IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE MIRU (MYCOBACTERIAL INTERSPERSED REPETITIVE UNITS) PARA CARACTERIZAR MOLECULARMENTE Mycobacterium tuberculosis

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1 IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE MIRU (MYCOBACTERIAL INTERSPERSED REPETITIVE UNITS) PARA CARACTERIZAR MOLECULARMENTE Mycobacterium tuberculosis Natália Sanches Xavier (PIBIC/CNPq-FA-UEM), Rosilene Fressatti Cardoso (Orientador), Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Análises Clínicas e Biomedicina/Maringá, PR. Ciências da Saúde Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, MIRU, Epidemiologia. Resumo: Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU) é uma técnica específica para caracterização molecular do Complexo Mycobacterium tuberculosis. Neste sentido, o objetivo do presente projeto foi implantar o método de MIRU para caracterizar molecularmente M. tuberculosis isolados de culturas de escarros de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC), referência da 15ª Regional de Saúde de Maringá, Paraná. MIRU-VNTR foi realizado em 84 isolados clínicos de M. tuberculosis e um total de 67 perfis distintos de MIRU foram obtidos, com 58 (69.0%) isolados que eram órfãos e os 26 (31.0%) remanescentes foram incluídos em nove clusters compostos de dois a seis isolados cada um. Os dados indicam que a tuberculose desenvolve predominantemente por reativação de infecções latentes nesta população estudada. Introdução Mycobacterium tuberculosis é o principal agente causador da tuberculose (TB), uma doença responsável por 26% dos óbitos possivelmente evitáveis no mundo (1, 2). IS61 Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) foi adotado como método padrão para tipagem molecular de M. tuberculosis, por ser altamente discriminatório. Entretanto, apesar de ser 0% reprodutível, apresentar alto grau de discriminação e especificidade, a mesma é trabalhosa, necessitando de pessoal altamente qualificado para a realização do ensaio (3). Tendo em vista essa problemática, métodos baseados em mini-satélites que contém números variáveis de repetições em sequências ( Variable Numbers of Tandem Repeats VNTRs) foram demonstrados ser efetivos para tipagem de M. tuberculosis (4). A técnica denominada MIRU ( Mycobacterial Interspersed Repetitive Units ), baseada na análise de sequências homólogas de 46-0pb de DNA se repetem sequencialmente (tandem repeats) e estão dispersas em regiões intergênicas no genoma de M. tuberculosis (5). MIRU consiste em um sistema altamente reprodutível e rápido, e possibilita uma comparação entre

2 linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais (5) de forma semelhante à técnica de RFLP sendo, no entanto, de execução mais fácil. Este tipo de abordagem torna possível maior número de análises e identificação de mais focos de contágio na população. O presente estudo teve como objetivo implantar a técnica MIRU para caracterizar molecularmente M. tuberculosis isolados de cultura de escarros de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC). Materiais e métodos Amostras bacterianas Os isolados de M. tuberculosis utilizados no presente estudo foram provenientes da micobacterioteca do setor de Bacteriologia Clínica do Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC)/DAC/UEM. Extração do DNA micobacteriano Os DNAs cromossômicos dos isolados de M. tuberculosis em Lowenstein- Jensen foram extraídos utilizando a técnica descrita por GONZALEZ- MERCHAND et al. (1996). Foi empregada solução de lise Cloridrato de Guanidina 6M e purificação fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), e em seguida com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Os DNAs foram precipitados com etanol absoluto, lavados com etanol 70%, secos ao ar e reconstituído em 0µl de tampão TE (Tris-HCl mm; EDTA 1mM, ph 8,0). A integridade das amostras de DNAs foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris-HCl 90mM, ácido bórico 90mM e EDTA 2mM) a 0 Volts, por 30 minutos. MIRU-VNTR Os isolados foram genotipados pela amplificação utilizando os 12 MIRU- VNTR loci (2, 4,, 16,, 23, 24, 26, 27, 31, 39, e ) (5) em termocicladora TC-512 (Techne, UK). Cada locus foi amplificado com 2 µl de DNA micobacteriano em 23 µl mistura contendo 0.4 µm de cada respectivo primer e PCR Master Mix (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA). As condições de amplificações para cada par de primers foram descritas por Supply et al. (00) (Quadro). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em agarose (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil) 2.0%. Marcadores de peso moleculares de 50 e 0-bp (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil) foram usados para determinação do tamanho do produto da PCR. Os géis foram corados com brometo de etídio e fotodocumentados em câmera Digital Power Shot S215 (Cannon, NY, USA). O tamanho dos produtos da PCR foi determinado por comparação visual com os marcadores moleculares. Resultados de cada um dos 12 loci foram combinados para criar um perfil de 12 dígitos para cada isolado micobacteriano. O software BioNumerics (versão 4.45; Applied Maths, Sint- Martens-Latem, Belgium) foi usado para análise dos padrões de MIRU-

3 VNTR. O Dendrograma e a distância genética foram construídos empregando algorítimo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean; Sneath and Sokal 1973). Quadro. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores dos 12 loci de MIRU. Locus de MIRU Identificação 2F 2R 4F 4R F R 16F 16R F R 23F 23R 24F 24R 26F 26R 27F 27R 31F 31R 39F 39R F R Resultados e Discussão Sequência de oligonucleotídeos TGGAACTTGCAGCAATGGACCAACT TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT GCGCGAGAGCCCGAACTGGC GCGCAGCAGAAACGTCAGC GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA CATAGGCGACCAGGCGAATAG TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA GTGCCGACGTGGTCTTAGT CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT GGGTTGCTGGATGACAACGTGT GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA Temperatura de hibridização 60ºC 50 ºC 50 ºC MIRU-VNTR foi realizado em 84 isolados clínicos de M. tuberculosis e um total de 67 perfis distintos de MIRU foram obtidos, com 58 (69.0%) isolados que eram órfãos e os 26 (31.0%) remanescentes foram incluídos em nove clusters compostos de dois a seis isolados cada um (Fig.). Análise do polimorfismo usando os 12 loci de MIRU revelou que o locus foi o mais discriminatório com oito alelos, seguido pelos loci 23, e 16. No locus a presença de três alelos foi o mais frequente seguido de cópia única. Os loci, 26 e 31 foram moderadamente discriminantes. Outros loci foram menos polimórficos com dois alelos nos loci 4, e 39 e somente um alelo no locus 24, onde uma única cópia estava presente em todos os 84 isolados de M. tuberculosis analisados. O presente estudo oferece os primeiros dados sobre a diversidade genética de isolados clínicos de M. tuberculosis isolados de pacientes com TB em cidades da região Noroeste do Estado do Paraná.

4 Pearson correlation MIRU Figura. Análise de 84 isolados clínicos de M. tuberculosis de Maringá e outras cidades do Noroeste do Estado do Paraná, Brasil, utilizando MIRU-VNTR. Conclusões A técnica foi implantada com sucesso e os dados indicam que a tuberculose desenvolve predominantemente por reativação de infecções latentes nesta população estudada. Nossos resultados encorajam que estudos adicionais em nossa região sejam realizados. Referências 1. Bloom, B.R.; Murray, C.J.L. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science. 1992, 257: Raviglione, M.C.; Snider, D.E.J.; Kochi, A. Global epidemiology of tuberculosis. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 1995, 273:

5 3. Pandolfi, J.R.C. Otimização da técnica de MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) para o estudo epidemiológico de paciente com tuberculose.tese de Doutorado, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, Kanduma, E.; McHugh, T.D.; Gillespie, S.H. Molecular methods for Mycobacterium tuberculosis strain typing: a users guide. J. Appl. Microbiol. 03, 94: Supply, P.; Mazars, E.; Lesjean, S.; Vincent, V.; Gicquel, B.; Locht, C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome. Mol. Microbiol. 00, 36(3): Gonzalez-Merchand, J.A.; Estrada-Garcia, I.; Colston, M.J.; Cox, R.A. A novel method for the isolation of mycobacterial DNA. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 135: