MANUAL DE PRÁTICAS EM BIOLOGIA DO SOLO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE SOLOS E ENGENHARIA AGRICOLA MANUAL DE PRÁTICAS EM BIOLOGIA DO SOLO Autores Prof. Dr. Jair Alves Dionísio Eng a. Agr a. Diana Signor CURITIBA, 2007

2 Aulas Práticas Aviso geral. 1. É obrigatório o uso de guarda-pó. 2. Não é permitido o uso de bermuda.

3 INOCULAÇÃO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS MATERIAL E MÉTODOS 1) Inoculação Simples Inocular 50 kg de sementes (área de cultivo tradicional), utilizando-se a solução de sacarose 20% como aditivo (Apêndice 15). Estabelecer as proporções para 1 kg de semente. a) Misturar separadamente a solução de sacarose (20%) ao inoculante; b) Adicionar esta pasta às sementes misturando bem até que apresentem uma camada de revestimento uniforme do inoculante, envolvendo-as; c) Espalhar as sementes e deixá-las secando em local sombreado, fresco e arejado; d) Semear imediatamente. 2) Peletização a) Pesar 100 g de sementes de trevo. b) Pesar 2 g de inoculante e 50 g de calcário. c) Medir em béquer 10 ml de goma caseira a 7% (Apêndice 7). d) Misturar a goma com o inoculante, de forma que se obtenha uma mistura homogênea. e) Adicionar as sementes e fazer uma pré-mistura. f) Colocar o calcário e misturar bem para que as sementes fiquem completamente recobertas. Obs.: Se forem utilizados micronutrientes ou rocha fosfatada, usar somente 25 g de calcário, ou seja, observar a proporção 1:1. 3) Material Necessário. a) Sementes de soja e trevo. b) Inoculantes: soja e trevo

4 c) Soluções: goma caseira 7%, sacarose a 20%. d) Outros: bandejas, saco plástico, calcário, espátula. RESULTADOS Relatar as dificuldades obtidas durante o processo, bem como as vantagens do mesmo para o produtor no momento da implantação da cultura no solo. ANEXO A seguir são apresentadas as quantidades de materiais a serem usadas em função do tamanho das sementes a serem peletizadas, conforme (Faria et al. 1984) citado por (De- Polli,1985, p. 9.). Material usado na inoculação e revestimento das sementes Leguminosas Goma arábica 40% ou goma caseira 7% (ml) Inoculante (g) Semente (kg) Calcário ou calcário + micronutrientes (1:1) (kg) Sementes grandes: soja, feijão, caupi, amendoim, guandu, leucena, ervilha, fava, etc. Sementes médias: calopogônio, soja perene, siratro, centrosema, etc. Sementes pequenas: estilosantes, desmodium, lotononis, etc

5 ISOLAMENTO DE RIZÓBIO DAS RAÍZES DE LEGUMINOSAS OBJETIVOS Avaliar os aspectos morfológicos externos e internos dos nódulos e realizar o isolamento dos rizóbios em meio de cultura específico. MATERIAL E MÉTODOS 1) Procedimentos a) Determinar a planta com a qual será realizado o trabalho; b) Demarcar um círculo ao redor da planta, correspondente à área do sistema radicular; c) Para leguminosas herbáceas, como soja, feijão e guandu, recomenda-se um círculo com cerca de 15 cm; d) Para arbóreas, são necessários dois círculos: um próximo à raiz principal e outro mais distante que se aproxime das raízes secundárias; e) Cavar a uma profundidade de 30 cm para plantas herbáceas e a uma profundidade maior para as arbóreas; f) Remover a terra cuidadosamente para não danificar o sistema radicular; g) Retirar o excesso de solo com as mãos sobre uma peneira, cuidando para que os nódulos não se percam; h) Colocar as plantas ou raízes em sacos plásticos; i) Levar o material ao laboratório e lavar com cuidado as raízes para que os nódulos não se percam; j) Secar as raízes com papel toalha e retirar os nódulos, deixando-se 0,5 cm de raiz para facilitar a manipulação do nódulo e diminuir as chances de danificá-lo durante o isolamento;

6 k) Os nódulos dessecados devem ser reidratados, ficando de molho em frascos com água; l) Imergir os nódulos de 5 a 10 segundos em álcool 90-95% a fim de quebrar a tensão superficial e remover bolhas de ar no tecido; m) Transferir os nódulos para uma solução a 3% ou 5% de hipoclorito de sódio ou cálcio (Apêndice 14); n) Lavar os nódulos pelo menos cinco vezes em água destilada e esterilizada; o) Toda a manipulação deve ser feita em câmara asséptica; p) Após a última lavagem, amassar os nódulos com fórceps ou bastão de vidro, aproveitando a água da última lavagem; q) Riscar o material em placas de Petri contendo meio de extrato de levedura-manitolágar (Apêndice 8); r) Incubar a 25 C a 30 C ou na temperatura ideal para a leguminosa da qual o nódulo foi coletado; s) Verificar diariamente o crescimento do rizóbio; t) Realizar Teste de Gram para as colônias bacterianas observadas (Apêndice 15). 2) Material Necessário a) Vidraria: placas de Petri, bastão de vidro. b) Equipamentos: Microscópio; estufa de incubação, capela de fluxo laminar, autoclave. c) Soluções: Meio de extrato de levedura-manitol, azul de bromotimol (Apêndice 14), vermelho Congo (Apêndice 14), hipoclorito de sódio ou cálcio 3 a 5% (Apêndice 14), safranina (Apêndice 12), cristal violeta (Apêndice 14). d) Outros: nódulos, pinça, peneira, pá, saco plástico, papel toalha. RESULTADOS Avaliar o crescimento bacteriano nas placas de Petri e analisar os resultados do Teste de Gram e realizar o Teste de solubilidade em KOH.

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8 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE SOLOS E ENGENHARIA AGRICOLA MANUAL DE PRÁTICAS EM BIOLOGIA DO SOLO Autores Prof. Dr. Jair Alves Dionísio Eng a. Agr a. Diana Signor CURITIBA, 2007

9 Aulas Práticas Aviso geral. 1. É obrigatório o uso de guarda-pó. 2. Não é permitido o uso de bermuda.

10 INOCULAÇÃO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS MATERIAL E MÉTODOS 1) Inoculação Simples Inocular 50 kg de sementes (área de cultivo tradicional), utilizando-se a solução de sacarose 20% como aditivo (Apêndice 15). Estabelecer as proporções para 1 kg de semente. a) Misturar separadamente a solução de sacarose (20%) ao inoculante; b) Adicionar esta pasta às sementes misturando bem até que apresentem uma camada de revestimento uniforme do inoculante, envolvendo-as; c) Espalhar as sementes e deixá-las secando em local sombreado, fresco e arejado; d) Semear imediatamente. 2) Peletização a) Pesar 100 g de sementes de trevo. b) Pesar 2 g de inoculante e 50 g de calcário. c) Medir em béquer 10 ml de goma caseira a 7% (Apêndice 7). d) Misturar a goma com o inoculante, de forma que se obtenha uma mistura homogênea. e) Adicionar as sementes e fazer uma pré-mistura. f) Colocar o calcário e misturar bem para que as sementes fiquem completamente recobertas. Obs.: Se forem utilizados micronutrientes ou rocha fosfatada, usar somente 25 g de calcário, ou seja, observar a proporção 1:1. 3) Material Necessário. a) Sementes de soja e trevo. b) Inoculantes: soja e trevo

11 c) Soluções: goma caseira 7%, sacarose a 20%. d) Outros: bandejas, saco plástico, calcário, espátula. RESULTADOS Relatar as dificuldades obtidas durante o processo, bem como as vantagens do mesmo para o produtor no momento da implantação da cultura no solo. ANEXO A seguir são apresentadas as quantidades de materiais a serem usadas em função do tamanho das sementes a serem peletizadas, conforme (Faria et al. 1984) citado por (De- Polli,1985, p. 9.). Material usado na inoculação e revestimento das sementes Leguminosas Goma arábica 40% ou goma caseira 7% (ml) Inoculante (g) Semente (kg) Calcário ou calcário + micronutrientes (1:1) (kg) Sementes grandes: soja, feijão, caupi, amendoim, guandu, leucena, ervilha, fava, etc. Sementes médias: calopogônio, soja perene, siratro, centrosema, etc. Sementes pequenas: estilosantes, desmodium, lotononis, etc

12 ISOLAMENTO DE RIZÓBIO DAS RAÍZES DE LEGUMINOSAS OBJETIVOS Avaliar os aspectos morfológicos externos e internos dos nódulos e realizar o isolamento dos rizóbios em meio de cultura específico. MATERIAL E MÉTODOS 1) Procedimentos a) Determinar a planta com a qual será realizado o trabalho; b) Demarcar um círculo ao redor da planta, correspondente à área do sistema radicular; c) Para leguminosas herbáceas, como soja, feijão e guandu, recomenda-se um círculo com cerca de 15 cm; d) Para arbóreas, são necessários dois círculos: um próximo à raiz principal e outro mais distante que se aproxime das raízes secundárias; e) Cavar a uma profundidade de 30 cm para plantas herbáceas e a uma profundidade maior para as arbóreas; f) Remover a terra cuidadosamente para não danificar o sistema radicular; g) Retirar o excesso de solo com as mãos sobre uma peneira, cuidando para que os nódulos não se percam; h) Colocar as plantas ou raízes em sacos plásticos; i) Levar o material ao laboratório e lavar com cuidado as raízes para que os nódulos não se percam; j) Secar as raízes com papel toalha e retirar os nódulos, deixando-se 0,5 cm de raiz para facilitar a manipulação do nódulo e diminuir as chances de danificá-lo durante o isolamento;

13 k) Os nódulos dessecados devem ser reidratados, ficando de molho em frascos com água; l) Imergir os nódulos de 5 a 10 segundos em álcool 90-95% a fim de quebrar a tensão superficial e remover bolhas de ar no tecido; m) Transferir os nódulos para uma solução a 3% ou 5% de hipoclorito de sódio ou cálcio (Apêndice 14); n) Lavar os nódulos pelo menos cinco vezes em água destilada e esterilizada; o) Toda a manipulação deve ser feita em câmara asséptica; p) Após a última lavagem, amassar os nódulos com fórceps ou bastão de vidro, aproveitando a água da última lavagem; q) Riscar o material em placas de Petri contendo meio de extrato de levedura-manitolágar (Apêndice 8); r) Incubar a 25 C a 30 C ou na temperatura ideal para a leguminosa da qual o nódulo foi coletado; s) Verificar diariamente o crescimento do rizóbio; t) Realizar Teste de Gram para as colônias bacterianas observadas (Apêndice 15). 2) Material Necessário a) Vidraria: placas de Petri, bastão de vidro. b) Equipamentos: Microscópio; estufa de incubação, capela de fluxo laminar, autoclave. c) Soluções: Meio de extrato de levedura-manitol, azul de bromotimol (Apêndice 14), vermelho Congo (Apêndice 14), hipoclorito de sódio ou cálcio 3 a 5% (Apêndice 14), safranina (Apêndice 12), cristal violeta (Apêndice 14). d) Outros: nódulos, pinça, peneira, pá, saco plástico, papel toalha. RESULTADOS Avaliar o crescimento bacteriano nas placas de Petri e analisar os resultados do Teste de Gram e realizar o Teste de solubilidade em KOH.