por 2 minutos. 10. Retire a 1ª fase e passe para outro eppendorf. Acrescente 1/10 do volume de Acetato de Sódio 3M ph 5.2 (20 L) e o mesmo volume de isopropanol absoluto (200 L) ou 2 vezes e meio o volume de Ethanol absoluto gelado (100%). 500uL 11. Deixe no freezer a 20ºC por 10 minutos, (so quando usar ethanol absoluto, esse passo também é opcional) Centrifugue a rpm por 15 minutos 12..Aspire o sobrenadante e adicione 500 L de ethanol a 70% gelado. 13. Repita a lavagem com ethanol 70% mais uma vez ou até sair o cheiro do fenol. 14. Não toque no pellet, coloque o tubo para centrifugar no mesmo sentido. 15. Centrifugue a rpm por 2 minutos.aspire o sobrenadante. 16. Espere secar e ressuspenda o pellet com TE Buffer (ph 8.0). Ou H2O Milli Q. 17. A quantidade do solvente depende do tamanho do precipitado. Ou 100 L para cada 100uL da cultura inicial. 18. Identifique bem. Determine a concentração no espectrofotômetro 19. Armazene no freezer a 20ºC. 23

27 Soluções Protocolo Maxprep PEG 30% Solução I 500mL 50 mm Glucose 25mL 1M 25 mm Tris HCl( ph 8.0) 12,5 ml -1M 10mM EDTA (ph 8,0) 10mL 0,5M H 2 O q. s. p. 500mL Autoclave 15 minutos a 121ºC Armazene a 4ºC. Solução II 500mL 100mL 0,2 M NaOH 20mL 5 M 4mL 1% SDS 50mL 10% 10mL H 2 O q. s. p. 500mL 100mL * É aconselhável o uso de solução fresca Solução III 100mL 500L 5M acetato de potássio 60mL 300mL Ácido acético glacial 11,5mL 57,5mL H 2 O 28,5 ml 142,5mL PEG 30%...100mL H 2 O destilada 50mL 30% de PEG g 1,5M de NaCl 8.7g Agite aquecendo Complete o volume com H 2 O p/ 100mL Filtre 0,22μm ou autoclave 24

28 Soluções Protocolo Maxprep PEG 30% Lisozima Lisozima 10mg H 2 O destilada 1mL 10X PK Buffer 100mL H 2 O destilada 40mL 0,2 M Tris (ph 8,0) 20mL (1M) 25mM EDTA 5mL (0,5 M) 0,3 M NaCl 6mL (5M) 2% SDS 20mL (10%) Complete o volume com H2O p/ 100mL PK 10mg/ml Ressuspenda 10mg de Proteinase K em água destilada TE ph 8.0 Maniatis 3 B20 10 mm Tris HCl (ph8.0) 1 mm EDTA (ph8.0) RNase 10mg/mL *Uso no protocolo Qiagem - prepare 25ug/ml na solução 1 *Uso no protocolo fenol / clorofórmio prepare 10mg/ml 10mg de RNase A 0,1 M acetato de sódio ph 4.8 0,3mM EDTA ph 8.0 Complete volume para 1mL com água destilada, homogeneíze Aqueça a 80ºC por 10 minutos Deixe esfriar a temperatura ambiente lentamente - overnight Faça alíquotas de 100uL e frize a -20ºC 25

29 Extração e Purificação - kit Maxprep da QIAGEN 1. Colete as células centrifugando a cultura de 300 a 500mL a rpm por 10 minutos. Descarte sobrenadante. Remova todos os traços do sobrenadante através da inversão do tubo sobre um papel toalha. 2. Adicione 10 ml de Buffer P1 com RNAse tampão de ressuspensão. 3. Homogeneíze com vortex ou sucção com pipetas até que não haja mais grumos Certifique-se que a RNAase A foi adicionada ao Buffer P1. A bactéria deve ser ressuspendida completamente. Transfira para tubo de 50 ml. 4. Adicione 10 ml de Buffer P2 - tampão de lise. Homogeneize levemente por inversão 4 a 6x incube a temperatura ambiente por 5 minutos. Não aplique o vortex, isso pode resultar em rompimento do DNA genômico. O lisado deve parecer viscoso. Não permita que a reação de lise proceda por mais de 5 minutos. 5. Adicione 10 ml do Buffer P3 gelado - tampão neutralizador 6. Homogeneize por inversão + ou 6x, incube no gelo por 20 minutos. 7. A precipitação é potencializada usando Buffer P3 resfriado e incubando no gelo. Após adição de Buffer P3 forma-se um material branco e precipitado e o lisado tornam-se menos viscoso. O material precipitado contém DNA genômico, proteínas celulares e SDS. O lisado deve ser misturado suavemente para evitar precipitação do SDS. 8. Centrifugue rpm por 15 minutos a 4ºC. 9. Após a centrifugação o sobrenadante deverá tornar-se translúcido. 10. Filtre o sobrenadante em gaze ou papel toalha, para evitar entupimento da coluna. 11. Adicione 10 ml do Bufffer QBT - tampão equilibrador na coluna e espere filtrar. Coloque a coluna em um tubo de centrífuga. 12. Transfira o sobrenadante para a coluna equilibrada e espere que a coluna esvazie completamente por gravidade. 13. Adicione 2 x 25 ml de Buffer QC - solução de lavagem 14. A primeira lavagem é suficiente para remover todos os contaminantes da maioria das preparações de DNA. A segunda lavagem é particularmente necessária quando grandes volumes de cultura ou quando cepas de bactérias produzem grandes quantidades de carboidratos. 26

30 15. Todas as soluções deverão estar em temperatura ambiente para minimizar a precipitação de sais, embora as centrifugações seja realizada a 4 o C para prevenir um superaquecimento da amostra. 16. Adicione na coluna 15 ml de Buffer Q.F tampão eluidor 17. Adicione 0,7 do volume de isopropanol temperatura ambiente ( p/ 15 ml de Q.F. adiciione10,5ml de isopropanol 18. Centrifugue rpm por 15 minutos e descarte o sobrenadante 19. Sem ressuspender o pellet, adicione 500μL de etanol 70% em temperatura ambiente e centrifugue a rpm por 10 minutos.. O etanol a 70% remove sais precipitados, pois é mais volátil, tornando-se mais fácil a ressuspensão do DNA. 20. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. O pellet de isopropanol pode parecer hialino e podem dificultar a visualização 21. Deixe os tubos invertidos sobre um papel toalha e espere que o pellet seque a temperatura ambiente. Certifique que todo etanol tenha evaporado. 22. Ressuspenda o pellet em 300 μl de TE e transfira para um eppendorf. Ressuspenda o pellet de DNA enxaguando as paredes do tubo. Pipetar o DNA várias vezes pode causar danos e deve ser evitado. Uma secagem exacerbada do DNA pode dificultar sua ressuspensão. O DNA dissolve melhor em condições levemente alcalinas, não é fácil dissolvê-lo em tampões ácidos. 23. Quantifique em espectrofotômetro e depois analise uma alíquota (500ng) em gel de agarose 1% 24. Armazene a 20ºC 27

31 Soluções para Maxpreps da QIAGEN Buffer P1 (Resuspension Buffer) Buffer P2 (Lysis Buffer) Buffer P3 (Neutralization Buffer) 50 mm Tris.Cl, ph 8.0; 2 a 8 o C, após adição 10 mm EDTA; de RNAase A. 100 g/ml RNAase A Use fresco 200 mm NaOH, 1% SDS(m/v); Temp. ambiente 3,0 M acetato de potássio ph 5.5 Temp. ambiente 28

32 Extração e Purificação - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz 1. Procedimento para 200mL de Cultura 2. Transfira os 200 ml da cultura para tubos de centrífuga, balancei e centrifugue à 4000 rpm por 15 minutos. 3. Descarte o sobrenadante. Deixe os tubos virados para baixo para escorrer todo o líquido. 4. Ressuspenda o pellet com TEG Buffer, utilizando 5 ml para cada tubo. Utilize pipeta de vidro e homogeneize bastante aspirando e soltando o líquido até que todo o precipitado se solte e se desfaçam todos os grumos. 5. Transfira com a mesma pipeta para tubos de 50 ml. Incube a temperatura ambiente por 5 minutos 6. Acrescente 10 ml em cada tubo da Solução Lyses Buffer. Homogeneize lentamente por inversão (6x). Incube a temperatura ambiente por 5 minutos. 7. Acrescente 5 ml em cada tubo da Solução Neutralizante. Homogeneize e deixe no gelo por 5 minutos. 8. Centrifugue à 4000 rpm por 20 minutos. 9. Filtre em guardanapo de papel branco transfira para tubo de centrífuga (tampa roxa ou amarela). 10. Acrescente igual volume de isopropanol. Se necessário divida em dois tubos. Balancei com isopropanol. 11. Centrifugue rpm à 40C por 20 minutos. Descarte o sobrenadante. 12. Ressuspenda o pellet em 500 L de H2O milli Q e homogeneize bem. Transfira para um eppendorf, acrescente mais 500 L de H2O no tubo de centrífuga, lave bem e transfira para o mesmo eppendorf. Homogeneize e divida o conteúdo para outro eppendorf. 13. Obs: a quantidade de H2O depende do tamanho do precipitado. 14. Prossiga com purificação Fenol/Clorofórmio. 29

33 Soluções: Kit Maxprep /Qiagen Modificado por Prof: Solução TEG Buffer : Ressuspensão Preparo de 250 ml de solução, com as seguintes concentrações finais: Tris base 25 mm (ph 8.0)...6,26mL (de uma solução estoque 1M) EDTA 10 mm (ph 8.0)...5mL (de uma solução estoque 0.5M) Glicose 50 mm...12,5ml (de uma solução estoque 1M) - Complete o volume com H 2 O destilada para 250 ml. - Homogeneíze no agitador magnético. - Transfira para um frasco com tampa. - Armazene na geladeira. Obs: Quando for utilizar, acrescente 5mg de lisozima por ml de solução a ser utilizada. Solução 2: Lyses Para cada 20 ml de solução calcule as concentrações finais de: 0,2 M de NaOH...0,8mL (de uma solução estoque 5M) 1% de SDS...2mL (de uma solução estoque 10%) - Complete o volume com H 2 O destilada. - Prepare apenas a quantidade a ser utilizada. Solução 3: Neutralizante: Para volume de 100 ml: -Acetato de Potássio (KAc) 5 M...60 ml - Ácido Acético Glacial...11,5 ml - Complete o volume com H 2 O destilada. - Homogeneíze no agitador magnético. - Armazene 4ºC 30

34 Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani) (Maniatis 3 pág A.1) P/ 1 litro p/ 100 ml 1. H2Obidestilada...800mL...80 ml 2. Bacto triptone...10g...1g 3. Bacto yeast extract...5g...2,5g 4. NaCl...10g...5g 5. Homogeneize em agitador magnético até dissolver. 6. Ajuste ph 7,0 com NaOH 5M. 7. Ajuste o volume final (p/ quantidade que esta fazendo) com H 2 O destilada 8. Autoclave por 20 minutos a 121ºC. Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o ph. Adicione o antibiótico na concentração especificada pelo protocolo na temperatura entre 37 a 40ºC e plaquei. Meio de cultura 2x YT Medium (Maniatis 3 pág A.3) P/ 1 litro p/ 500mL p/ 200mL 1. H 2 Obidestilada mL...400mL...150mlL 2. Bacto triptone...16g...8g...3.2g 3. Bacto yeast extract...10g...5g...2g 4. NaCl...5g...2,5g...1g 5. Homogeneize em agitador magnético até dissolver. 6. Ajuste ph 7,0 com NaOH 1M (+ ou 1,3 ml /500ml) 7.. Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H 2 O bidestilada. 8. Autoclave por 20 minutos a 121ºC. 9. Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o ph. 10. Adicione o antibiótico na concentração especificada pelo protocolo na temperatura entre 37 a 40ºC 31

35 Meio de cultura SOB Medium (Maniatis 3 pág A.2) P/ 1 litro p/ 100mL 1. H 2 Obidestilada...900mL... 80mL 2. Bacto triptone...20g... 2g 3. Bacto yeast extract...5g... 0,5g 4. NaCl...0,5g... 0,05g 5. Homogeneize em agitador magnético até dissolver. 6. KCl. 250 mm...10ml... 1mL 7. Ajuste ph 7,0 com NaOH 5N 8. Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H 2 O bidestilada. 9. Autoclave por15 á 20 minutos a 121ºC 10. Depois adicione 5mL/L de uma solução estéril de MgCl 2 2M (500μL/100ml) Obs: KCl 250mM (1.86g de KCl em 100ml de H 2 O bidest) (MW ) Meio de cultura SOC Medium (Maniatis 3 pág A.2) O SOC Medium é similar ao SOB exceto por ele conter 20mM de glucose. Após autoclavar o meio SOB adicione a uma temperatura de 60ºC, 20mL/L de uma solução estéril de Glucose 1M. 32

36 Meio de cultura NZY Top Agarose P/ 1 litro p/ 200mL 1. H2O bidest...900ml...180ml 2. NaCl... 5g...1g 3. MgSO4... 2g...0,4g 4. Yeast extratct...5g...1g 5. NZ amine (casein hydrolysate)...10g...2g 6. Agarose...7% 7. Ajuste ph 7,0 com NaOH 8. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada. 9. Autoclave por 20 minutos a 121ºC. OBS: Temos NZY pronto. Veja rótulo em anexo M9 Minimal Medium (Based on Maniatis and Notebook: Dec 1, 1993 and April 8, 1993, also see Notebook III: p79). P/ 500ml P/200ml 1. H 2 Obidestilada...445mL...175mL 2. Agar 1.5%...7,5g...3g 3. Autoclave por 20 minutos a 121ºC 4. Após autoclavar a temperatura de 55ºC adicione: 5. CaCl 2 1M...50 μl (autoclavado) (MW g/mol)...20μL 6. M9 Salt 10x... 50mL (autoclavado)...20ml 7. MgSO 4 1M...1mL (autoclavado) (MW 246,5g/mol) μl 8. Glucose 20%...10mL (autoclavado)...4ml 9. Vit. B1 1% μl. (filtre o,22μm)...40 μl 10. Arginine 100mg/ml...0,5mL (filtre o,22μm) μl 11. Plaquei 33

37 Preparo do 10x M9 Salt p/ 500mL p/250ml p/ 100mL 1. H 2 Obidest...400mL mL... 6g 2. Na 2 HPO g...15g (corrigir H2O) g 3. KH 2 PO g...7,5g... 1g 4. NH 4 CL...5g...2,5g... 0,5g 5. NaCl...2,5g g...0,5g 6. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H 2 O bidestilada. 7. Autoclave 121ºC por 20 minutos. Nota 1: Correção da H 2 O do Na 2 HPO 4 7 H 2 O Peso molecular do Na 2 HPO Peso molecular do Na 2 HPO 4 7 H 2 O 268 PM g...250mL PM x=28,3g Nota 2: In Maniatis Na 2 HPO 4 é 64g. Este protocolo é baseado em Current protocol Red Book Nota 3: Antibiótico/Clorofenicol (Maniatis 3 A6) Prepare 34mg em 1ml de ethanol. - M9 (célula DE3) Conc. final = 68 g/ml 34

38 Eletroforese de DNA em gel de agarose A agarose é um polissacarídeo, e forma uma rede que prende as moléculas durante a migração de agarose, a diferença no gradiente de separação depende da concentração do gel. A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas de proteínas, DNA e RNA, que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel. A eletroforese de gel de agarose é usada como método analítico e preparativo, após separar os fragmentos digeridos em tamanho específico, é possível retirá-lo do gel e purificar para ser usado posteriormente em vários procedimentos de técnicas de manipulação genética. É comumente usados gel de agarose para fragmentos entre 100pb a 12 mil pares de bases, fragmento menor é indicado gel de acrilamida 10% ou utilização de agarose especial A velocidade de migração bem como o poder de resolução de um gel depende de vários parâmetros, como concentração do gel, tamanho e forma da molécula, voltagem aplicada e tampão de corrida. Para visualização e interpretação correta dos resultados obtidos, são necessárias a incorporação de um agente intercalante de DNA (Brometo de Etídeo) (WHITE et al., 1998) e a utilização de marcadores de massa moleculares apropriados de maneira que migrem em paralelo ás amostras e um tampão de corrida com glicerol e corante azul, o glicerol consiste que as amostras afundem no poçinho e o azul em acompanhar a corrida. Nota: Para purificar bandas não use agarose reciclada. Use óculos de proteção contra a luz Ultra Violeta. O Brometo de Etídeo é altamente tóxico e carcinogênico, deve-se ter o máximo de cuidado ao manuseá-lo, use luvas, não aspire vapores. 35

39 Quantificação do DNA - Maniatis 3 E-5 Manuseio do espectrofotômetro. Ligue o estabilizador e aparelho na lateral, levante o visor. Espere que todas as estrelinhas se iluminem. Escolha a opção Spectrum Use o aparato menor cuveta de quartzo Coloque 200ul de seu diluente ex. água em cada cuveta. Aperte F1 Base correct zerar o aparelho. Retire a cuveta do compartimento inferior e coloque a amostra a ser lida. Aperte Start espere a curva da leitura ser feita Aperte F2 Data Process Digite 5, enter, 20 e enter. Anote a leitura. Diluição do DNA - 1/100 ou 1/50 volume final de 200uL A quantificação e feita em Espectrofotômetro com amostra diluída. Exemplo: diluição de 1/100 (2 L de DNA e 198 L de H 2 O Milli Q) Leitura da Proteína: em 280 nm 0,162 Leitura do DNA: em 260 nm 0,306 Cálculo da leitura do DNA dupla fita Cálculo do fator r razão (fator de pureza do DNA) 260nm / 280nm 0,306 : 0,162 =1.8% OBS: 1,6 % DNA contaminado com proteínas de 1,7 % a 1.9% DNA puro 2.0 % DNA contaminado com RNA Fórmula Leitura da Abs.em 260nm x diluição x 50(=OD) : 1000 = g/ L g/ul 0,306 x 50 x 100 : 1000 = 1.5 g/ L (Concentração em g/ L) 36

40 Preparo do Gel de agarose novo 1% ou 0,7% Prepare apenas a quantidade suficiente para o uso no momento Gel pequeno 0,7% - 0,42g agarose...30 ml TAE 1x ou TBE 1x Gel grande 0,7%- 0,21g agarose...60 ml TAE 1x ou TBE 1x Faça os cálculos para saber quanto precisa pesar de agarose, para a quantidade e concentração diferentes. 1. Em um erlem já destinado à vidraria para uso com agarose e brometo de etídeo coloque a agarose, e adicione a tampão TAE 1x (estoque 10x) ou TBE 1x (estoque 10x) leve ao microondas por uns 3 minutos ou até que a agarose esteja completamente derretida, evite ferver. 2. Espere a agarose derretida ficar a temperatura de pelo menos 50ºC adicione Brometo de Etídeo 10mg/mL (estoque x) para que fique na concentração final de 1x, ou 0,5x se preferir manusear menos quantidade de brometo, (dá certo), evite aspirar vapores. Gel pequeno 1,5μL de Brometo Gel grande - 3μL de Brometo 3. O aparato (caminha) já deve estar montada e nivelada, coloque 8 a 10mm de agarose, coloque o pente espere polimerizar 4. Após completa polimerização retire o pente com cuidado, firmando a caminha para baixo e puxando o pente reto para cima. 5. Transfira o gel na posição horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampão usado para fazer o gel. Se for usar agarose reciclada, veja protocolo: Guarde o restante da agarose no próprio béquer e cubra com papel alumínio ou filme Identifique com fita crepe: Concentração, tampão usado, se tem brometo de etídeo ou não. Quando precisar é só aquecer. 37

41 Aplicando o gel de agarose Preparo das amostras de DNA para aplicar no gel Aplique 0.5μg a 1.0μg de DNA ou 10μL da PCR ou sistema de digestão Ex: 2 L de da amostra ( 0.5μg) - 8 L de de H 2 O destilada - 2 L de Tampão de Corrida 6x 1. Após completa polimerização do gel retire o pente com cuidado, firmando a caminha para baixo e puxando o pente reto para cima. 2. Transfira o gel na posição horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampão 1x. 3. Aplique 6 L de marcador de peso molecular no primeiro poçinho (1 g/ L) 4. Aplique todo o volume da amostra preparada - uma cada poço 5. Tampe a cuba de eletroforese e encaixe os eletrodos (+ positivo / - preto) 6. Ligue a fonte de eletroforese, selecione a corrente do negativo para positivo Volts / mais ou menos uns 40 minutos. 8. A confirmação do fluxo de corrente é dada pela observação da formação de bolhas a partir dos eletrodos. OBS. DNA é (-) migra para o anodo (+) 9. Monitore a migração do DNA pela migração dos corantes do tampão de corrida, é aconselhável correr 1/3 do gel Azul de bromofenol: migra ~ 300bpCianol de xileno: migra ~ 4.000bp 10. Desligue a fonte de energia, desconecte os eletrodos, retire o gel da cuba e visualize o DNA no transluminador luz Utra Violeta. 11. Ou visualize no foto documentação, salve e fotografe (se for possível) 12. A leitura deve ser rápida porque o DNA se difunde no gel com o tempo. Quando for cortar a banda do gel, evite a luz ultravioleta sobre o DNA. Foto 38

42 Reciclagem de gel de agarose Em laboratórios de biologia molecular, a eletroforese em gel de agarose é usada, rotineiramente para separar moléculas de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero extraído de algas marinhas que apresenta custo elevado e pode ser reciclada para uso em análise simples de DNA. Procedimentos: 1. Estoque os géis em H 2 O destilada, quando houver um volume considerável inicie a descontaminação. 2. Troque diariamente a H 2 O destilada durante 15 dias. 3. Derreta a agarose em forno de microondas. 4. Para maior pureza do gel filtre a vácuo(aquecido) em gaze. 5. Para cada 90 ml de agarose reciclável; acrescente de10 ml a 20mL de H 2 O destilada. 6. Faça uma alíquota em um pratinho de pesagem e compare a concentração com um gel novo. (opcional). 7. Faça alíquotas de 90 ml, espere gelatinar 8. Transfira para recipiente maior cubra com H 2 O destilada, esse processo permite hidratação do gel até o momento do preparo final. Preparo final: 9. Transfira uma alíquota de 90mL da agarose pré-reciclada para um béquer. 10. Acrescente 10 ml de tampão TBE 10x ou TAE 10x 11. Leve ao microondas até derreter espere esfriar a uma temperatura de 50ºC 12. Acrescente 5 L de brometo de etídeo x 10mg/ml 13. Coloque na cuba com o pente. A quantidade que for usar no momento. 14. Guarde o restante no próprio béquer, identifique e cubra-o com papel alumínio. 15. Quando for reutilizar é só aquecer. 16. Faça a seguinte identificação no recipiente de gel reciclado pronto e disponível. Gel agarose 1% reciclavel Com Brometo de Etídeo Tampão... Data... Nome... 39

43 Preparo de reagentes e soluções O preparo de soluções com rigor passa pela avaliação do reagente químico que será utilizado. O acondicionamento adequado dos reagentes (temperatura, condições higroscópica e volátil e sensibilidade a luz) conservação e manutenção dos equipamentos básicos como balança e phmetro são fatores importante no preparo correto de soluções e devem ser monitorados adequadamente. Cuidados necessários devem ser tomados no momento da dissolução do soluto em H 2 O ou em outro solvente, para que o volume final não ultrapasse aquele requerido, de forma a não alterar a concentração final da solução. Aconselha-se dissolver o soluto em pequenos volumes do solvente, em seguida completar um pouco mais, ajustar o ph e só depois ajustar o volume final. Técnicas de Biologia Celular. Oliveira e tal Soluções para eletroforese em gel de agarose TBE 5x Solução Estoque (Tris / ácido bórico / EDTA) Maniatis 3 B23 Para 1 litro 1. Tris base 54g 2. Ácido bórico..27.5g 3. EDTA0,5 M(pH8)..20mL 4. Coloque 400ml de H 2 O bidestilada. 5. Homogeneíze em agitador magnético 6. Complete com H 2 O bidestilada até 1000mL 7. Filtre a vácuo, papel de filtro comum. 8. Armazene em frasco de vidro temperatura ambiente. 40

44 TAE 50x Solução Estoque - Maniatis 3 B23 100ml 50X 500mL 10x 1. Tris base 24,2g...24,4g 2. Ácido acético 5.71ml...5,71g 3. EDTA 0,5M ph8,0 10ml...10mL 4. Filtrar a vácuo, papel de filtro comum. 5. Armazenar em frasco de vidro temperatura ambiente. TAE 1x - Solução de trabalho Para 500ml TAE 50x...usar 10 ml H2O Bid...Completar p/ 500 ml Tampão azul de corrida 6x Maniatis 3 pg B24 nº III 1. 0,25% de bromophenol blue (azul escuro) 2. 0,25% de xylene cyanol (azul claro) 3. 30% de glicerol em água 4. Armazene a 4ºC Usamos apenas o bromophenol blue, mas isso não afeta seu efeito e visualização. Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder - Estoque 1 g/ L DNA1ug/uL...1 L Tp azul 6x...1 L H2O...4 L Estoque a 4ºC ou 20ºC Aplique 6 L no gel 41

45 Manipulação na Sala de Cultura de Células Introdução Trabalhar com cultura de células exige cuidado e atenção redobrada. Um simples procedimento realizado de forma errada pode comprometer todo o experimento. Lave todo material usado na cultura de célula com jato forte de água várias vezes e enxágüe com água destilada. No caso de contaminação use detergente especial para laboratório no material que será autoclavado. Use a pia indicada para tratamento e lavagem do material microbiológico no caso de contaminação. Lave-os imediatamente após o uso para evitar proliferação e contaminação pôr bactérias. * A incubadora de células é de responsabilidade de cada um mesmo tendo alguém designado para limpeza e manutenção do equipamento. Na sala de cultura de células são realizados os seguintes experimentos: Cultivo de células tumorais imortalizadas, Preparo e cultivo de células primárias, Ensaio de Transfecção, Congelamento de células, Filtragem de meio de cultura e reagentes entre outras atividades OBS.: Mantenha a sala limpa e organizada. Não lave o material usado em cultura de células na pia destinada ao material microbiológico. 42

46 Origem das Células Hela Henrietta Lacks: Imortal Henrietta morreu há mais de 55 anos, e apesar disto, existem mais células suas atualmente do que quando ela era viva. Células tumorais extraídas de seu útero são cultivadas até hoje e são responsáveis pela elucidação de muitos mecanismos celulares e outras questões importantes como o desenvolvimento da vacina da pólio. Em fevereiro de 1951, Henrietta Lacks deu entrada no Hospital Johns Hopkins, em Baltimore, EUA, e foi diagnosticada com um tumor cervical. Uma amostra tecido uterino foi enviada ao pesquisador George Gey que estava na época tentando cultivar tecidos humanos em meio sintético, porém sem sucesso. As células de Lacks no entanto cresciam muito bem, num ambiente ideal se duplicam a cada 24hrs. E começaram a ser enviadas a pesquisadores de todo o mundo, recebendo o nome de células HeLa. Se você colher uma amostra de tecido própria, um pedaço da sua pele por exemplo, mantendo num ambiente a 37ºC, com oxigenação controlada e meio nutritivo, suas células vão continuar se dividindo como se ainda estivessem no seu corpo. Porém, elas não passarão da 52ª geração, limite conhecido como limite de Hayflick, devido ao encurtamento dos telômeros, uma espécie de controle celular para impedir que células se dividam sem controle (como o tumor que originou as células HeLa). Acontece que as células HeLa são células chamadas transformadas e são capazes de 43

47 manter-se em divisão constante, o que permite que essas células sejam cultivadas até hoje. Henrietta morreu cerca de 8 meses após seu diagnóstico, em 4 de outubro de 1951, aparentemente seu tumor foi diagnosticado como epitelial típico e tratado com radiação, o que não funcionou (no seu caso, o necessário seria a remoção cirúrgica do tecido). Sua família só ficou sabendo do uso de suas células em 1975, e apesar das diferentes aplicações e inclusive da comercialização de alguns métodos celulares que envolvem o uso de células HeLa, nunca receberam um centavo. Atualmente se sabe que o que provavelmente causou o tumor de Lacks foi uma infecção com HPV, o herpes papiloma vírus, conhecido por estar presente em grande parte dos casos de câncer cervical, e que tem marcadores moleculares que podem ser encontrados nas células HeLa. Hoje em dia existem várias outras linhagens celulares, de diferentes tecidos, transformadas ou não, mas nenhuma é tão estudada e utilizada como a linhagem de Henrietta. Alguns pesquisadores consideram suas células como um organismo à parte, ou mesmo uma outra espécie (devido ao número diferente de cromossomos que elas têm), batizada de Helacyton gartleri. Fontes: SEXO E AS ORIGENS DA MORTE - WILLIAM R. CLARK - ISBN: AS DEZ MAIORES DESCOBERTAS DA MEDICINA - MEYER FRIEDMAN, GERALD WIRILDLAND - ISBN:

48 Origem Células U-937 Organismo: Homo sapiens (Homem) Fonte: Linfoma histocítico Morfologia: Monócito Produtos celulares: Lisozima, beta-2-microglobulina,fator de necrose tumoral(tnf- ) Propriedades de Crescimento: Suspensão Restrições: A linhagem original de células U937 foi estabilizada pelo laboratório do Dr. K. Nilsson s em 1974; e foram feitas algumas requisições: 1) Em todos os trabalhos que reportem o uso desta linhagem celular ou derivados, deve ser citada referência direta à Sundstrom & Nilsson (Int. J. Cancer 17: , 1976); 2) Qualquer uso com finalidade de comercializar deve ser nogociado com Pharmacia Diagnostics AB, S Uppsala, Sweden; 3) Não devem ser feitas distribuição por terceiros; 4) Estas células devem ser usadas com propósitos: não-clínicos, não-comercial, somente para pesquisa. 45

49 Condições de Sobrevivência Meio de cultura: 90% de RPMI, 2mM de L-glutamina, 2 g/l de bicarbonato de sódio, 4,5g/L de glicose, 10mM de HEPES, 1mM de piruvato de sódio, 10% de Soro Fetal Bovino, 10 ml de penicilina (100U/mL) estreptomicina (100μ/mL). RPMI é a abreviação de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contém uma grande quantidade de fosfato e é formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5% de CO2. O meio é sempre suplementado com soro e solução de antibióticos. O meio de cultura deve ser trocado 2 a 3 vezes por semana. Temperatura: 37ºC. Atmosfera: 95% de ar e 5% de CO2 Preservação das células: Congeladas em nitrogênio liquido ou freezer 80ºC Meio para congelar: Meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO. Temperatura de congelamento: fase de vapor do nitrogênio líquido 46

50 Reação da Transfecção No núcleo da célula, via plasmídeo de expressão, a transcrição do RNA é feita e os RNAm são transferidos para o citoplasma e codificados na proteína (gene de interesse do plasmídeo de expressão), que volta para o núcleo da célula e se senta no endereço do elemento responsivo, plasmídeo repórter / gene da luciferase. O ligante (droga) se liga à proteína sintetizada dando-lhe uma conformação diferente, proporcionando a ação juntamente com proteína RXR ou não, e ativar a maquinaria do gene da luciferase. A transcrição RNA é feita no núcleo e os RNAm são transferidos para o citoplasma e traduzido na proteína luciferase que age com a luciferina adicionada e produz luz. A intensidade da luz é medida e correlacinonada ao controle positivo. Experimento programado Plasmídeos - Tratamento 1- CMV _LUC (1μg) - DMSO/ETHO 2- CMV h TRβ1(1μg) e F2 LUC(4μg) - DMSO/ETHO 3- CMV h TRβ1(1μg) e F2 LUC(4μg) T

51 Check list Transfecção UV por 30 minutos: Cuvetas (abertas: descartar ou aspirar o álcool) Placas de 12 poços (abertas: descartar ou aspirar o álcool) Pipetas descartáveis de transferência Tubos falcon 50mL para coletar células e identificado para experimento Pipetas estéreis - Pasteur e sorológica 10mL e 25mL Pipetador automático carregado Pipetas P1000, P10 e P200 Ponteiras 1000μL, 200 μl e 10 μl Béquer vazio para descarte Proveta 250mL com água para descartar a pipetas usadas Álcool 70% Luvas Papel toalha Obs.: Cuvetas e placas de 12 poços: mantê-las abertas durante exposição por 30 min à luz UV. Utilizar placas novas ou esterilizadas com álcool. CHECAR Rascunho da transfecção Plasmídeos aliquotados Ligantes - concentração Meio de cultura aquecido PBS 1x PBS + Ca 2+ + glicose (temperatura ambiente) Tripsina para células aderentes H 2 O autoclavada Pipetadores carregados Rotor da centrífuga Calculadora, lápis e papel para rascunho Câmara de Newbauer 48

52 Transfecção de Células Aderentes Hela Objetivo: Tem como objetivo testar a eficiência da transfecção com o plasmídeo CMV- LUC que é o promotor do gene da Luciferase. E avaliar a resposta da expressão do receptor do hormônio tireoidiano pelo plasmídeo TRβ1 com o ligante T3 o controle positivo. A fim de avaliar o controle e prosseguir com os experimentos. Procedimento: 1. Verifique no microscópio se células estão bem nutridas e se estão livre de contaminações. O meio deve ser trocado com no máximo 48 horas antes da transfecção. Se ultrapassar às 48 horas, retire o excesso do meio de cultura. 2.. Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas. 3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfecção e aliquote os plasmídeos (na bancada) na concentração desejada para cada experimento. Deve-se colocar uma gota em cada lateral do tubo. 4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de vácuo. Adicione 10ml de solução PBS na placa 150X15. Homogeneíze cuidadosamente em movimentos circulares e aspire à solução. 5. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneíze cuidadosamente em movimentos circulares. 6. Coloque na incubadora de CO2 a 37ºC por 1 minuto, até as células soltarem da placa. Observe ao microscópio (às vezes é necessário deixar uns 5 minutos) 7. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM com 10% de SFB na placa para bloquear a Tripsina. (quem faz o bloqueio é o soro) 8. Antes de aspirar às células, lave toda superfície da placa (incline placa e pipeta para que sua mão não fique por cima da placa, se possível não abra toda a placa). 9. Transfira para 2 falcons de 50ml, retire 10uLe coloque na câmara de newbauer para a contagem. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 2000 rpm. 10. Coloque o meio de cultura novo na placa. Use outra pipeta. Coloque a placa na incubadora de CO2 a 37ºC. 11. Coloque em tubo falcon de 50mL, 12mL de meio de cultura DMEM para cada cuveta eletroporada Reserve. Adicione um pouco mais para que não falte ao finalizar a 49

53 distribuição. Descarte o meio das células centrifugadas (vertendo sobre o béquer de descarte ou aspirando com a pipeta pasteur. 12. Ressuspenda as células inicialmente com metade do volume desejado para a transfecção. Faça a contagem das células usando a câmara de mewbauer. 13. Após a contagem faça a diluição _ 5 milhões de células em 500μL de PBS + Ca2+ + glicose para cada cuveta. 14. EX.: Se for (para 4 cuvetas). Ressuspenda em 2,200mL final (coloque 200μL a mais para que não falte ao finalizar a distribuição). 15. Transfira 500μL do pool de células ressuspendidas ( Hela - 5 milhões de células por cuveta,, não deve usar menos que 3 milhões), para os eppendorfs com os plasmídeos, homogeneíze com a própria pipeta e transfira para a cuveta. 16. Condições de eletroporação células aderentes - Hela 17. Voltagem Kv ( kilovolts) Capacitância 0,950μF (microfire) (para HeLa) 18. Pressione os 2 botões ao mesmo tempo até apitar. 19. Transfira as células eletroporadas com pipeta de transferência ou P1000 para o tubo contendo meio DMEM(item 10). Homogeneíze bem, ao transferir. Junte as células eletroporadas com os mesmos parâmetros, para que tenha um pool de células transfectadas mais homogêneo. 20. Distribua 1mL em cada poçinho da placa de 12 poços. Homogeneíze bem a cada retirada para ter o mesmo número de células em cada poço. 21. Pipete sempre na posição inclinada, no tubo e placa para evitar contaminações Tratamento: Usando uma p10 bem calibrada coloque 1μL do veículo na lateral interna dos três primeiros poços. Puxe a pipeta com cuidado ainda pressionando o dedo, tenha certeza de que não aspirou de volta o reagente pipetado. 22. Proceda com o tratamento nos demais poços de acordo com o experimento. 23. De leves tapinhas na lateral da placa e faça gentilmente alguns movimentos circulares para homogeneizar bem. Cuidado para o meio de cultura não encostar-se à tampa proporcionando contaminações. 24. Incube com 5% de CO2 a 37ºC por 20 a 24 horas 25. Faça a leitura veja protocolo de leitura de células aderentes. 50

54 Contagem das Células na Câmara de Newbauer Colete as células, ressuspenda na metade do volume desejado e faça a diluição. Use 10μL de células ressuspendidas e 990μL de PBS + cácio + glicose. Cubra a Câmara de Newbauer com uma lamínula e coloque 10μL da diluição 1:100 em cada retículo. Ao microscópio focalize a câmara em uma objetiva menor, passe para uma objetiva maior e centralize cada um dos 4 quadrantes externos e conte-os. Tire uma média dos 4 quadrantes contados. Se preferir pode contar o outro retículo para comparar. Quadrante externo Fórmula Número de células contadas x diluição x 10 4 (constante) = nº de células /ml 25x100x10000 = células/ml Cálculo para encontrar 5 milhões para cada cuveta 500uL (cél. Hela aderentes) C1 V1 = C2 V V1 = μL V1 = 100μL das células ressuspendidas e 400μL de PBS + cálcio + glicose por cuveta. As células também podem ser contadas sem diluição, antes de centrifugar coloque 10μL da cultura de células na câmara de Newbauer. Multiplique o número de células contadas por e por o volume centrifugado. Fórmula 38x10.000x 80mL = Ressuspender: Se quero em 0,5mL Se tenho quantos preciso resuspender...x= 3mL de PBS Que da para 6 cuvetas 51