DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MINERAL NA FRAÇÃO CELULAR DE SANGUE DE INDIVÍDUOS PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA USANDO EDXRF

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1 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MINERAL NA FRAÇÃO CELULAR DE SANGUE DE INDIVÍDUOS PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA USANDO EDXRF Glauber Tebald Das DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS EM ENGENHARIA NUCLEAR. Aprovada por: Prof. Rcardo Tadeu Lopes, D.Sc. Prof. Marcelno José dos Anjos, D.Sc. Prof. Edgar Francsco Olvera de Jesus, D.Sc. Prof. Inayá Corrêa Barbosa Lma, D.Sc. RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL SETEMBRO DE 2007

2 DIAS, GLAUBER TEBALDI Determnação da Composção Mneral na Fração Celular de Sangue de Indvíduos Portadores de Leucema Melóde Crônca Usando EDXRF [Ro de Janero] 2007 VI,73 p. 29,7 cm ( COPPE / UFRJ, M.Sc., Engenhara Nuclear, 2007 ) Dssertação - Unversdade Federal do Ro de Janero, COPPE 1.Fluorescênca de raos X por dspersão de energa 2.Sangue Humano 3.Leucema Melóde Crônca I. COPPE /UFRJ II. Título ( sére )

3 Resumo da Dssertação apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requstos necessáros para a obtenção do grau em Mestre em Cêncas (M. Sc.). DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MINERAL NA FRAÇÃO CELULAR DE SANGUE DE INDIVÍDUOS PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA USANDO EDXRF Glauber Tebald Das Setembro / 2007 Orentador: Rcardo Tadeu Lopes Programa: Engenhara Nuclear A leucema melóde crônca (LMC) é uma doença que atnge a medula óssea fazendo com que esta produza um número elevado de glóbulos brancos anormas. Ela é responsável por cerca de 20% dos casos de leucema, sendo mas comum em ndvíduos de 25 a 60 anos e raramente atnge cranças com dade nferor a 10 anos. Este trabalho faz um estudo comparatvo entre as concentrações elementares de sangue sado (SAD) e de sangue provenente de portadores de LMC. Para tal foram coletadas 60 amostras de ndvíduos de cada um dos grupos. As amostras foram centrfugadas e apenas a parte celular do sangue fo analsada. As amostras foram loflzadas e transformadas em pastlhas, o que facltou a obtenção das meddas. Para a análse das amostras fo utlzada a técnca de fluorescênca de raos X por dspersão de energa (EDXRF). Esta é uma técnca que apresenta grande facldade de execução e efcênca na determnação de concentrações elementares. Os elementos encontrados foram S, Cl, K, Fe, Cu, Zn, Br e Rb. A análse estatístca dos resultados baseou-se na separação das amostras de acordo com o sexo dos ndvíduos e fo obtda empregando-se o teste t de Student. Quase todos os elementos apresentaram dferenças estatstcamente sgnfcatvas em suas concentrações, as exceções foram os Fe e o Cu.

4 Abstract of Dssertaton presented to COPPE/UFRJ as a partal fulfllment of the requrements for the degree of Master of Scence (M.Sc.) DETERMINATION OF MINERAL COMPOSITION IN BLOOD CELLULAR FRACTION OF PATIENTS WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA BY EDXRF Glauber Tebald Das September / 2007 Advsor: Rcardo Tadeu Lopes Department: Nuclear Engneerng Chronc myelod leukema (LMC) s a dsease that leads the bone marrow to produce a huge number of anomalous whte blood cells. It s responsble for about 20% of the leukema cases, beng more common among 25 to 60-year-old ndvduals, and rare among chldren below the age of 10. Ths research s a comparatve study of the elementary concentratons of healthy blood (SAD) and blood from LMC patents. We have collected 60 samples of ndvduals from each group. The samples were centrfuged and only the cellular blood porton was analyzed. The samples were then lyophlzed and transformed n pellets, n order to facltate measurng. The energy dsperson X-ray fluorescence (EDXRF) technque has been used to analyze the samples. Ths technque presents great executon faclty and effcency n determnng the elementary concentratons. The followng elements were detected: S, Cl, K, Fe, Cu, Zn, Br and Rb. The statstcal analyss of the results was based on the separaton of the samples accordng to gender, and t was accomplshed through Student t-test. The great majorty of the elements presented sgnfcant statstcal dfferences n ther concentratons, except for Fe and Cu. v

5 SUMÁRIO Capítulo I Introdução...01 Capítulo II Revsão Bblográfca...03 Capítulo III Fundamentos Teórcos...09 III.1 Prncípos físcos...09 III.1.1 Modelo atômco de Schrödnger...09 III.1.2 Espectros dscretos de raos X...11 III.1.3 Efeto Auger...14 III.1.4 Fator de exctação...15 III.1.5 Expressão para ntensdade de fluorescênca de raos X...16 III.1.6 Fluorescênca de raos X por dspersão de energa...20 III.2 Prncípos bológcos...21 III.2.1 O sangue...21 III.2.2 Leucema melóde crônca...23 Capítulo IV Materas e Métodos...25 IV.1 Arranjo expermental...25 IV.1.1 Conjunto fonte de almentação - tubo de raos X...27 IV.1.2 Os detectores...27 IV.1.3 Suporte de PVC (geometra de medção)...30 IV.2 Fltragem da radação...31 IV.3 Amostras de sangue...33 IV.3.1 Coleta das amostras no HEMORIO...33 IV.3.2 Preparação das amostras...33 IV.4 Tratamento das meddas...36 IV.4.1 Curva de absorção...37 IV.4.2 Curva de sensbldade...38 IV.4.3 Cálculo das concentrações...38 IV.5 Lmte de detecção...39 v

6 Capítulo V Resultados e dscussão...40 V.1 Curva de absorção...40 V.2 Curva de sensbldade...42 V.3 Medda da amostra certfcada...46 V.4 Lmte de detecção...46 V.5 Espectros de EDXRF...49 V.6 Concentrações elementares nas amostras de sangue...51 V.7 Comparação entre as concentrações elementares de sangue...52 V.8 Comparação entre as concentrações elementares de sangue para ambos os sexos..53 V.9 Tratamento estatístco dos resultados...57 V.9.1 Teste t de Student para amostras de sangue sado e com LMC...59 V.9.2 Teste t de Student para amostras de sangue de homens sados e portadores de LMC...59 V.9.3 Teste t de Student para amostras de sangue de mulheres sadas e portadoras de LMC...60 V.9.4 Comparação entre os testes t de Student aplcados nas três stuações...60 V.10 Análse dos resultados...61 Capítulo VI Conclusões e Sugestões...63 Capítulo VII Bblografa...65 Apêndce A...68 Apêndce B...71 Apêndce C...73 v

7 CAPÍTULO I INTRODUÇÃO A leucema melóde crônca (LMC) é uma doença na qual células que se encontram na medula óssea se transformam em cancerosas e produzem um número elevado de glóbulos brancos. A LMC é responsável por cerca de 20% de todos os casos de leucema. Ela é mas comum em adultos de 25 a 60 anos e atngem mas freqüentemente a população masculna. Raramente se apresenta na nfânca, representando apenas 3% dos casos de leucema que ocorrem nesta faxa etára, mas quando se manfesta nessas crcunstâncas é mas agressva que o normal. Esta doença não possu causas bem defndas, além de ser de dfícl dagnóstco precoce por não apresentar sntomas em suas fases ncas. Portanto, estudos que encontrem quasquer snas do surgmento dessa doença são de grande mportânca para a área médca, pos podem melhorar as condções de tratamento e, conseqüentemente, aumentar o tempo de sobrevda dos pacentes. Este trabalho tem por objetvo determnar as concentrações dos elementos presentes na parte celular do sangue de ndvíduos portadores de LMC e verfcar a varação destas concentrações quando comparadas com as concentrações determnadas em amostras de sangue de ndvíduos sados. Para tal, foram analsadas 60 amostras de sangue de ndvíduos portadores de LMC e os resultados obtdos foram comparados com outros obtdos de amostras de um grupo de 60 ndvíduos sados (SAD). Para se determnar as concentrações elementares do sangue fo utlzada a técnca de fluorescênca de raos X por dspersão de energa (EDXRF). Esta é uma técnca bastante utlzada na análse de concentrações de elementos presentes em város tpos de amostras. Ela consste em analsar a radação característca emtda por uma amostra quando, sobre ela, se faz ncdr um fexe de raos X. As vantagens desta técnca em relação a outras técncas analítcas são: efcênca, facldade de execução, preservação da amostra e pouca nterferênca de elementos. 1

8 O prncpal estímulo à realzação deste trabalho fo a carênca de estudos focados neste tema até então. Embora a utlzação de EDXRF para a determnação de concentrações elementares de dversos tpos de amostras seja muto dfundda, trabalhos envolvendo amostras de sangue humano, e anda nvestgando leucema, são poucos. MANGAL et al. (1981) usou atvação neutrônca para analsar o efeto da leucema na concentração de alguns elementos em sangue humano total. EKINCI et al. (2004) propôs que EDXRF sera um método alternatvo para a determnação das concentrações elementares em sangue humano de pacentes portadores de leucema, câncer de pulmão e esquzofrena. Os resultados obtdos por estes pesqusadores são um tanto quanto dscrepantes, o que pode ter sdo causado pelo pequeno número de amostras analsadas em cada um destes estudos. Essa falta de concordânca entre os resultados até então obtdos e a não abordagem específca da leucema melóde crônca como objeto de estudo, servram como motvações adjacentes à concretzação deste estudo. 2

9 CAPÍTULO II REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Neste capítulo serão descrtos métodos e resultados apresentados em outros trabalhos que, de certa forma, servram como base para o estudo desenvolvdo neste trabalho. STUMP et al. (1977) relataram a aplcabldade da técnca de fluorescênca de raos X na análse multelementar em amostras bológcas. Utlzaram a fluorescênca de raos X por dspersão de energa com alvo secundáro para analsar amostras de sangue total e plasma humanos. O grupo de ndvíduos estudados era composto por 38 mulheres com dade de 18 a 22 anos e 35 homens de 18 a 33 anos. Do sangue colhdo de cada ndvíduo, apenas 1ml fo retrado para a preparação das amostras. Na preparação das amostras o sangue fo centrfugado para a retrada do plasma e, em seguda, loflzado e transformado em pastlhas de 13mm de dâmetro. Os elementos que tveram determnadas suas concentrações foram o cobre, o znco, o bromo e o rubído. Em sangue total, as concentrações obtdas foram: Cu (1,07 ± 0,25µg.g -1 ), Zn (7,76 ± 0,88µg.g -1 ), Br (3,46 ± 0,69µg.g -1 ) e Rb (3,65 ± 0,45µg.g -1 ), para homens e Cu (1,02 ± 0,21µg.g -1 ), Zn (7,07 ± 0,73µg.g -1 ), Br (2,87 ± 0,45µg.g -1 ) e Rb (4,04 ± 0,77µg.g -1 ), para mulheres. Este trabalho reafrmou a técnca de EDXRF como um bom método não destrutvo de análse elementar. MANGAL et al. (1981) utlzaram à técnca de atvação neutrônca para estudar a concentração de elementos presentes em sangue total humano. Foram analsadas amostras provenentes de 26 ndvíduos dos quas 9 eram sados e 17 eram portadores de leucema. Os elementos estudados foram Fe, Co, Zn, Cr, Se, Rb, Sc e Hg. Os elementos que apresentaram maores concentrações foram o Fe, Zn e Rb. Em sangue sado tas concentrações foram 3,92 ± 0,58 x 10 2 µg.g -1 para o Fe, 36,86 ± 7,7µg.g -1 para o Zn e 12,25 ± 5,14µg.g -1 para o Rb, enquanto em sangue leucêmco os valores encontrados foram Fe (3,54 ± 0,67 x 10 2 µg.g -1 ), Zn (34,19 ± 8,58µg.g -1 ) e Rb (7,90 ± 3,14µg.g -1 ). A redução de 9,7% de ferro fo atrbuída à redução de ertróctos no sangue leucêmco, a redução do 3

10 znco fo consderada como não sgnfcatva. O rubído apresentou a maor varação de concentração entre todas as amostras analsadas. TORLBARA et al. (1982) construíram um nstrumento que se baseava no prncípo da fluorescênca de raos X por dspersão de energa para analsar elementos traço em fos de cabelo. O fexe de raos X era produzdo por um alvo de molbdêno e, em seguda, passava por um fltro, também de molbdêno, o que gerava um fexe quase que monocromátco de energa gual a 17 kev (K α do Mo). Este equpamento proporconou uma análse não destrutva das amostras e resultados mas reprodutíves que os obtdos através dos métodos anterores. As amostras analsadas são orgnáras de ndvíduos não expostos a metas pesados ou qualquer tpo de drogas. Os elementos encontrados foram: Ca, T, V, Cr, Mn, Fe, N, Cu, Zn, As, Se, Br, Rb, Sr, Hg e Pb. AKKUS et al. (1998) estudaram amostras de soro e unhas das mãos de 22 cranças com o objetvo de comparar as concentrações de cobre (Cu) e magnéso (Mg) em ndvíduos sados e com leucema lnfoblástca aguda (LLA). Do grupo de cranças estudadas 10 eram portadoras da doença e as outras 12, sadas, servam de grupo controle. A técnca utlzada na determnação das concentrações fo à espectrometra de absorção atômca. As concentrações de cobre encontradas em amostras de soro de ndvíduos sados e portadores de LLA foram, respectvamente, 1,15±0,70µg.g -1 e 5,251±1,607µg.g -1. RODUSHKIN et al. (1999) fzeram análse multelementar de sangue humano utlzando espectrometra de massa com fonte de plasma de alta resolução (ICP-SMS). Foram colhdas amostras em 31 atletas suecos com dade entre 16 e 36 anos. Antes de doarem as amostras os ndvíduos tveram que nterromper o uso de suplementos mneras almentares. Cnqüenta elementos foram detectados, estabelecendo assm o ICP-MS como uma boa técnca de análse multelementar. Os elementos encontrados que apresentaram maores concentrações foram: Fe (476µg.g -1 ), P (375µg.g -1 ), Br (6,6µg.g -1 ), Zn (5,8µg.g -1 ), Rb (2,5µg.g -1 ), S (2,3µg.g -1 ) e Cu (0,83µg.g -1 ). BÁRÁNY et al. (2001) compararam níves de elementos traço de sangue e soro de adolescentes suecos usando espectrometra de massa com fonte de plasma (ICP-MS). 4

11 Foram determnadas as concentrações de Co, Cu, Zn Se, Rb, Rh, Pd, Cd, W, Pt, Hg, Tl e Pb. Os elementos que apresentaram as maores concentrações foram: Cu (0,95±0,1µg.g -1 ), Zn (6,1±0,9µg.g -1 ) e Rb (2,9±0,5µg.g -1 ). Os demas elementos apresentavam concentrações da ordem de ng.g -1. CELIK et al. (2002) usaram espectrometra de massa com fonte de plasma (ICP) para determnar a concentração de alguns elementos traços presentes em fludo abdomnal e soro em ndvíduos portadores de crrose e portadores de doenças malgnas abdomnas. Foram coletadas amostras de 17 pacentes, sendo 10 deles crrótcos (5 homens e 5 mulheres) e 7 mulheres portadoras de doenças malgnas. Os elementos analsados foram: cobre, znco, magnéso e ferro. As concentrações obtdas no soro de ndvíduos do grupo de portadores de doenças malgnas foram: Cu (1,1843 ± 0,3298µg.g -1 ), Zn (1,1786 ± 0,2518µg.g -1 ), Mg (0,0224 ± 0,0036µg.g -1 ) e Fe (0,9228 ± 0,4066µg.g -1 ). As concentrações dos mesmos elementos em amostras de soro de ndvíduos portadores de crrose (doença bengna) foram: Cu (0,975 ± 0,2603µg.g -1 ), Zn (1,277 ± 0,3451µg.g -1 ), Mg (0,023 ± 0,0057µg.g -1 ) e Fe (2,558 ± 1,8377µg.g -1 ). Segundo o autor, as dferenças de concentrações observadas entre ndvíduos portadores de doenças malgnas abdomnas e crrose podem ser útes para um dagnóstco e para a dstnção entre elas. KUMAR et al. (2002) analsaram amostras de soro de cranças portadoras de defcênca mental. Utlzaram a técnca de emssão de raos X nduzdos por prótons (PIXE) para nvestgar as concentrações elementares das amostras e compararam com um grupo controle formado por ndvíduos sados. O grupo controle era formado por 70 ndvíduos, assm como o grupo de defcentes. Este últmo fo dvddo em três subgrupos classfcados de acordo com o grau do retardo mental (leve, moderado e severo). As amostras foram loflzadas, envolvdas por Mylar e, em seguda, rradadas com um fexe de prótons de 2,3MeV. Os elementos encontrados foram: P, S, Cl, K, Ca, T, Fe, Cu, Zn, Br, Rb, Sr e Pb. Fo observada uma redução nas concentrações de ferro, znco e cobre no grupo de ndvíduos com maor grau de retardo mental levando à conclusão de que a defcênca destes elementos tem papel mportante na causa de problemas mentas. 5

12 EKINCI et al. (2004) utlzaram fluorescênca de raos X por dspersão de energa (EDXRF) para analsar as concentrações elementares em sangue humano provenente de ndvíduos que sofram de esquzofrena, câncer de pulmão e leucema. A fluorescênca de raos X fo obtda a partr de fontes radoatvas de 55 Fe e 241 Am. Os elementos encontrados em sangue leucêmco foram: Cl, K, Ca, Fe, Rb, Nb, Mo, In, Sn e I. MARTINEZ et al. (2004) determnaram elementos traço em amostras de sangue utlzando a fluorescênca de raos X por reflexão total (TXRF). Foram analsadas 50 amostras de sangue humano provenente de ndvíduos sados (35 de homens e 15 de mulheres). As amostras foram loflzadas por 8 horas e, em seguda, dgerdas com ácdo nítrco e ácdo hdroclorídrco para que o ferro fosse separado. Os elementos detectados foram S, K, Ca, Mn, Cu, Zn, Br, Rb e Pb. O potásso apresentou a maor concentração (3156,22µg.g -1 ) segudo pelo enxofre (1478,95µg.g -1 ). O controle de qualdade fo feto utlzando-se amostras certfcadas pela Agênca Internaconal de Energa Atômca de sangue anmal loflzado (IAEA, A-13). CUSTÓDIO et al. (2005) analsaram as concentrações de elementos traços presentes em sangue total provenente de cordões umblcas, utlzando EDXRF. O sangue fo coletado, loflzado e transformado em pastlhas de dâmetro de 2,0cm e espessura 1,0mm. A rradação das pastlhas fo feta por meo de um tubo de raos X com anodo de molbdêno e fexe não fltrado. As análses das concentrações basearam-se em três condções dstntas: a dade da mãe, a massa do recém-nascdo e o período de gestação. Os elementos analsados foram: potásso, cálco, ferro, cobre, znco, bromo, rubído e chumbo. Para verfcar a reprodutbldade dos resultados, meddas de concentração foram fetas em amostras certfcadas, uma de sangue loflzado de anmal (IAEA, A-13) e uma de folhas de árvores frutíferas (NBS, 1571). Foram observadas concentrações de K, Ca, Fe, Cu, Zn, Br, Rb e Pb que tveram uma pequena varação para as três condções de análse. CANELLAS et al. (2006) utlzando a fluorescênca de raos X por reflexão total empregando radação síncroton (SRTXRF) analsaram amostras de soro de ndvíduos portadores de leucema melóde crônca (LMC) e ndvíduos sados (controle). Foram analsadas 60 amostras de ndvíduos portadores de LMC e 60 de ndvíduos sados. As 6

13 amostras de sangue foram centrfugadas para a retrada do soro. Em seguda o soro fo dluído com água Mll-Q e adconado 50µL de Ga, que servu como padrão nterno. Foram encontrados os seguntes elementos: P, S, Cl, K, Ca, Cr, Mn, Fe, N, Cu, Zn, Br e Rb. O teste estatístco ANOVA fo utlzado na análse dos resultados e mostrou que há dferenças reas entre as concentrações dos elementos essencas P, S, Cl, Ca, Cr, Mn, Fe, Cu e Rb encontradas nas amostras de soro de ndvíduos portadores de LMC e sados. Essas dferenças podem estar relaconadas não só ao sexo, mas à almentação, aos medcamentos e até mesmo ao estágo da doença. MAGALHÃES et al. (2006) fzeram um estudo da dstrbução elementar em amostras de tecdos humanos cancerosos e sados utlzando as técncas de EDXRF e TXRF. Foram analsadas amostras provenentes de sete alemães e dez portugueses, sendo que, de cada ndvíduo, foram retradas duas amostras, uma de tecdo sado e outra de tecdo canceroso. As amostras de câncer dos doadores alemães foram: os cânceres de colo, mama e útero, já nos doadores portugueses foram os cânceres de reto, sgmóde, treóde, rns, larnge e pulmão. As amostras estudadas com TXRF foram prevamente congeladas e fatadas em sessões de, aproxmadamente, 10µm de espessura e, em seguda, posconadas em um suporte de quartzo e analsadas dretamente. As amostras estudadas em EDXRF foram loflzadas por 48 horas a -60 C e a pressão de 10-1 atm, trturadas e transformadas em pastlhas de 2,0 cm de dâmetro. Para verfcar a reprodutbldade dos resultados foram fetas meddas com amostras certfcadas de folhas de árvores frutíferas (NBS, 1571) e sangue loflzado de anmal (IAEA, A-13). Os elementos determnados no estudo das amostras dos ndvíduos portugueses foram: P, S, K, Ca, Fe, Cu, Zn e Cr, enquanto que nos alemães foram: P, S, K, Ca, Fe, N, Cu, Zn, Br, Sr, Rb e I. A TXRF apresenta melhor sensbldade na análse de elementos de número atômco mas baxo. HEITLAND et al. (2006) pesqusaram concentrações de elementos traço em sangue humano. Utlzaram ICP-MS para determnar as concentrações de amostras provenentes de 130 ndvíduos sados, habtantes da regão de Bremen (norte da Alemanha). Nesta pesqusa foram analsados os hábtos almentares dos ndvíduos, se eram fumantes ou não, além da presença de lgas metálcas em obturações dentáras, dade, sexo e local de 7

14 resdênca. Tas fatores determnaram concentrações elementares atípcas. Dentre os elementos analsados estavam o Cu e o Rb, os quas apresentaram concentrações respectvamente guas a 1.042µg.g -1 e 2.408µg.g -1. 8

15 CAPÍTULO III FUNDAMENTOS TEÓRICOS III.1 Prncípos Físcos A explcação do espectro dscreto de raos X emtdo por um determnado átomo só fo plenamente possível após a descrção do modelo atômco feta por Erwn Schrödnger no níco do século XX. Alguns dos modelos que o antecederam, como o de Bohr e Sommerfeld, também trazam nformações sobre o fenômeno, mas não o explcavam completamente. III.1.1 Modelo atômco de Schrödnger Schrödnger teve grande reconhecmento da comundade centífca nternaconal ao usar sua então recente teora da Mecânca Quântca para descrever o átomo monoeletrônco. Tal teora basea-se no prncípo de dualdade onda-partícula de De Brogle para explcar as les do movmento ondulatóro que as partículas de qualquer sstema mcroscópco obedecem. Desta forma, determnando a onda de De Brogle assocada que descreve o comportamento destas partículas, ou função de onda (Ψ), obtémse toda a nformação dsponível a respeto da partícula. A lgação básca entre as propredades da função de onda Ψ(x,t) e o comportamento da partícula assocada é expressa em termos de densdades de probabldade P(x,t). Esta grandeza especfca a probabldade por undade de comprmento do exo x, de encontrar a partícula próxma da coordenada x em um nstante t. P(x,t) é dada pela relação mostrada na eq.3.1. (3.1) P( x, t) = Ψ *( x, t) Ψ( x, t), onde Ψ*(x,t) representa o complexo conjugado de Ψ(x,t). A teora de Schrödnger resulta na equação que também recebeu seu nome (eq.3.2). 2 h 2m 2 Ψ( x, t) Ψ( x, t) + V ( x, t) Ψ( x, t) = h, 2 x t (3.2) 9

16 onde ħ é a constante de Plank dvdda por 2π, m é a massa da partícula em questão, V(x,t) é o potencal ao qual o sstema está submetdo e o número magnáro. A resolução da equação 3.2, representada em sua forma trdmensonal e ndependente do tempo, forma que de fato descreve o comportamento atômco, tornou possível a compreensão da estrutura de um átomo (eq.3.3). 2 h 2 Ψ 2 µ ( x, y, z) + V ( x, y, z) Ψ( x, y, z) = EΨ( x, y, z) (3.3) onde 2 é o operador laplacano. Como solução da equação 3.3 obtém-se as prevsões para os autovalores de energa do átomo (eq.3.4). E n = µ Z ( 4πε ) o 2 2 e 4 2 2h n 2, (3.4) onde µ é a massa reduzda, Z o número atômco do elemento, e é a carga do elétron, ε o a permssvdade elétrca no vácuo e n o número quântco prncpal (EISBERG, 1979). As autofunções que levam a estes autovalores (eq.3.4) dependem de certas constantes conhecdas como números quântcos. Tas números são hstorcamente representados pelas letras n, l e m. Do número quântco prncpal (n) dependem os autovalores de energa do átomo. Ele também está relaconado à dependênca da dstânca do elétron ao núcleo atômco. O número quântco orbtal (l) depende do momento angular orbtal do átomo. Se o átomo se encontra em um campo elétrco externo, exste uma dependênca de sua energa com m, por sso ele é chamado de número quântco magnétco. Estudos sobre o comportamento dos elétrons, posterores à teora de Schrödnger, revelaram que estas partículas apresentam um campo magnétco ntrínseco assocado à sua carga grando em um movmento de rotação em torno de s mesmas. A esta rotação está relaconado um momento angular, denomnado spn, ou número quântco de spn (s). Os possíves valores dos números quântcos para um elétron lgado são mostrados na Tabela 3.1. Tendo o elétron dos momentos angulares, um assocado ao número quântco l e outro ao s, é possível descrever um momento angular total dado pela soma vetoral destes dos. O número quântco que representa este momento angular total é o número quântco j, dado por 10

17 j = l ± s. (3.5) Tabela 3.1 Possíves valores assumdos pelos números quântcos dos elétrons. Número Quântco Nome Valores Possíves n prncpal 1, 2, 3... l orbtal 0, 1, 2,..., n-1 m magnétco -l, -l+1,..., 0,..., l-1, l s spn ±1/2 É o conjunto dos números quântcos que caracterza um determnado elétron, dferencando-o assm dos demas presentes num átomo. Isto se dá porque os números quântcos estão presentes na função de onda de uma partícula e, como já dto, a função de onda leva ao cálculo da probabldade de se encontrar tal partícula em uma determnada regão (Ψ*Ψ), regão esta conhecda como orbtal. III.1.2 Espectros dscretos de raos X A produção de fluorescênca de raos X (ou raos X característcos) se dá a partr da remoção de um elétron de seu orbtal atômco. Tal fenômeno decorre de nterações, de elétrons com fótons ou partículas de energa maor que sua energa de lgação ao átomo, que resultam na transferênca do elétron para um nível mas energétco ou, até mesmo, na ejeção deste elétron do átomo. Com a ausênca do elétron surge um buraco no orbtal, denomnado vacânca (LACHANCE, 1995). A retrada do elétron de um orbtal nterno leva o átomo a um estado exctado de energa. Como forma de retornar ao estado atômco fundamental (estado de menor energa), elétrons de orbtas mas energétcos mgram para o orbtal mas nterno (menor energa) para preencher a vacânca, dexando uma outra vacânca no seu orbtal de orgem. Desta forma se faz necessára a mgração de um outro elétron de um orbtal mas energétco e o processo se repete até que o orbtal mas externo seja preenchdo por um elétron lvre do meo. Então o átomo fca novamente neutro e no estado fundamental. Estas mgrações eletrôncas de um orbtal para outro são também chamadas de saltos quântcos, pos, na mecânca quântca o conceto clássco de órbta, onde os elétrons gram 11

18 ao redor do núcleo, como os planetas ao redor do Sol, é expanddo para o conceto de estados quântcos (Fgura 3.1). Estes estados quântcos são determnados por um conjunto de números quântcos que dão as característcas do elétron presente em tal estado. Os estados quântcos são comumente representados por nuvens de probabldade de dferentes formas e tamanhos dentro das quas a chance de se encontrar o elétron é maor que em qualquer outro lugar (EISBERG, 1979). Fgura 3.1 Vsão quântca dos orbtas atômcos. Nas regões sombreadas apresenta-se maor probabldade de se encontrar um elétron, probabldade esta que vara com a mudança dos números quântcos (EINSBERG, 1979). Para que a energa seja conservada em cada um destes saltos quântcos, ocorre a emssão de raos X com energa gual à energa de exctação do átomo, ou seja, gual à 12

19 dferença entre as energas do orbtal onde se formou a vacânca e do orbtal de orgem do elétron que mgrou para preenchê-la. Como a energa de um determnado orbtal depende do número atômco (Z) do elemento (3.4), orbtas que possuem mesmo conjunto de números quântcos, mas em átomos de elementos dferentes, possuem energas dferentes. Sendo assm, saltos quântcos que ocorrem em átomos de elementos dferentes emtem fóton de raos X de energas dferentes. Tas fótons representam uma assnatura do elemento químco, por sso são também chamados de raos X característcos. O Apêndce A mostra as energa de emssão de raos X característco para dversos elementos. Uma notação amplamente adotada em dversas stuações, nclusve em espectrometra de raos X, é atrbur a cada valor do número quântco prncpal (n) uma letra maúscula, como representado na tabela 3.2. Tabela Notação espectroscópca para n. n Notação Espectroscópca K L M N O... Por exemplo, se uma vacânca é formada na camada K de um átomo, um elétron de uma camada superor mgrará para esta camada lberando um fóton de raos X. Se o elétron ver da camada L então o fóton é chamado de K α, se ver da camada M, K β, e assm sucessvamente. Estes fótons formam a sére K. Outras séres são formadas quando a vacânca se forma em camadas mas externas que a K (KNOLL, 1989). O esquema das séres de decamento pode ser observado na Fgura 3.2. Como mostrado na Fgura 3.2, nem todas as transções são observadas. Para que haja uma transção ela deve satsfazer determnadas condções conhecdas como regras de seleção: l = ±1 e j = 0, ±1. Isto é, só exstem transções entre níves cujos números quântcos orbtas dferem de uma undade e cujos números quântcos j dferem de zero ou uma undade. As regras de seleção especfcam quas transções têm probabldades tão baxas de ocorrer que não podem ser normalmente observadas. 13

20 III.1.3 Efeto Auger O efeto Auger é uma forma alternatva que o átomo exctado possu de lberar sua energa extra. Para que um elétron mgre de uma camada mas externa para preencher uma vacânca gerada por uma determnada nteração é precso que lbere energa gual à energa de exctação do átomo. Esta energa pode ser lberada pela emssão de fótons de radação X, raos X característcos, ou de um elétron, conhecdo como elétron Auger. Este elétron é emtdo pelo átomo com energa cnétca gual à dferença entre as energas de exctação do átomo e de lgação do seu orbtal de orgem. A probabldade de emssão de elétrons Auger dmnu com o aumento do número atômco. Fgura A fgura apresenta alguns dos níves de energa de um átomo e seus números quântcos correspondentes. Também são mostradas as transções permtdas pelas regras de seleção (EINSBERG, 1979). 14

21 III.1.4 Fator de exctação O fator de exctação ( p E ) representa a probabldade de que a radação ncdente na amostra produza uma determnada lnha de fluorescênca de raos X. Esta probabldade é dada pelo produto de outras três (LACHANCE, 1995): pe = p nível p lnha p fluorescênca (3.6) onde p nível é a probabldade de que a nteração da radação ncdente com um átomo da amostra resulte na ejeção de um elétron de um dado nível, uma determnada lnha seja emtda dentro de sua sére e plnha é a probabldade de que p fluorescênca é a probabldade no processo de preenchmento da vacânca gerada ocorra a emssão de fótons de fluorescênca de raos X, ao nvés de elétrons Auger. A probabldade p nível, também conhecda como razão salto/absorção, está dretamente relaconada à fração da radação absorvda pelo nível em questão. p nível = absorção da radação num nível específco (3.7) absorção da radação em todos os níves Consdere a probabldade para a camada K. A razão salto/absorção também pode ser representada pela relação p K rk 1 =, r K (3.8) onde r K τ K + τ L + τ... 1 L + τ 2 L3 = e anda, τ é a seção de choque fotoelétrca da camada τ + τ + τ... L1 L2 L3 (Apêndce B). A probabldade de que uma determnada lnha dentro de uma sére seja emtda, p lnha, é dada pela ntensdade relatva desta lnha dentro de sua sére. Desta forma, a probabldade de que Kα seja emtda tendo em vsta toda a sére K é dada por 1 f I = Kα 1 Kα 1 I KT, onde I K T é o somatóro das ntensdades de todas as lnhas da sére K. (3.9) 15

22 Rendmento de fluorescênca, ω, é o nome dado à probabldade de que a mgração de um elétron para preencher uma vacânca de um nível energétco mas nterno gere um fóton de fluorescênca ao nvés de um elétron Auger. Desta forma, ω pode ser representado por ns p (3.10) fluorescênca = ω =, onde n s é o número n pde fótons de fluorescênca produzdos, n p é o número total de mgrações eletrôncas ocasonadas pela necessdade das vacâncas de níves mas nternos serem preenchdas. O valor de n p é dado pela soma de n s com o número de elétrons Auger produzdos (Apêndce B). A Fgura 3.3 mostra o rendmento de fluorescênca para as lnhas K e L em função do número atômco. 1 rendmento de fluorescênca 0,8 0,6 0,4 0,2 lnhas K lnhas L número atômco (Z) Fgura Rendmento de fluorescênca para as lnhas K e L (ANJOS, 2000). III.1.5 Expressão para ntensdade de fluorescênca de raos X Determnar-se a ntensdade da fluorescênca de raos X que emerge de uma determnada amostra para um dado elemento químco é de grande mportânca quando se quer obter a concentração de cada um destes elementos. O estudo que leva à expressão usada para determnar as concentrações elementares presentes numa amostra a partr de tal ntensdade assume que a dstrbução dos elementos que consttuem a amostra se dá de 16

23 forma unforme ao longo de seu volume (amostra homogênea). A Fgura 3.4 apresenta um esquema de uma dsposção tpcamente usada em espectroscopa de fluorescênca de raos X por dspersão de energa. Um fexe de fótons colmado ncde sobre a amostra com um ângulo θ 1 e produz fluorescênca de raos X numa camada de espessura dx stuada a uma profunddade x. O fexe de raos X característcos, de ntensdade I (correspondente ao elemento ), emtdo que atnge o detector forma um ângulo θ 2 em relação à superfíce da amostra. x = D dx x = 0 x θ 1 θ 2 fonte detector Fgura 3.4 Geometra utlzada na dedução da equação que determna a ntensdade de radação fluorescente que emerge de uma amostra consderando as concentrações de cada um dos elementos que a compõem (ANJOS, 2000). A ntensdade de radação fluorescente, para uma dada lnha y, emtda por um elemento na camada dx depende da combnação de outras três ntensdades (LACHANCE, 1995), descrtas a segur. 1. I 1 é a ntensdade da radação do fexe ncdente, de energa E 0, que atnge a camada dx. Sendo assm, este valor depende da ntensdade I 0 do fexe que atnge a amostra, atenuada ao longo de seu camnho até atngr dx. Depende também do ângulo sóldo Ω 1 com que o fexe ncdente fo emtdo. Desta forma 17

24 I = I o nde µ M é o coefcente de atenuação de massa da amostra para a energa E 0 dos fótons ncdentes e ρ M é densdade da amostra. 2. di f é a ntensdade de emssão de uma determnada lnha de fluorescênca gerada num elemento de densdade ρ ao longo da camada dx. Este valor depende da quantdade de radação que atnge a camada dx. ( ) dx di f = I1 τ E 0 ρ p nível f, y ω, y (3.12) Com τ sendo a seção de choque fotoelétrca do elemento para a energa E 0. As probabldades p nível, f y e ω já foram descrtas em III I 2 é a ntensdade de radação fluorescente que é detectada. Essa ntensdade depende da absorção sofrda pelos fótons de fluorescênca ao longo de seu camnho dentro da amostra, do ângulo sóldo de abertura do detector, Ω 2, e da efcênca (ε) do detector para a energa dos fótons de fluorescêncas (E ) emtdos por cada um dos elementos. I x exp( µ M 0 M 1 sen θ ( E ) ρ ), 1 0 Ω 1 x µ ( E ) ρ Ω ε ( E ) 2 = I f exp( M M ) 2 sen θ 2 (3.13) Onde µ M (E ) é o coefcente de atenuação de massa da amostra para a energa da radação fluorescente produzda pelo elemento. Combnando-se estes três fatores chega-se à expressão da ntensdade de radação fluorescente, para uma determnada lnha y, emtda por um elemento na camada dx. (3.11) di, y r r 1 nível ( I Ω Ω ) τ ( E ) ω f ε ( E ) ρ = , y, y nível exp µ M x senθ 1 x senθ 2 ( E ) ρ exp µ ( E ) ρ dx 0 M M M (3.14) Agrupando alguns dos termos, é possível reescrever a equação 3.14 da segunte forma: di, y onde: ( E ) ρ [ exp( χ ( E E ) x) ] dx = G K ε, ρ o M (3.15) 18

25 K corresponde ao agrupamento dos parâmetros físcos responsáves pela produção de fluorescênca de raos X. r 1 ( ). (3.16) 0,, nível K = τ E ω y f y rnível G agrupa termos que dependem da ntensdade da fonte de exctação e das característcas geométrcas da fonte e do detector. Por sso esse fator pode ser chamado de fator de geometra do sstema. G = I. 0 Ω1 Ω 2 (3.17) Os coefcentes de absorção de massa para a energa do fexe ncdente (E 0 ) e emergente (E ) são agrupados em χ. µ M ( E 0 ) µ M ( E ) χ = +. senθ1 senθ 2 Integrando-se a equação 3.15 em toda a espessura da amostra, tem-se: D ( ) ( ( ) ), I, y = G K ε E ρ exp χ E0, E ρ M x dx 0 ou anda, I ρ 1 = G K ε ( E ) [ 1 exp( χ ( E0, E ) ρ M )]. ρ χ, y D M O termo ρ M.D corresponde à densdade superfcal da amostra, medda em g/cm 2 ; ρ /ρ M é a concentração do elemento, W, na amostra, medda em µg/g. O produto G.K.ε(E ) representa a sensbldade (S ) do sstema para a produção e detecção de fluorescênca do elemento da amostra. A sensbldade depende do fator geométrco, ou seja, posconamento do detector, da amostra e da fonte, da capacdade da amostra de produzr fluorescênca e da efcênca do detector para captá-la. Sendo assm, a equação 3.19 pode ser reescrta como I, y W = S W [ 1 exp( χ ( E0, E ) ρ M D) ] χ ( E, E ) 0 Assm a concentração W de um elemento pode ser obtda como: I = S χ ( ) E o, E [ 1 exp( χ ( E o, E ). ρ M. D) ]. (3.18) (3.19) (3.20) (3.21) (3.22) 19

26 A partr da equação 3.22, a determnação da concentração de um elemento na amostra pode ser feta medndo-se expermentalmente a ntensdade da radação fluorescente (I ), determnando-se sem-emprcamente os valores de sensbldade do sstema (S ) a partr de padrões e conhecendo-se a absorção da radação na amostra, representado pelo termo entre chaves na própra equação III.1.6 Fluorescênca de raos X por dspersão de energa A fluorescênca de raos X por dspersão de energa é um dos métodos mas smples e acurados utlzados na determnação da composção químca e da concentração elementar de város tpos de materas. Ele consste em analsar o espectro de fluorescênca emtdo por uma amostra exctada com um fexe de raos X. É um método não destrutvo que requer pouca, ou nenhuma, preparação das amostras analsadas. Ele pode ser utlzado para um grande ntervalo de elementos, que va do boro (Z=5) ao urâno (Z=92) (LACHANCE, 1995) Esta técnca surgu no níco dos anos 70, com o advento dos detectores de estado sóldo, pos estes, dferentemente de seus antecessores, a gás, podam ser calbrados em energa. Para elementos de número atômco na faxa de 13 (Al) a 50 (Sn), característca comum aos elementos estudados neste trabalho, utlzam-se, normalmente, detectores semcondutores de S(L) com janela de berílo. A maor efcênca dos detectores semcondutores de germâno hperpuro (HPGe) para a detecção de raos de alta energa faz com que estes sejam mas utlzados em EDXRF aplcada a elementos de alto número atômco (Z>50) devdo às altas energas de suas lnhas K. Empeclhos tecnológcos dfcultam a utlzação de EDXRF na nvestgação de elementos de número atômco menor que 13, devdo a baxa energa das lnhas K emtdas por tas elementos. Os fótons de fluorescênca de raos X, provenentes da amostra, que atngem o detector produzem pulsos eletrôncos de ampltude proporconal à sua energa. Estes pulsos são processados pela eletrônca assocada ao detector, dscrmnados por analsador multcanal de acordo com sua ampltude e apresentado sob a forma de um espectro de energa. Para a análse de amostras compostas por elementos de número atômco na faxa de 13 a 50, a exctação pode ser feta com tubos de raos X de tensão máxma na faxa de 20

27 30kV, já que tas elementos possuem a energa de exctação da camada K abaxo deste valor. A Fgura 3.5 mostra um esquema de um sstema de análse que utlza a fluorescênca de raos X por dspersão de energa. Amostra Tubo de raos X Detector Amplfcador e Analsador Multcanal Fgura 3.5 Sstema de medda normalmente empregado em análses de amostras utlzando fluorescênca de raos X por dspersão de energa. III.2 Prncípos bológcos Uma vez que este trabalho baseou-se na análse das concentrações elementares do sangue humano e na comparação dos valores obtdos em sangue de ndvíduos sados e portadores de LMC, faz-se necessára a exposção de alguns concetos que facltam a compreensão de tas temas. III.2.1 O sangue O sangue, líqudo que crcula no sstema cardovascular, vem despertando o nteresse do homem há város séculos. Há regstros em pergamnhos egípcos que datam de aproxmadamente 2000 anos atrás que defendem a sangra como tratamentos para algumas doenças (SILVERTHORN, 2003). Análses mcroscópcas mostram que o sangue é formado por plasma e elementos celulares. O plasma é a parte líquda na qual os elementos celulares estão em suspensão. Nele estão também presentes dversos tpos de proteínas, hormônos, glcose e sas 21

28 norgâncos. O grupo dos elementos celulares é composto pelas plaquetas, leucóctos e hemácas. As plaquetas são corpúsculos desprovdos de núcleo, orgnados da fragmentação de células conhecdas como megacaróctos. Elas têm como função a coagulação do sangue e o reparo das paredes dos vasos sanguíneos. Os leucóctos, ou glóbulos brancos, são células ncolores e esfércas quando em suspensão no sangue. São responsáves pela defesa do organsmo, consttundo assm uma das prmeras barreras contra nfecção. Quando um tecdo é nvaddo por mcroorgansmos, os leucóctos são atraídos para a regão da nvasão, dexando assm os vasos sanguíneos. As hemácas, ou ertróctos, são anucleadas e possuem forma de dsco bcôncavo. Realzam trocas gasosas em todos os tecdos do corpo, levando O 2 para as células e coletando CO 2. Essa troca se dá graças à hemoglobna, uma proteína presente nos ertróctos que confere a estes e a todo o sangue um aspecto avermelhado. A forma bcôncava dos ertróctos proporcona grande superfíce em relação ao volume, o que faclta as trocas de gases. O volume de sangue ocupado pelas hemácas em relação ao sangue total e de 35 a 45% nas mulheres e 40 a 50% nos homens (JUNQUEIRA, 2004). A Fgura 3.6 é uma foto de uma amostra de sangue observada por mcroscopa eletrônca. Durante a vda pré-natal as células sangüíneas são produzdas por alguns órgãos como o fígado e o baço. Após o nascmento é a medula óssea que passa a produzr tas células num processo conhecdo como hemoctopoese, ou hematopoese. A medula óssea é encontrada no canal medular dos ossos longos e nas cavdades dos ossos esponjosos. Nos recém-nascdos toda a medula óssea produz células sangüíneas, fcando assm com uma aparênca avermelhada devdo à hemoglobna presente nos ertróctos, o que lhe confere o nome de medula óssea vermelha. Com o desenvolvmento cronológco do ndvíduo a maor parte da medula dexa de ser atva e adqure uma coloração amarelada devdo ao acúmulo de células adposas, recebendo assm o nome de medula óssea amarela (LORENZI, 1999). Um ndvíduo adulto possu medula óssea vermelha apenas no esterno, na coluna vertebral, nas costelas, nos ossos da pelve e nas extremdades de ossos longos. 22

29 Admte-se que todas as células do sangue dervem de um únco tpo celular da medula óssea, por sso chamado de célula-troco plurpotente. Estas células prolferam e formam duas lnhagens: a das células lnfódes, que va formar os lnfóctos (um dos tpos de leucóctos), e a das células melódes, que orgnam os ertróctos, plaqueta, granulóctos e monóctos (estes dos últmos também são tpos de leucóctos). Leucócto Ertróctos Plaquetas Fgura 3.6 Foto de uma amostra de sangue obtda por mcroscopa eletrônca na qual é possível observar os elementos celulares do sangue. III.2.2 Leucema melóde crônca (LMC) As leucemas, de uma forma geral, são doenças caracterzadas pela prolferação rregular das células formadoras dos leucóctos. As células leucêmcas se desenvolvem às custas das células normas as quas termnam por substtur, levando à defcênca e fnalmente à falênca da medula óssea. A orgem da leucema anda não está precsamente determnada, mas são conhecdos alguns dos fatores que aumentam a suscetbldade a esta doença. Dentre eles estão: a. Radação onzante a comprovação da radação como agente leucêmco veo com a observação do aumento da ncdênca da doença em médcos radologstas e em sobrevventes dos ataques nucleares de Hroshma e Nagasak; 23

30 b. Agentes químcos a exposção prolongada a drogas como cloranfencol, fenlbutazona ou benzeno é normalmente seguda por um lgero aumento na freqüênca de leucema. c. Fatores genétcos a observação de ncdênca de leucema em ndvíduos da mesma famíla chamou a atenção para a relevânca dos fatores genétcos. Notou-se que o gêmeo unvtelno de um pacente leucêmco tem um alto rsco de adqurr a doença. Notou-se também que o rsco de ndvíduos portadores da síndrome de Down adqurr leucema é 30 vezes maor que na população em geral (ZAGO, 2001). Quanto à classfcação as leucemas se dvdem clncamente entre agudas, as quas apresentam evolução abrupta devdo à presença de células maturas, e crôncas, estas de evolução mas amena. Ctomorfologcamente, as leucemas se dvdem em lnfoctáras e melódes, dependendo do grupo de células provenente da dferencação das células-tronco atngdo. A leucema melóde crônca (LMC), forma estudada neste trabalho, é responsável por cerca de 20% de todos os casos de leucema, sendo rara em cranças e acometendo, prncpalmente, adultos jovens. Ela é causada pela translocação cromossomal, gerando assm células melódes anômalas. Apesar desta alteração cromossomal possa ser observada em todas as células melódes, os ertróctos e as plaquetas são essencalmente normas, ao passo que os granulóctos não (OLIVEIRA, 1991). No níco a doença não apresenta sntomas. Os prmeros a se manfestar são: anema, perda de peso, sudorese noturna, fadga e dores ósseas. De ses meses a oto anos após o surgmento da LMC a doença passa para sua fase aguda levando o ndvíduo à morte. O tratamento tem por objetvo dmnur a massa de leucóctos crculante no sangue. Para tal a qumoterapa é o mas ndcado. Em alguns casos o transplante de medula é o procedmento mas ndcado. 24

31 CAPÍTULO IV MATERIAIS E MÉTODOS Neste capítulo serão descrtos todos os componentes físcos e eletrôncos utlzados na aqusção das meddas, além das técncas de preparação das amostras e tratamento dos dados. Todas as meddas expermentas foram realzadas no Laboratóro de Instrumentação Nuclear (LIN), pertencente ao Programa de Engenhara Nuclear da COPPE-UFRJ. IV.1 Arranjo expermental Devdo à varedade de elementos presentes no sangue a tomada de meddas de fluorescênca de raos X fo dvdda em duas etapas agrupando os elementos em duas categoras: a dos elementos de baxo número atômco (P, S, Cl e K) e a dos elementos de alto número atômco (Fe, Cu, Zn, Br e Rb). As meddas foram realzadas utlzando-se dos sstemas expermentas dferentes. Ambos os sstemas eram compostos por um conjunto fonte de almentação-tubo de raos X, por um suporte de PVC onde as pastlhas de sangue loflzado analsadas eram devdamente posconadas e por um detector assocando à sua eletrônca de contagem, sendo este últmo o componente que dferencava os dos sstemas. No sstema usado nas medções de elementos de baxo número atômco, fo utlzado um detector do tpo SI-PIN lgado a um equpamento compacto que contnha todo o sstema necessáro para aplcar ao detector a tensão de almentação e processar o snal provenente dele. No sstema usado para elementos de alto número atômco um detector do tpo S(L) encontrava-se conectado a um BIN que contnha uma fonte de baxa tensão que almentava os demas componentes a ele conectados, uma fonte de alta tensão, utlzada para aplcar a tensão no detector e um amplfcador, utlzado no processamento do snal provenente do pré-amplfcador. Ambos os sstemas foram conectados a uma placa multcanal acoplada a um computador do tpo PC. Os arranjos expermentas podem ser observados na Fgura

32 a Tubo de raos X Eletrônca assocada ao detector Fonte de almentação do tubo de raos X Detector SI-PIN b Suporte de PVC BIN Detector S(L) Fgura 4.1 Sstemas expermentas. A fgura a mostra o sstema utlzado para medr a fluorescênca de raos X dos elementos de baxo número atômco e a fgura b o sstema utlzado para os elementos de alto Z. 26

33 IV.1.1 Conjunto fonte de almentação - tubo de raos X A fonte de almentação do tubo de raos X fo montada no própro LIN. Ela produz uma corrente máxma de 770 µa e uma tensão máxma de 65 kv. O tubo de raos X é de fabrcação Oxford Instruments, modelo TF3500, sére 35919, espessura da janela gual a 0,0127 cm, anodo de tungstêno (W) e potênca máxma suportada pelo anodo gual a 15 W. Os valores de tensão e corrente utlzados foram respectvamente guas a 8 kv e 400 µa, para meddas de elementos de baxo número atômco, e 27 kv e 400 µa, para elementos de alto número atômco. A Fgura 4.2 mostra o tubo de raos X. Fgura 4.2 Tubo de raos X utlzado para provocar fluorescênca nas amostras de sangue. À dreta, a radografa do tubo permte a vsualzação de seus componentes nternos. No caso em que a tensão utlzada fo de 27 kv, além do espectro de bremmstralung, há também a produção de fluorescênca de raos X no anodo devdo à exctação da camada L do tungstêno, como mostrado na Fgura 4.3. IV Os detectores O detector escolhdo para a realzação das meddas de fluorescênca de elementos de alto número atômco era composto por um crstal semcondutor de slíco dopado com líto, S(L). Esta escolha baseou-se na boa efcênca de detecção apresentada por este tpo de detector na faxa de energa de 4 a 30 kev. A tabela 4.1 apresenta as prncpas característcas do detector de S(L) utlzado. 27

34 W L α 3000 W L β Contagens W L γ 1000 Ar K α Energa (kev) Fgura 4.3 Espectro de Raos-X sem fltragem. A fgura mostra o espectro de bremmstralung e os pcos de fluorescênca do tungstêno. Tabela 4.1 Característcas do detector de S(L) utlzado nas meddas de fluorescênca de elementos de alto número atômco. ELEMENTO Fabrcante Modelo CARACTERÍSTICA EG&G ORTEC SLP P Sére 35-T7215 Dâmetro atvo 10 mm Área atva ~80 mm 2 Janela de Be 254 µm Camada de Au 0,02 µm Camada morta de S 0,1 µm Profunddade atva de S Dstânca detector-janela de Be Tensão de operação FWHM em 5,9 kev 5,42 mm 7 mm V 180 ev 28

35 Para a detecção das lnhas de fluorescênca emtdas por elementos de baxo número atômco fo utlzado um detector do tpo SI-PIN por apresentar efcênca para baxas energas melhor que o S(L) dsponível. A tabela 4.2 apresenta as prncpas característcas deste detector. Tabela 4.2 Característcas do detector de SI-PIN utlzado nas meddas de fluorescênca de elementos de baxo número atômco. ELEMENTO CARACTERÍSTICA Fabrcante AMPTEK Modelo XR-100CR Sére N2026 Dâmetro atvo 500 µm Área atva ~6 mm 2 Janela de Be 25 µm FWHM em 5,9 kev 224 ev A Fgura 4.4 mostra ambos os detectores utlzados. a b Fgura Detectores utlzados nas medções. a) Detector SI-PIN usado nas medções de fluorescênca de elementos de baxo número atômco, b) Detector de S(L) usado nas medções de fluorescênca dos elementos de alto número atômco. 29

36 IV.1.3 Suporte de PVC (geometra de medção) A geometra de medção fo fxada por um suporte porta amostra de PVC confecconado no própro LIN (Fgura 4.5). O suporte fo construído de forma que, além de se encaxar no detector e de fxar a amostra, possbltava a troca de colmadores. O fexe emergente fo colmado por um clndro de alumíno com um orfíco central de 12,45±0,05mm de dâmetro (Fgura 4.6). Uma vez que os elementos do sstema de meddas estvessem devdamente posconados, o fexe de raos X ncda sobre a amostra formando um ângulo médo aproxmadamente gual a 16±1 com sua superfíce e os fótons de fluorescênca emergam da amostra e atngam o detector perpendcularmente (Fgura Saída dos raos X Entrada do detector Posção da amostra Fgura 4.5 Suporte porta-amostras de PVC utlzado para fxar a geometra de medda. 4.7). Fgura 4.6 Colmador utlzado nas meddas de fluorescênca em ambos os sstemas. Dâmetro do orfíco gual a 12,45±0,05mm. 30

37 Fgura 4.7 Esquema do sstema expermental (ANJOS, 2000). As dstâncas entre a janela do tubo de raos X e a amostra e entre a amostra e o detector foram guas a 7,6 e 3,5 cm, respectvamente. IV.2 Fltragem da radação A fltragem do espectro de raos X se fez necessára, na stuação em que a tensão de 27kV fo usada, por dos motvos: 1. os elementos analsados neste estudo apresentam concentrações da ordem de parte por mlhão (ppm), sendo assm, os pcos formados no espectro por fótons de fluorescênca provenentes de elementos presentes na amostra em baxa concentração (como cobre e bromo) seram dfclmente observados em meo ao espectro de radação de bremmstralung (Fgura 4.3). 2. com a exctação da camada L do tungstêno, aparecam no espectro pcos com energas: L α = 8,39keV e L β = 9,67keV (Fgura 4.3). Como estes pcos eram muto ntensos, mascaravam os de outros elementos, como o znco (K α = 8,63keV e K β = 9,57keV). 31

38 A Fgura 4.8 mostra o espectro de raos X após ser fltrado. O composto químco utlzado na confecção do fltro fo o óxdo de ttâno IV (TO 2 ). Essa escolha baseou-se nas propredades de absorção de radação do ttâno Contagens Energa (kev) Fgura 4.8 Espectro de raos X após a fltragem. Atenção para a ausênca das lnhas do tungstêno e para o níco do espectro espalhado. Este elemento possu energa de corte gual a 4,97keV. Esta condção e a espessura com que o fltro fo confecconado garantram uma boa absorção dos fótons com energas até cerca de 12keV e pouca absorção daqueles com energa superor a este valor, como pode ser observado na fgura 4.8. O fltro consstu de uma pastlha resultante da compressão de 1000mg de óxdo de ttâno IV em pó envolvda por Mylar (Fgura 4.9). O Fgura 4.9 Fltro de óxdo de ttâno utlzado para endurecer o fexe de raos X. 32

39 produto fnal apresentou dâmetro gual a 10,550 ± 0,005mm e espessura gual a 1,270 ± 0,005mm. IV.3 Amostras de sangue IV.3.1 Coleta das amostras no HEMORIO Este trabalho é fruto de um projeto de cooperação entre o LIN e o Insttuto Estadual de Hematologa Arthur de Squera Cavalcant (HEMORIO), pos, fo nessa nsttução que as amostras tanto de sangue de ndvíduos sados quanto de sangue de portadores de leucema melóde crônca (LMC) foram obtdas. As amostras começaram a ser coletadas logo após a aprovação do projeto pela Comssão Naconal de Étca em Pesqusa CONEP / Conselho Naconal de Saúde / Mnstéro da Saúde que então fo regstrado sob o número 032(04). Foram coletadas 60 amostras de cada um dos grupos estudados (sado e LMC). As amostras de sangue sado foram obtdas de doadores voluntáros com dade entre 18 e 64 anos, que forneceram, consensualmente, uma alíquota de 5ml cada um. As amostras de sangue do outro grupo foram obtdas no ato do exame de sangue dos pacentes. Estes eram abordados e questonados quanto à ntenção de partcpar do trabalho. Uma vez obtdo o consentmento, eram retradas alíquotas de 5ml de sangue, sempre que possível, já que alguns se encontravam muto debltados fscamente. Os pacentes tnham dade entre 18 e 80 anos. O questonáro apresentado aos pacentes encontra-se no apêndce C. IV.3.2 Preparação das amostras A preparação das amostras se deu em duas etapas: uma no HEMORIO e outra no LIN. No HEMORIO as amostras foram coletadas em tubos de ensao a vácuo, sem gel antcoagulante e com gel separador, feto à base de água, da marca Becton Dcknson. Os tubos foram devdamente etquetados e, logo após, centrfugados a 3070rpm por 10mn para que o soro se separasse da parte celular, sendo esta últma a parte estudada neste trabalho (Fgura 4.10). Em seguda foram congelados a aproxmadamente 20 o C (LEITÃO, 2005) e transportados para o LIN. 33

40 Gel Separador Parte Celular do Sangue Fgura 4.10 Amostra de sangue colhda no HEMORIO. A amostra contém apenas o gel separador e a parte celular do sangue. Para que as amostras pudessem ser transformadas em pastlhas, forma que melhor se ajustava ao sstema de medção utlzado, foram loflzadas, trturadas e então compactadas. Esta etapa da preparação se deu no LIN e obedeceu a segunte seqüênca: o sangue, já sem o soro, era descongelado para que pudesse ser retrado do tubo de ensao. Era então depostado em um recpente devdamente lavado com água ultrapura (MILLI-Q) e, em seguda, levado ao loflzador (Fgura 4.11). Fgura 4.11 Amostras no loflzador. 34

41 As amostras permanecam no loflzador por cerca de 48 horas, ou até que estvessem totalmente desdratadas. Posterormente, já loflzadas, eram trturadas utlzando-se um cadnho de porcelana e um pstlo. Uma vez transformada em pó, eram separadas em porções de 400mg que eram compactadas a uma pressão de cerca de 57atm (massa de 12 toneladas sobre uma área de 2,03x10-3 m 2 ) e transformadas nas pastlhas de 2,54cm de dâmetro e de densdade superfcal méda aproxmadamente gual a 0,077±0,015g.cm -2. As dferentes etapas da preparação das amostras podem ser observadas na Fgura a b c d Fgura 4.12 Etapas da preparação das amostras. a) Amostras após o descongelamento, b) resultado da loflzação, c) depos de trturadas e d) compactadas e transformadas em pastlhas. Os nstrumentos utlzados nesta fase da preparação das amostras podem ser observados na Fgura Como as alíquotas de sangue retradas dos doadores eram sempre maores que as retradas dos enfermos, as amostras vndas daqueles, na maora das vezes, davam para fazer duas pastlhas, enquanto as vndas destes, quase nunca. Sendo assm, para que não houvesse apenas uma únca medda, as amostras que não tnham duas pastlhas eram meddas em ambas as faces. 35

42 Cadnho de porcelana Compactador Pstlo Espátula Fgura 4.13 Instrumentação utlzada na preparação das amostras. IV.4 Tratamento das meddas Sendo o objetvo deste trabalho o estudo da comparação entre as concentrações elementares de sangue de ndvíduos leucêmcos e sados, o prmero passo do tratamento dos espectros de fluorescênca de raos X obtdos é, a partr deles, calcular-se tas concentrações. Para tal parte-se da equação I, y = S W [ 1 exp( χ ( E0, E ) ρ M D) ] χ ( E, E ) 0. W = Ou anda, reescrevendo a equação, I,y S 1 exp χ ( E,E ) 0 ( χ ( E,E ) ρ D). 0 M (4.1) Para obter-se W da equação 4.1 é necessáro determnar-se cada um dos fatores que a compõem: o termo I,y representa a ntensdade de fluorescênca produzda na amostra, fator obtdo dretamente do espectro, S é a sensbldade do sstema para a produção e detecção de um fóton de determnada energa provenente de um elemento cuja concentração desejase estudar e o termo entre colchetes representa a absorção sofrda pelos fótons no nteror das amostras. Em seguda descreve-se os processos para a obtenção destes fatores. 36