USO DE RMN NO ESTADO ESTACIONÁRIO PARA AUMENTO DE SENSIBILIDADE DE ANÁLISES QUÍMICAS.

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1 ISSN Empresa Brasileira de Pesquisa Agrpecuária Centr Nacinal de Pesquisa e Desenvlviment de Instrumentaçã Agrpecuária Ministéri da Agricultura e d Abasteciment Rua XV de Nvembr, 45 - Caixa Pstal 74 - CEP Sã Carls - SP Telefne: (6) Fax: (6) pstmaster@cnpdia.embrapa.br COMUNICADO TÉCNICO N 37, set/000, p.-5 USO DE RMN NO ESTADO ESTACIONÁRIO PARA AUMENTO DE SENSIBILIDADE DE ANÁLISES QUÍMICAS. Rdrig B. V. Azered Luiz Albert Clnag Mari Engelsberg,,3 4 A espectrscpia de Ressnância Magnética Nuclear (RMN) é uma das mais imprtantes técnicas analíticas, cm imprtantes aplicações em agricultura cm na medida d ter de óle e umidade em sementes e grãs, umidade em madeira, rações, aliments, determinaçã das estruturas ds defensivs agríclas entre muitas utras aplicações. As aplicações de RMN mais cnhecidas envlvem principalmente espectrômetrs de alt camp que sã muit sensíveis e usam principalmente as diferenças de deslcaments químics nas análises. Uma categria de espectrômetrs de RMN que é mens difundida, mas que está send gradualmente inserida ns labratóris de pesquisa, desenvlviment e cntrle de qualidade sã s equipaments de baixa resluçã em baix camp. Esses espectrômetrs nã se beneficiam d deslcament químic devid a baix camp e baixa hmgeneidade d ímã e pr iss suas aplicações se restringem a medidas de cmpnentes ttais u de cmpnente parciais em amstras hetergêneas. Devid a baix camp esses espectrômetrs também sã de baixa sensibilidade e sã utilizads na análise de substâncias químicas cm isótps de alta 9 abundância natural e grande cnstante magnetgírica, tais cm H e F. Mesm cm esses isótps a amstra tem que ser grande (até 50 ml), para que a razã sinal ruíd seja suficiente para bservar sinal em curt espaç de temp. As principais vantagens da RMN de baixa resluçã sbre s métds cnvencinais de análise sã: rapidez da análise, quase sempre sem necessidade de us de prduts químics u de preparaçã da amstra, mantém a integridade da amstra, fácil execuçã, pssibilidade de realizar análises em tecids in viv e s resultads da análise pdem ser cletads, prcessads e armazenads diretamente em micrcmputadr. ¹Institut de Química de Sã Carls-USP ²Departament de Química-UFF ³Embrapa Instrumentaçã Agrpecuária, Cx Pstal 74, CEP , Sã Carls-SP 4 Departament de Física, UFPe

2 CT/37, CNPDIA, set/000, p. Apesar ds aspects psitivs, a baixa sensibilidade da espectrscpia de RMN em baix camp, mesm restrita a análise de isótps de grande abundância natural, ainda é uma barreira que pde, em alguns cass, impssibilitar sua utilizaçã. Assim para ampliar seu us é necessári melhrar a razã sinal ruíd, sem alngar muit temp de análise. Uma metdlgia prpsta neste trabalh é us da RMN pulsada n estad estacinári (EE), trabalhand cm temp de repetiçã (Tr) bem abaix d temp de relaxaçã transversal (T ), que permite smar milhares de espectr pr segund. Cm iss a razã sinal ruíd (S/R) melhrada cm a raiz quadrada d númer de espectrs (n) adicinads ( S/R= n/). Outra vantagem é que a RMN n estad estacinári pde ser facilmente aplicada em qualquer espectrômetr de RMN de baixa resluçã e cm um ganh de sensibilidade de até 50 vezes (Azered et al, 000) quand cmparada cm s métds cnvencinais cnhecids cm FID (free inductin decay) e/u ec ( Clnag et al, 996). As análises fram feitas em um espectrômetr basead em um ímã de NiFeB, cm gap de 0 mm, e um camp de 0,39 Tesla, equivalente a frequência de 4,400 MHz para H. O prbe fi cntruíd cm ma bbina única cm 0 mm de diâmetr e 0 mm de altura. O íma apresentu um T * de 0,5 ms. A parte eletrônica fi baseada n NMR Kit II, Tecmag, usand um sintetizadr de frequencia PTS 500, amplificadr de ptência 305 AMT, um preamplificadr Miteq AU054. Usu-se uma largura de pulss de 90 graus de 9 usec. Os dads fram digitalizads em um scilscópi digital HP 5450A. Na figura estã s sinais de RMN de amstra de óle vegetal cm a variaçã d Tr de 500 a 0,3ms. A SSFP Amplitude (au) B C D E F t (msec) Figura - espectrs de H de óle vegetal btids para cada variaçã n espaçament de um trem de pulss de 90 : a) 5 s. b) s. c) 0, s. d) 0,05 s. e) 0,005 s. f) 0,3 ms. Parâmetrs espectrais: pulss de 90 de 0?s, 3 médias.

3 CT/37, CNPDIA, set/000, p.3 Cm Tr= 500ms (espectr A ) a intensidade d FID é máxima uma vez que é igual a 5T, nde temp T (temp de relaxaçã lngitudinal) é de 0, s. Para Tr=08ms (espectr B) nta-se uma ligeira saturaçã d sinal d FID. Reduzind-se Tr para 9ms (espectr C) reduz-se ainda mais a intensidade d FID e cmeça a frmaçã de um pequen ec antecedend puls de rf. Cm Tr=0,9 ms (espectr D) s sinais d FID/ec se sbrepõem ficand um sinal cntínu, cm uma pequena depressã n centr d sinal entre s pulss. Cm Tr=0,3 ms as amplitudes d ec e d FID passam a se equivaler ( espectr E), ficand um sinal cntínu, cnhecid cm estad estacinári (EE). Cm s sinais de EE sã cletads na rdem de milisegunds, algumas centenas de espectrs pdem ser adquirids pr minuts, enquant que cm a técnica cnvencinal (FID u ec), númer de aquisições é dependente de 5T da amstra que pde ser da rdem de até dezenas de segunds. Na figura está um exempl da melhria da razã sinal ruíd cm a técnica EE se cmparad cm a técnica cnvencinal de RMN (FID). a b t(msec) Figura. Sinais de RMN de H NMR prvenientes de, mg de óle de sja. a) sinal d FID cm dis scans e temp de repetiçã T r=5t =690 ms. b) sinal de SSFP cm Tr=0,3ms, temp de aquisiçã (Ta) =,ms, e 657 scans. O temp ttal de aquisiçã fi de,38s em ambs espectrs. Cm pde ser bservad, na RMN cnvencinal sinal(a) é quase indistinguível d ruíd de fund, enquant n EE (b) a intensidade d sinal é facilmente medida devid a númer superir de espectrs acumulads (657 d EE cntra d FID) n mesm temp de análise. Uma vez demnstrada as cndições experimentais ótimas para alcançar regime de EE, avaliu-se empreg desta técnica em análises quantitativas. Prtant fi necessári estudar a linearidade da respsta d sinal de RMN n EE mediante a variaçã de cncentraçã da amstra e ds temps de relaxaçã. N primeir experiment fram utilizadas cinc amstras de cncentraçã cnhecida de óle vegetal diluídas em tetraclret de carbn e cada análise fi repetida três vezes (figura 3).

4 CT/37, CNPDIA, set/000, p.4,4, Intensidade (v),0 0,8 0,6 0, Cncentraçã (%) Figura 3 - Gráfic intensidade d sinal versus cncentraçã de óle empregand a técnica de EE. Parâmetrs espectrais: puls de 90 de 0 s; 5 repetições; temp de repetiçã de 0,3ms; R=0,998. A figura 3 mstra que a intensidade d sinal de RMN n EE respnde linearmente cm a variaçã de cncentraçã, permitind bter uma curva de calibraçã cm um ceficiente de crrelaçã r= 0,998, refletind uma pequena dispersã nas medidas realizadas. Esse resultad demnstra que mesm quand há uma variaçã ds temps de relaxaçã da amstra, nã há uma influência marcante na linearidade de respsta d sinal de RMN n EE. A intensidade d sinal de RMN n EE nã depende ds temps de relaxaçã T e T, cm n cas da RMN cnvencinal, mas sim da razã T /T +T (equaçã ). Para exemplificar que cm EE pde-se separar s cmpnentes de uma amstra cm grande diferença de T e T, fez uma crrelaçã entre ter de óle em sementes individuais de ervilha, que cntem apenas % de óle, cm sinal EE (figura 4) Intensidade d sinal (V pp ) R=0,974,0,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 massa de óle (mg) Figura 4 - Gráfic da intensidade d sinal de RMN de H n EE versus a massa de óle da semente de ervilha. Parâmetrs espectrais: puls de 90 de 0?s; 5 repetições; temp de repetiçã de 0,5 ms.

5 CT/37, CNPDIA, set/000, p.5 Cm T ds cmpnentes sólids da semente (prteínas e carbhidrats) é menr que 00 µs e T é da rdem de segunds, eles praticamente nã cntribuem para sinal EE, cm pde ser calculads pela equaçã. Assim, sinal bservad para a sementes secas, à 60 C durante hras, é devid smente a óle, que tem T e T da mesma rdem. Os pequens desvis ds pnts experimentais bservads, r=0,974, pdem ser atribuíds as variações n ter de óle entre sementes da mesma espécie. Cm esses resultads fica demnstrada a vantagem de se usar a RMN n estad estacinári pis há um enrme ganh na razã sinal ruíd, que pde permitir uma reduçã d tamanh da amstra em até 50 vezes, quand cmparada cm a técnica de RMN cnvencinal. Referências Bibligráficas. COLNAGO, L.A.; MARTIN-NETO, L.; BISCEGLI, C.I.; NASCIMENTO, O.R.; BONAGAMBA, T.J.; PANEPUCCI, H.; VIEIRA, E.M.; SEIDEL, P.R.; SPOSITO, G.; OPELLA, S.J. Aplicações da ressnância magnética nuclear (RMN) e ressnância paramagnética eletrônica (EPR). In: CRESTANA, S.; CRUVINEL, P.E.; MASCARENHAS, S.; BISCEGLI, C.I.; MARTIN-NETO, L.; COLNAGO, L.A., ed. Instrumentaçã agrpecuária: cntribuições n limiar d nv sécul. Brasília: EMBRAPA-SPI, 996. Cap., p AZEREDO, R.B. de V.; COLNAGO, L.A.; ENGELSBERG, M. Quantitative analysis using steady-state free precessin nuclear magnetic resnance. Analytical Chemistry, v.7, p , 000.