PRÁTICA 8 MARCADORES MOLECULARES E ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA PCR-ESPECÍFICO DE GENES DE CLOROPLASTO E MITOCÔNDRIA E MICROSSATÉLITES

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1 PRÁTICA 8 MARCADORES MOLECULARES E ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA PCR-ESPECÍFICO DE GENES DE CLOROPLASTO E MITOCÔNDRIA E MICROSSATÉLITES Análise de diversidade genética: De modo geral, os marcadores moleculares podem ser classificados arbitrariamente em três categorias básicas, dependendo, primeiro, se o ensaio emprega ou não a reação em cadeia da polimerase (PCR), e segundo, se os primers utilizados são arbitrários ou específicos para sequências conhecidas: Categoria 1: métodos sem PCR RFLP, VNTR Categoria 2: primers arbitrários ou técnicas de análise de multilocus RAPD, DAMD, AP-PCR, ISSR, DAF, SPARs, AFLP, SAMPL Categoria 3: técnicas de PCR específico sequenciamento, TGGE, DGGE, CAPS, SSCP, STMS Uma forma alternativa de classificar os marcadores moleculares baseia-se no número de cópias da sequência-alvo que produz o polimorfismo. Por exemplo, os RFLPs são marcadores derivados de alterações no tamanho de fragmentos de DNA resultante de variações a nível de sequência de nucleotídeos em regiões não repetitivas, com baixo número de cópias. As sondas muitas vêzes derivam de bibliotecas de cdna, portanto de genes expressos, ou de bibliotecas genômicas selecionadas para sequências com poucas cópias (digestão com PstI sensível a metilação). Por outro lado, reconhece-se que existem algumas regiões do genoma que apresentam mais polimorfismos do que sequências com cópia única, e marcadores moleculares específicos para essas regiões tem sido desenvolvidos. As sequências repetidas em séries em número variável (Variable Number Tandem Repeats, VNTR), encontradas no genoma de plantas adjacentes a sequências de cópia únicas, apresentam um alto nível de polimorfismo, com alelos possuindo um número variável de repetições básicas (Akkaya et al., 1992; Thomas e Scott, 1993; Morgante e Olivieri, 1993). A variação no número de repetições parece originar de "crossing-over" desigual entre cromátides irmãs ou escorregamento ("slippage") da DNA polimerase durante o processo de replicação. De acordo com o tamanho da sequência básica repetida, esses marcadores são classificados em minissatélites (sequência básica repetida de 10 a 45 pares de base) ou microssatélites (sequência repetida de 2, 3 ou 4 bases, tais como AT; ATT; AC, etc), e estão sendo utilizados como marcadores para um ou vários loci (Akkaya

2 et al., 1992; Thomas e Scott, 1993; Morgante e Olivieri, 1993). Uma sonda de oligonucleotídeos homóloga a uma dessa sequências básicas repetidas, quando hibridizada com DNA genômico digerido, revela um complexo de bandas representando vários loci, específica para cada indivíduo ("DNA fingerprinting"). Uma melhor resolução do potencial desse tipo de marcador utiliza as sequências que flanqueiam esses "repeats", que podem ser usados como sonda ou iniciadores em reações de PCR, para amplificar locus específicos ("Single Sequence Repeats, SSR"). A distibuição dos loci parece ser uniforme por todo o genoma. Marcadores de um único locus podem ser obtidos através de sequências disponíveis em banco de sequências e da geração de iniciadores específicos (Akkaya et al., 1992; Morgante e Olivieri, 1993); ou através do isolamento de clones positivos de uma biblioteca genômica após a hibridização com sonda da sequência básica, seguido de sequenciamento dos fragmentos adjacentes a sequência repetida para gerar iniciadores específicos (Thomas e Scott, 1993). A grande desvantagem dos SSR reside no custo de geração das sequências específicas dos iniciadores. Para evitar a necessidade de clonagem e/ou sequenciamento, iniciadores alternativos foram propostos, que utilizam sequências internas dos microssatélites. Genes de Cloroplasto e Mitocôndria: Os vegetais possuem três genomas distintos, e consequentemente possuem três fontes para estudo usando a amplificação de sequências-alvo com PCR. O genoma do cloroplasto (cpdna) é herdado de um progenitor (mais frequentemente do maternal; paternal no caso de gimnospermas) e é encontrado em grande quantidade em folhas. Os genoma do cloroplasto do fumo, arroz e de Marchantia polymorpha já foram totalmente sequenciados, e demonstraram ser altamente conservados em termos de tamanho, estrutura, conteúdo e ordem dos genes, com algumas exceções. Primers universais foram propostos, que funcionam para vários níveis taxonômicos (Demesure et al., 1995). Esses primers têm sido utilizados em estudos de populações. Já o genoma mitocondrial (mtdna) ocorre em menor abundância nas folhas, mais difícil de extrair, e existem menos informações disponíveis sobre esse genoma, com menor número de genes caracterizados com menos primers disponíveis. A alta taxa de rearranjos estruturais e a relativa baixa taxa de mutações pontuais reduz o emprego dessas sequências a nível inter-família e interespecífico. Mas a alta frequência de rearranjos, que pode ser detectado facilmente através de RFLP, torna o mtdna extremamente útil para detectar variabilidade a nível intraespecífico ou a nível de população. Pares de primers universais também foram propostos (Demesure et al., 1995). Em termos de genes nucleares, apenas o gene ribosomial (rdna) tem sido usado extensivamente em estudos de diversidade, conforme foi visto semana passada. Mas a

3 cobertura do genoma é restrita, e pode não representar as variações que ocorrem de modo geral. Poucos genes nucleares alternativos que podem ser empregados a nível inferior a espécie tem sido utilizados e/ou identificados com uma taxa de variação de sequência que diferem entre genomas, mas existe uma tendência de desenolver/identificar tais candidatos (Strand et al., 1997). PCR de genes de cloroplasto e mitocôndria Nesse experimento utilizaremos primers desenhados para amplificar 4 genes de cloroplasto e 1 gene de mitocôndria de acordo com Demesure et al. (1995). Iremos amplificar o DNA das várias espécies que obtivemos DNA (feijão, milho, cacau, fungos e Theobroma). Cada grupo deve preparar uma das 5 misturas principais contendo cada par de primer e distribuiremos para cada amostra de DNA. Cada grupo deve preparar uma planilha de cálculos fornecida. Condições a serem utilizadas para PCR específico dos genes e cpdna e mtdna: 25 ng de DNA molde tampão da enzima 50 mm KCl 0,1% Triton X mm Tris-HCl ph 8,8 1,5 mm MgCl µμ dntps (de cada um datp, dgtp, dctp, e TTP) 0,2 µμ de cada primer específico 1 unidade de Taq polimerase Os primers a serem utilizados são: Mitocôndria nad4 exon 1 5 CAG TGG GTT GGT CTG GTA TG 3 nad4 exon 2 5 TCA TAT GGG CTA CTG AGG GAG 3 fragmento esperado = 1700 pb temperatura de anelamento = 57,5 o C Cloroplasto 1 psbc [psii 44 kd protein] 5 GGT CGT GAC CAA GAA ACC AC 3 trns [trna-ser(uga)] 5 GGT TCG AAT CCC TCT CTC TC 3 fragmento esperado = 1680 pb temperatura de anelamento = 57,0 o C 2 psaa [PSI (P 700 apoprotein A1)] 5 ACT TCT GGT TCC GGC GAA CGA A 3 trns [trna-ser(gga)] 5 AAC CAC TCG GCC ATC TCT CCT A 3

4 fragmento esperado = 3700 pb temperatura de anelamento = 58,0 o C 3 trnh [trna-his (GUG)] 5 ACG GGA ATT GAA CCC GCG CA 3 trnk [trna-lys(uuu)] 5 CCG ACT AGT TCC GGG TTC GA 3 fragmento esperado = 1690 pb temperatura de anealmento = 62,0 o C 4 trnk [trna-lys(uuu) exon 1] 5 GGG TTG CCC GGG ACT CGA AC 3 trnk [trna-lys(uuu) exon 2] 5 CAA CGG TAG AGT ACT CGG CTTTTA 3 fragmento esperado = 2580 pb temperatura de anealmento = 53,5 o C Condições de ciclo de amplificação geral I 1 x Desnaturação a 94 o C 3 minutos II 30 x Desnaturação a 94 o C - 45 segundos Anelamento entre 53,5 a 62 o C 45 segundos Extensão a 72 o C - entre 2-4 minutos III 1 x Extensão a 72 o C 7 minutos O tempo de anelamento depende da composição e tamanho de cada primer (ver folha dos primers). O tempo de extensão deve ser ajustado de acordo com o tamanho do fragmento esperado. Definir a temperatura de anelamento e o tempo de extensão para cada primer. Os produtos deamplificação podem ser visualisados em gel de agarose ou em gel de poliacrilamida. PCR de microssatélites: Nesse experimento utilizaremos como exemplo, primers desenhados para amplificar uma região contendo um microssatélite de Theobroma cacao. Essa sequência de 351 pares de base, possui um microssatélite CT na região marcada: 1 CAGTNTAGNG CAGGGC AGGC TCAGTGAAGC AAAGGAAAAA ACTATTTTAT TCAATCCAAA 61 AGAGGTCCCA CTTCTCCCTC TCTCTCTCTC TCTCTCTCTC TCTCTACATG ATTTTCAACA 121 CTTTGAATTT GGGATCGTTT TCTGGTTGCC CACGTGCACA AAGCAGACAG TCAAAAGCAT 181 CTTGGGGACA CTTTACCTTT CTCCAACTTA TTGTCCCTCC CATTTTTCAC GACTTGTAAG 241 TTGTGAAGAG TAAAACAATA GTGGGCAAAG GTATGTGTAT CTCTTGAAGG AAAAAGAGTA 301 CGGCAGGAAG AAAGAGATGA GAGTTTGGTA GTGGAAGGAG AGCAGAGCAG G Iremos amplificar o DNA de vários genótipos de cacau e controles com DNA não específico (feijão, milho, laranja, fumo). Iremos fazer apenas um mix geral.

5 Condições a serem utilizadas para PCR específico do microssatélite: 25 ng de DNA molde tampão da enzima 50 mm KCl 0,1% Triton X mm Tris-HCl ph 8,8 1,5 mm MgCl µμ dntps (de cada um datp, dgtp, dctp, e TTP) 0,2 µμ de cada primer específico 1 unidade de Taq polimerase Os primers a serem utilizados são: TCCT F 5 AGG CTC AGT GAA GCA AAG GA 3 TCCT R 5 TGG GAG GGA CAA TAA GTT GG 3 fragmento esperado = 214 pb temperatura de anelamento = 60 o C Condições de ciclo de amplificação geral I 1 x Desnaturação a 94 o C 3 minutos II 30 x Desnaturação a 94 o C - 30 segundos Anelamento entre 60 o C 60 segundos Extensão a 72 o C 60 segundos III 1 x Extensão a 72 o C 7 minutos

6 AFLP O DNA deve ser digerido com duas enzimas de restrição, sendo uma de corte frequente (sítio de reconhecimento de 4 bases) e outra de corte raro (sítio de reconhecimento de 6 bases). Os kits comerciais empregam as enzimas de restrição EcoRI e MseI simultaneamente, seguido da ligação com os adaptadores específicos. Ver instruções do manual técnico do kit da Life Technologies "AFLP Analysis System I" (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA). Os DNAs digeridos e ligados ao adaptadores são utilizados em reações de pré-amplificação, utilizando primer com uma base seletiva para cada sítio de restrição nas condições sugeridas no manual técnico do kit. Os produtos pré-amplificados são então diluídos e, então utilizados para as diversas reações de amplificação seletiva, com as 64 combinações possíveis de primers específicos para os sítios de EcoRI e MseI. As amplificações são conduzidas em termociclador (ex. GeneAmp PCR System 9700), programado com 13 ciclos de 30 s a 94 o C, 30 s a 65 o C, com decréscimo gradual 0,7ºC por ciclo, até atingir 56ºC, e 60 s a 72ºC, seguido de 23 ciclos 30 s a 94 o C, 30 s a 56 o C e 60 s a 72 o C. Os produtos das amplificações podem ser analisados em gel de acrilamida 6% em tampão TBE (89 mm Tris-base; 2 mm EDTA; 89 mm ácido bórico), correndo a 6 V cm -1 por cerca de 4 h, sendo as bandas visualizadas por coloração com prata de acordo com protocolo de Sanguinetti et al. (1994). Para alguns casos, é possível visualizar os fragmentos com coloração com brometo de etídeo. Sugere-se a utilziação de separação dos produtos em gel d poliacrilamida desnaturante. Digestão: Reação Tampão 5x (kit Gibco) 5 µl EcoRI 0,3 µl HpaII 0,3 µl dh 2 O mq 9,4 µl DNA (25 ng µl) 10 µl TOTAL 25 µl Incubar a 37ºC por 2 a 3 horas Inativar as enzimas a 70ºC por 15 minutos e dar choque em gelo Ligação Estoque Reação Adaptador EcoRI 5 µm 1 µl Adaptador HpaII 50 µm 1 µl ATP 10 mm 1 µl

7 Tampão 5x (kit Gibco) 5 µl T4 DNA ligase 1 µl dh 2 O mq 16 µl TOTAL 25 µl 25 µl de mix a cada amostra já digerida, num volume final de 50 µl e incubar a 20ºC por 2 horas Após a ligação fazer uma diluição1:10 em TE. Reação de Pré-Amplificação Estoque Reação Volume 1 reação dntps 10 mm 200 µμ 1,02 µl Primer EcoRI 9,2 µm 0,1 µμ 0,55 µl Primer HpaII 8,67 µm 0,1 µμ 0,6 µl Tampão 10x (kit Gibco) 10 X 1 x 5,1 µl dh 2 O mq 38,13 µl Taq polimerase 0,6 µl DNA diluído 5 µl TOTAL 51 µl Reação de Amplificação Estoque Reação Volume 1 reação dntps 10 mm 100 µμ 1,02 µl Primer EcoRI 27,8 ng/µl 0,5 µl Primer HpaII 6,7 ng/µl 0,1 µμ 0,6 µl Tampão 10x 10 X 1 x 2,0 µl dh 2 O mq 7,3 µl Taq polimerase 0,5 µl DNA pré-amplifiado 5 µl TOTAL 20 µl

8 GEL DE ACRILAMIDA PARA DNA Usado para separação de fragmentos amplificados de microssatélites, AFLP, CAPS, sequenciamento etc. Preparar solução de 30% de acrilamida. ATENÇÃO ACRILAMIDA É TÓXICA E DEVE SER MANIPULADA COM CUIDADO. USAR LUVAS E MÁSCARA ATÉ A POLIMERIZAÇÃO. Solução 30% de acrilamida TÓXICO POTENTE NEUROTOXINA Acrilamida 29 g N,N metilenebisacrilamida 1 g H 2 O para 100 ml Aquecer a 37 o C para dissolver Manter a solução sob penumbra (evitar luz direta) 5 x TBE H 2 O mq 700 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 20 ml Tris Base 54 g Ácido Bórico 27,5 g Completar o volume para 1 litro de água Usar 1 x TBE com ph aproximado de 8,3 para Gel de Acrilamida. Soluções concentradas (5x) de TBE formam um precipitado quando são armazenadas por longos períodos. Para evitar problemas, armazena-se o estoque 5 x TBE em garrafas de vidro à temperatura ambiente e descarte soluções com precipitado. Originalmente, TBE era utilizado na concentração de 1 x (isto é uma diluição de 1:5 do estoque concentrado) para gel de agarose. Entretanto, a concentração de 0,5 x provê poder tampão mais que suficiente, hoje em dia utiliza-se eletroforese em gel de agarose a 0,5 x de TBE (diluição 1:10). Para géis de acrilamida, usa-se a concentraçãod e trabalho de 1 x. O reservatório de tampão superior de cubas verticais usdas para géis de acrilamida são pequenso e a quantidade de corrente que passa através do gel é cosniderável, requerendo TBE 1x para ter pdoer tampão suficiente. Persulfato de Amônia: fazer fresco no dia 50 mg/500 µl

9 PROTOCOLO DE GEL NÃO-DESNATURANTE: Gel de Poliacrilamida gel Protean pequeno 6 % H 2 O mq 9 ml Acrilamida 30% 3 ml TBE 5X 3 ml Persulfato de Amônia 10% 80 µl TEMED 40 µl TOTAL 15 ml Gel de Poliacrilamida gel Protean grande 6 % 6 % 9% H 2 O mq 30 ml 18 ml 15 ml Acrilamida 30% 10 ml 6 ml 9 ml TBE 5X 10 ml 6 ml 6 ml Persulfato de Amônia 10% 210 µl 150 µl 100 µl TEMED 82 µl 50 µl 50 µl TOTAL 50 ml 30 ml 30 ml A solução de acrilamida é solidifcada pela polimerização devido a adição de TEMED e de persulfato de amonia. Após a solidificação, carregar normalmente empregando um tampão de carregamento com azul de bromofenol. Correr o gel a 120 V por 4 horas para AFLP. PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE: Eletroforese em cuba de sequenciamento: Tratamento das placas de vidro para facilitar a manipulação e coloração do gel: As placas de vidro devem ser tratadas, sendo a maior (42 x 42 cm) com 1 ml de Repel Plus One (. Após a secagem, o excesso do produto deve ser retirado com lenço de papel umedecido em água destilada. A outra placa de vidro (menor) de 39 x 42 cm deve receber solução de 4 µl de Bind Silane PlusOne em 1 ml de 0,5% ácido acético em 95% etanol. Após secagem, o excesso deve ser retirado com lenço de papel umedecido em etanol 95%. Preparo do gel: O gel de poliacrilamida 6% em 1x TBE 1X, e 7 M uréia, 10% persulfato de amônia, Temed é preparado na seguinte proporção. Solução 30% de acrilamida TÓXICO POTENTE NEUROTOXINA

10 Acrilamida Bis N,N metilenebisacrilamida H 2 O para 100 ml 29 g 1 g Solução de acrilamida e 7 M urea em TBE para gel de sequenciamento Solução de Acrilamida 30% TBE 5 x Urea 100 ml 100 ml 210 g H 2 O para 500ml Gel de Poliacrilamida de Sequenciamento 6 % 6% Solução de Gel (Acrilamida com urea 7 M) 50 ml 70 ml Persulfato de Amônia 10% 200 µl 250 µl TEMED 84 µl 100 µl TOTAL 50 ml 70 ml (gel 0.2 mm) (0.5 mm) Carregar no gel com cuidado de modo a evitar a formação de bolhas. A espessura do gel é de 0,2 a 0,5 mm! Preparo das amostras: adicionar nas amostras de PCR antes de carregar no gel, um volume na proporção de 1:1/2 de tampão de carregamento (95% formamida, 0,05% xylene cyanol, 0,05% bromophenol blue, 12,5% sacarose, 10mM NaOH). Adicionar 7 µl de tampão de carregamento em 10 µl de reação de PCR. As amostras são desnaturadas a 94 o C por 5 minutos e mantidos em gelo até o carregamento. Eletroforese: Pré-corrida: 65 W por 40 a 60 minutos (até aquecer o gel a 50-55ºC); Corrida: W em tampão 1 x TBE por 2 horas para AFLP e 1 hora e 50 minutos para microssatélite.

11 Coloração de Prata Silver Staining baseado em Sanguinetti et al., (1994) 1 solução fixadora 10% etanol, 0,5 % ácido acético por 3 minutos 2 solução fixadora + 0,2% de nitrato de prata (2 g/l) por 5 minutos 3 Lavar uma vez, por 20 segundos e 1 vez por 1 minuto em água mq 4 solução reveladora (3% NaOH + 0,5% formaldeído) até aparecer bandas (cerca 5 minutos) 5 solução fixadora pro 5 minutos 6- H 2 O por 10 minutos Solução Fixadora (500 ml) 50 ml etanol 2,5 ml de ácido acético glacial 447,5 ml de H 2 O mq Solução Fixadora + Prata (250 ml) 25 ml de etanol 1,25 ml de ácido acético 223,7 ml H 2 O mq 0,5 g de AgNO 3 (prata) - adicionar por último Solução Reveladora 7,5 g NaOH 248,75 ml de H 2 O mq 1,25 ml de formaldeído colocar por último Tampão de Carregamento da Amostra - usar LB feito com TE ou 0,25% Bromophenol Blue 0,25% Xyleno cyanol 15% Ficoll

12 COLORAÇÃO COM PRATA - PROTOCOLO DE CRESTE ET AL. (2001) Solução fixadora I: 10% Etanol; 1% ácido acético por 10 minutos, seguida de 1 lavagem em água. Solução fixadora II: 1% ácido nítrico por 3 minutos, seguido de 2 lavagens em água. Solução de Nitrato de Prata: 2g/litro de AgNO 3 por 20 minutos, seguido de 2 lavagens em água. Solução reveladora: 30g/litro de Na 2 CO 3, 540 µl de formaldeído/litro, por 3 a 5 minutos. Solução bloqueadora: ácido acético 5%

13 Referências: Akkaya, M.S., A.A. Bhagwat e P.B. Cregan Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132: Bassam, B.J., G.Caetano-Anollés e P. Gresshoff. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 196: Beidler, J.L., P.R. Hilliard e R.L. Rill Ultrasensitive staining of nucleic acids with silver. Analytical Biochemistry 126: Creste, S., Tulmann Neto, A. e A. Figueira Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter 19:1-8. Demesure, B., N. Sodzi e R.J. Petit A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Mol. Ecol. 4: Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, e T. Hodgkin Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI Tech. Bul. 2. International Plant Genetic Resources Institute, Roma, Itália. Morgante, M. E A.M. Olivieri PCR-amplified microsattelites as markers in plant genetics. The Plant J. 3: Sanguinetti, C.J., E.D> Neto e A.J.G. Simpson Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrulamide gels. Biotechniques 17(5): Strand A.E., J. Leebens-Mack e B.G. Milligan Nuclear DNA-based markers for plant evolutionary biology. Mol. Ecol. 6: Thomas, M.R. e N.S. Scott. Microsattelite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites. Theor. Appl. Genet. 86: