GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO C.R. LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS SETOR DE BIOQUÍMICA

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1 POP n.º: B111 Página 1 de 8 1. Sinonímina: Eletroforese de Hemoglobina em ph ácido. 2. Aplicabilidade: Bioquímicos do setor de Bioquímica do LAC-HNSC. 3. Aplicação Clínica: A eletroforese de hemoglobina em ph ácido é usada para confirmação ou diferenciação de algumas frações de hemoglobinas encontradas na eletroforese de ph alcalino, em particular para diferenciar a hemoglobina S da D e a E da C. Por esta técnica as hemoglobinas S e C separam-se da HbA, enquanto as hemoglobinas D e E migram na mesma posição da hemoglobina A. 4. Princípio do teste: Eletroforese em gel de agarose em ph 6,0. As hemoglobinas são separadas em meio ácido, fixadas em meio alcoólico/ácido e coradas com uma solução de negro de amido. O excesso de corante é eliminado com uma solução ácida e o gel está pronto para a interpretação qualitativa. 5. Amostra: 5.1 Preparo do paciente: Sem restrições. Vide POP-L4 Coleta. 5.2 Tipo de amostra: Sangue total colhido com EDTA, citrato ou heparina. 5.3 Colheita: Quantidade mínima de sangue: 1 ml. Quantidade ideal: 2 ml. 5.4 Preservação e transporte: Transportar o material colhido a temperatura ambiente e dentro das normas de segurança legais. Amostras não processadas no dia devem ser guardadas na geladeira, em estante própria, para processamento na próxima rotina. 5.5 Identificação da amostra: Etiqueta com código de barras gerado pelo sistema de gerenciamento de dados do LAC (Sistema Pleres). A etiqueta deve ser posicionada nos frascos de colheita a partir da tampa

2 POP n.º: B111 Página 2 de 8 para o fundo em linha reta de forma que o código de barras fique visível e alinhado, sem enrugamentos. As amostras de doadores do banco de sangue recebem etiquetas com código de barras próprias do sistema do banco de sangue. 5.6 Estabilidade e armazenamento: A estabilidade da amostra (sangue total) é de 5 dias se refrigerada entre 2 a 8ºC. Para conservação prolongada (até 3 meses), congelar as amostras a 70ºC após a lavagem das hemácias da seguinte forma: centrifugar o sangue total durante 5 minutos a 5000 rpm, eliminar o plasma, lavar as hemácias duas vezes com dez volumes de soro fisiológico (centrifugar após cada lavagem) e eliminar o excesso de soro fisiológico à superfície do sedimento de hemácias lavadas. Agitar no vórtex antes de congelar. 5.7 Amostras inadequadas: Amostras com anticoagulantes diferentes dos preconizados. Amostras mal identifcadas. Amostras hemolisadas. Amostras antigas (mais de 5 dias). Amostras com volume insuficiente. 6. Reagentes e materiais: Reagentes fornecidos no Kit Hydragel Acid Hemoglobine SEBIA: Gel de agarose (pronto para uso), 10 unidades Tampão citrato (solução concentrada) 3 frascos de 100ml Diluente da solução corante (solução concentrada) 1 frasco de 60 ml Corante negro de amido (solução concentrada) 1 frasco de 20 ml Solução descorante (solução concentrada) 1 frasco de 100 ml Solução hemolisante (pronta par uso) 1 frasco de 20 ml Aplicadores de 7 dentes (prontos para uso) 1 caixa de 10 Papéis de filtro finos 1 pacote de 10 Gel de agarose: meio suporte para eletroforese, pronto para uso. Cada gel é embalado em envelope individual. Deve ser armazenado à temperatura ambiente (15-30ºC) ou em geladeira (2-8ºC). Estável até o fim da validade indicada na caixa do kit e no rótulo da embalagem do gel. Não congelar. Desprezar o gel quando: - houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo for muito macia (isto acontece se o gel for congelado); - houver desenvolvimento de bactérias ou fungos; - estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições inadequadas de armazenamento). Tampão Citrato: tampão para eletroforese. Cada frasco da solução concentrada deve ser diluído até 1 litro com água purificada. Após a diluição, a solução contém ácido cítrico ph

3 POP n.º: B111 Página 3 de 8 6,0 ± 0,2. Armazenar a solução concentrada à temperatura ambiente ou refrigerada. Estável por vários anos, pelo menos até o fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo dos frascos. A solução tampão diluída é estável por 1 ano, à temperatura ambiente, num frasco fechado. Desprezar se seu aspecto se alterar ou se ficar turva devido a contaminação microbiana. Diluente da solução corante: usado na preparação da solução de corante negro de amido. Armazenar à temperatura ambiente ou refrigerado. É estável até o fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. Não congelar. Corante negro de amido: para coloração do gel após a eletroforese. O corante negro de amido concentrado é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afeta em nada a qualidade da solução final. Para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento a seguir: -Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado. - Fechar cuidadosamente o frasco. - Agitar vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos. -Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração. -Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração. - Completar o volume para 300 ml com purificada. - Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos. A solução corante está pronta para uso. Importante: a solução de corante é destinada à coloração de 10 géis. Recomenda-se a renovação após as 10 utilizações. Armazenar a solução de corante concentrada e a diluída à temperatura ambiente ou no refrigerador em frascos bem fechados para evitar a evaporação. A solução concentrada é estável até o fim da validade indicada no kit ou no rótulo do frasco. A solução diluída é estável por 1 mês. A estabilidade pode ser prolongada até 3 meses se mantida refrigerada. Solução descorante: usada na remoção do excesso de corante e da coloração de fundo do gel. Cada frasco de solução descorante concentrada deve ser diluído a 1/1000 com água purificada e permite obter 100 litros de solução total. É conveniente diluir apenas 1 ml da solução concentrada de cada vez, para um volume final de 1 litro. Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no refrigerador. É estável até o fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco da solução descorante. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente, quando conservada em recipiente fechado. Desprezar a solução diluída se houver alterações no seu aspecto, por exemplo, se ficar turva devido a contaminação microbiana. Solução hemolisante: usada para hemolisar as hemácias. Pronta para uso. Armazenar a temperatura ambiente ou no refrigerador. É estável até o fim da validade indicada na caixa do kit ou na etiqueta do frasco da solução hemolisante. Desprezar a solução hemolisante se o seu aspecto se alterar, isto é, se ficar turva devido à contaminação microbiana.

4 POP n.º: B111 Página 4 de 8 Aplicadores: aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras. Armazenar em local seco à temperatura ambiente ou no refrigerador. Papel de filtro fino: papel de filtro absorvente, de utilização única, para absorver o excesso de líquido da superfície do gel antes da aplicação das amostras. Armazenar em local seco a temperatura ambiente ou no refrigerador. Reagentes necessários, mas não fornecidos no kit SEBIA: Soro fisiológico: solução de NaCl 9g/l. Para lavagem das hemácias. Armazenar a temperatura ambiente. Estável até o fim da validade indicada no rótulo do frasco. Solução fixadora: para fixação das proteínas separadas por eletroforese em gel de agarose. Pelo menos 15 minutos antes da utilização, preparar o fixador (v/v): 60% etanol; 10% ácido acético; 30% água purificada. Misturar bem. Armazenar a temperatura ambiente em frasco bem fechado para evitar evaporação. Estável por 3 meses. Não fixar mais que 4 géis em cada 150 ml de fixador. Pool de papa de hemácias para controle de qualidade: pool de hemácias, contendo as hemoglobinas A, F, S e C, usado a cada corrida da eletroforese para controle da migração. O pool de papa de hemácias é preparado a partir de amostras de sangue de pacientes e/ou do banco de sangue, da seguinte maneira: Selecionar amostras de papa de hemácias, migradas na eletroforese de Hb por capilaridade, contendo hemoglobinas A, S, C e F e uma amostra de sangue total de recém nascido (HbF). Se for possível, solicitar ao Banco de Sangue um volume adicional da amostra com HbC e HbS. Centrifugar o sangue total por 5 minutos a 5000 rpm, eliminar o plasma. Misturar as papas de hemácias selecionadas, agitar em vórtex. Lavar 2 vezes com solução fisiológica (centrifugar após cada lavagem). Separar em alíquotas de 350 µl. Etiquetar, colocando nome (Pool Hb) e data de preparo. Correr uma amostra do pool na eletroforese por capilaridade ph alcalino SEBIA para avaliar a qualidade do pool. Se todas as frações (A,S,C e F) estiverem presentes, o pool é considerado adequado para o uso e pode ser congelado. Congelar a 70 C. Estável por 3 meses. Controle Lyphochek HbA2 Bio-Rad Nível 2: este controle, contendo hemoglobinas A, S, A2 e F, será usado no controle de qualidade da eletroforese em ph ácido somente na falta do pool de papa de hemácias. Preparo e estabilidade, ver POP n Eletroforese de Hb Automação Capillarys-SEBIA. 7. Equipamentos: - Aplicador Hydragel SEBIA que contém o suporte-aplicador Hydragel - Pipetas 10 µl e 200 µl - Câmara de eletroforese Paragon System (Beckman)

5 POP n.º: B111 Página 5 de 8 - Fonte de alimentação de voltagem Paragon System (Beckman) - Secador (Dryer) Paragon System (Beckman) - Suportes e cubas para tratamento do gel. 8. Calibração: NA. 9. Procedimento: 9.1 Preparação das amostras: Centrifugar o sangue total a 5000 rpm durante 5 minutos.desprezar o plasma. Lavar as hemácias 2 vezes com 10 volumes de solução fisiológica. Hemolisar 10 µl da papa de hemácias com 130 µl da solução hemolisante. Agitar no vórtex por 10 segundos e deixar em repouso por 5 minutos. pool de papa de hemácias e o Controle Lyphochek HbA2 Bio-Rad Nível 2, quando usado, devem ser tratados como as amostras ( 10µl de pool µl do hemolisante). 9.2 Migração: Colocar o suporte-aplicador Hydragel sobre a bancada e erguer a parte móvel do mesmo. Colocar 120 µl de água deionizada no terço inferior do quadro impresso no suporteaplicador. Retirar o gel de agarose da embalagem. Colocar um papel de filtro fino de maneira rápida e uniforme sobre a superfície do gel para eliminar o excesso de líquido da superfície do gel. Retirar o papel de filtro imediatamente. Atenção: Não deixar o papel de filtro em contato prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação. Colocar o gel (com o lado da agarose para cima) com sua borda inferior contra a parte inferior do quadro impresso no suporte-aplicador. Baixá-lo lentamente até o contato com a gota de água. A gota deve espalhar-se por toda a largura do gel. Ajustar gel de modo a eliminar as bolhas de ar que tenham se formado e deixá-lo alinhado com o quadro impresso no suporte-aplicador. Baixar o suporte dos aplicadores até a posição intermediária, com o botão, situado lateralmente, voltado para cima. Colocar um aplicador numa superfície plana, com os números dos poços voltados para cima. Aplicar 10 ul de amostra hemolisada em cada poço. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar os 2 minutos.o aplicador deve ser usado logo após a colocação das amostras. Quebrar e retirar a proteção dos dentes do aplicador. Colocar o aplicador na posição 9 do suporte-aplicador.

6 POP n.º: B111 Página 6 de 8 Importante: Os números impressos no aplicador devem ficar virados para o operador. Baixar o suporte do aplicador rodando o botão lateral de modo que o aplicador fique em contato com gel. Não forçar a descida do suporte dos aplicadores. Deixar o aplicador em contato com o gel por 1 minuto. Após 1 minuto de aplicação, rodar o botão lateral para levantar o aplicador. Retirar o aplicador e descartá-lo. Colocar 45 ml de tampão citrato ph 6,0 em cada lado da câmara de eletroforese. Colocar o gel no suporte de migração de acordo com a polaridade indicada no gel. Encaixar o suporte com o gel na câmara de eletroforese contendo o tampão citrato; o gel deve mergulhar cerca de 1 cm de cada lado da câmara. Conectar a câmara de eletroforese à fonte de alimentação de voltagem Paragon System (Beckman).Ajustar a voltagem em 50 volts. No relógio A do Paragon System, ajustar o tempo de migração em 35 minutos, girando o botão do relógio. Apertar a tecla start para iniciar a migração. Ao final dos 35 minutos, o sistema desligase automaticamente e um sinal sonoro (bip) avisa o término da migração. 9.3 Fixação: Colocar o gel no porta-gel e respectivo suporte. Mergulhar o gel verticalmente no fixador por 5 minutos.retirar o gel e secá-lo sob ar quente. Para secar, colocar o gel no Secador (Dryer) Paragon System. Ajustar o tempo do relógio B do Paragon System em 10 minutos e apertar tecla start para ligar o secador. Ao final do tempo marcado, o sistema desliga-se automaticamente e um sinal sonoro (bip) a visa o término da secagem. 9.4 Coloração Descolaração: Após a secagem, submergir o gel na solução corante durante 5 minutos. Descorar em 3 banhos sucessivos de solução descorante até a obtenção de um fundo totalmente claro. Secar o gel sob ar quente.usar o Secador (Dryer) Paragon System conforme o descrito no ítem 9.3. Se necessário, limpar a parte de trás do gel com um papel umedecido. 10 Controle de Qualidade: 10.1 Interno: Pool de papa de hemácias, contendo hemoglobinas A, S, C e F. Na falta do pool de hemácias preparado no Laboratório, utilizar o controle comercial Lyphochek HbA2 Bio-Rad Nível Externo: NA. 11 Resultados: 11.1 Unidades: NA 11.2 Cálculos:

7 POP n.º: B111 Página 7 de 8 NA Interpretação: Por meio de observação visual, é feita a análise qualitativa do perfil eletroforético de cada amostra. O controle serve como meio de comparação na interpretação das bandas presentes no gel. Obtém-se, do ânodo para o cátodo, a seguinte migração das hemoglobinas: hemoglobina C migra para trás do ponto de aplicação; hemoglobina S permanece no ponto de aplicação; hemoglobinas D, E e A 0 migram em conjunto (mesma posição); hemoglobinas F e A 1 migram em conjunto (mesma posição); uma banda fraca detectada entre A 0 e A 1 pode corresponder a uma fração de hemoglobina desnaturada ( amostra envelhecida). Perfis eletroforéticos + + C Migração das S Principais hemoglobinas A ponto A(A 0 +A 2 )+ ponto hemoglobinas normais de aplicação D+E de aplicação A 1 -- A 1 -- _ A 0: fração não glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. A 1: fração glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. anormais 12.Valores de referência: NA 13.Valores críticos: NA 14. Linearidade: NA 15. Limitações do método: Não usar amostras hemolisadas.

8 POP n.º: B111 Página 8 de 8 Quando uma hemoglobina anormal é detectada, deve-se utilizar outros meios de identificação (ex: eletroforese de cadeias de globinas), ou consultar laboratório especializado. 16. Interpretação dos resultados: A alta resolução da eletroforese por capilaridade em ph alcalino permite a separação da hemoglobina S da D e a E da C. A eletroforese em gel de agarose em ph ácido é utilizada quando há alguma dúvida na identificação de frações na eletroforese por capilaridade devido a um pequeno deslocamento na zona de migração, ficando a fração da hemoglobina numa posição intermediária entre S e D, e, após, a amostra ter teste de afoiçamento negativo. Após a migração em meio ácido, os perfis possíveis são: Amostras com HbS, observa-se uma fração no ponto de aplicação. Amostras com Hb D, observa-se uma fração que migra na posição correspondente a da HbA. Amostras com HbAS, observa-se duas frações, a HbS que permanece no ponto de aplicação e a HbA. Amostras com HbAD, observa-se apenas uma fração, pois as duas hemoglobinas migram na mesma posição. Caso seja necessário, confirmar a presença de hemglobina E ou C, observar os seguintes perfis eletroforéticos: Amostras com HbC, observa-se uma fração que migra atrás do ponto de aplicação. Nas amostras com HbE, observa-se observa-se uma fração que migra na posição correspondente a da HbA. Amostras com HbAC, observa-se duas frações, a HbC que migra para trás do ponto de aplicação e a HbA. Amostras com HbAE, observa-se apenas uma fração, pois as duas hemoglobinas migram na mesma posição. 17. Biossegurança: Usar equipamento de proteção individual (luvas, óculos, etc). Fazer a descontaminação de bancadas e equipamentos conforme as normas de segurança do laboratório. Descartar resíduos de acordo com as Boas Práticas de Laboratório e com as normas federais, estaduais e locais.vide Manual de biossegurança. 18. Anexos: Planilha de Controle de Qualidade de Eletroforese de Hb em ph ácido. 19. Bibliografia: Bula do kit Hydragel Hemoglobina Ácida - SEBIA.

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