IDENTIFICAÇÃO DAS VARIAÇÕES ALÉLICAS DE Saccharomyces cerevisiae NA FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL

Transcrição

1 IDENTIFICAÇÃO DAS VARIAÇÕES ALÉLICAS DE Saccharomyces cerevisiae NA FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL Silva, A.C.P (1). Leite, A.L (1) ; Santos, F. J. A. L (1) ; Lima, M. C. S (1) ; Neto, A. G. B. N (2,3) ; Brasileiro, B. T. R. V (1,3) alinepereira.biolog@gmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, CNPq; (2) Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife - PE, Brasil; (3) Genetech Bioprodutividade, Recife - PE, Brasil. RESUMO A possibilidade de eventos de recombinação genética em leveduras industriais desperta para a necessidade de um melhor entendimento de padrões de segregação genética aberrantes das inter regiões entre repetições de microssatélites presentes. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar o padrão de segregação meiótica de linhagens industriais de S. cerevisiae do processo de fermentação para a produção de álcool combustível por destilarias do nordeste brasileiro através de perfis genéticos obtidos pela amplificação com marcadores moleculares. As amostras de linhagens haplóides foram submetidas à análise do padrão de segregação genética utilizando os iniciadores (GTG) 5 para a região ISSR. Os resultados que têm sido publicados sobre a caracterização da população de S. cerevisiae em vários processos fermentativos mostram uma diversidade maior do que a esperada. O iniciador (GTG) 5 é capaz de distinguir os estados homozigotos e heterozigotos destas linhagens e se tornou possível identificar o padrão de segregação dos fragmentos gerados. A identificação e caracterização das variações alélicas que controlam características relevantes para fermentação industrial fornecem a base para uma abordagem genética possibilitando melhorar a performance fermentativa das leveduras industriais, identificando os genes alvo para otimização via engenharia genômica. Palavras-chave: Fermentação Alcoólica; Marcador (GTG) 5 ; Linhagens Haplóides.

2 INTRODUÇÃO O etanol é uma fonte de energia renovável e considerada como uma boa alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais (CASTANHEIRA, 2013). No Brasil, a levedura Saccharomyces cerevisiae é utilizada em grande escala para a produção de etanol combustível através da fermentação de mostos (caldo-de-cana e/ou melaço) a partir de matérias-primas à base de cana de açúcar, sendo um exemplo de sucesso de bioprocessos, que proporciona um biocombustível avançado, a preços competitivos e de baixo impacto ambiental (DÁRIO, 2012; CASTANHEIRA, 2013). Quando o fermento é submetido a um tratamento ácido (ácido sulfúrico 2N) antes de ser submetido a uma nova fermentação pode comprometer a viabilidade das células e consequentemente, provocar uma queda no rendimento da fermentação (BROSNAN et al., 2000, BASSO et al., 2008). Uma das explicações possíveis seria o aumento do polimorfismo individual em decorrência de eventos recombinacionais que modificariam o padrão de fragmentos amplificados. Ao longo das últimas décadas, algumas leveduras selvagens de S. cerevisiae foram isoladas, identificadas, caracterizadas e, eventualmente, reintroduzidas 2

3 no processo, permitindo-nos a construir o conhecimento sobre esses organismos (DELLA-BIANCA, et al., 2013; DÁRIO, 2012). A possibilidade de eventos de recombinação genética em leveduras industriais desperta para necessidade de um melhor entendimento de padrões de segregação genética aberrantes das inter regiões entre repetições de microssatélites presentes nesses micro-organismos. Tendo em vista a direta influência desses rearranjos genéticos aberrantes no discernimento das diferentes linhagens pelo marcador (GTG) 5, é importante identificar analisar o padrão de segregação meiótica dos fragmentos de linhagens industriais haplóides P1 e P25 de S. cerevisiae utilizando o marcador ISSR e saber como esses eventos de recombinação podem interferir nos procedimentos de tipagem genética. MATERIAL E MÉTODOS Micro-organismos As amostras de linhagens haploides foram provenientes de esporos de oito tétrades da linhagem parental P25 e de três tétrades da linhagem parental P1 da Coleção de Culturas do Laboratório de Genética do Curso de Ciências Biológicas da Universidade Católica de Pernambuco, Recife - PE. 3

4 Extração do DNA O processo de extração do DNA nuclear foi realizado pelo método descrito por Silva-Filho et al. (2005). Para quantificação, a amostra foi diluída 1:200 e levada ao espectofotômetro a 260 nm de comprimento de onda, utilizando a relação 1D.O= 50 µg/ml (SAMBROOK et al., 1989). O DNA extraído foi armazenado a 20ºC até o momento do uso. Técnica Molecular As análises de DNA-fingerprinting e ribotipagem por PCR foram feitas segundo Silva-Filho et al. (2005b) e Liberal et al. (2007). As reações de amplificação por PCR fingerprinting da região ISSR com o iniciador (GTG) 5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') e por PCR-RAPD foram realizadas no volume final de 25 µl nas seguintes condições: tampão de PCR 10X (Tris-HCl 20mM ph 8.4; KCl 50mM), MgCl 2 1.5mM, BSA (Soro albumina bovina) 0,25µg/µL, dntp 0.2mM, cada iniciador 12.5 pmols, Taq DNA polimerase 1.25 U (Operon Technologies CA), DNA 50 ng. A amplificação foi programada para realizar uma desnaturação inicial de 6 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos para desnaturação a 94ºC por 20 segundos, pareamento a 53ºC por 20 segundos, extensão a 72ºC por 60 segundos e finalmente, 5 minutos a 72º C para extensão final. 4

5 Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1.3% a 7,5 volts/cm por 90 minutos em tampão TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA) utilizando-se o marcador de peso molecular de 100-bp (Invitrogen Life Technologies), corados em brometo de etidio TBE 1X / EtBr 0,5 µg/ml (SAMBROOK et al., 1989), visualizados em transiluminador de luz U.V e fotografados em sistema de fotodocumentação Photocapt para posterior análise no programa Photocapture. RESULTADOS E DISCUSSÃO SILVA-FILHO et al. (2005a) caracterizou a dinâmica das populações de leveduras ao longo do período de fermentação em seis destilarias do Brasil, usando a sequência nucleotídica (GTG) 5 como iniciador. Este estudo permitiu o isolamento e caracterização de linhagens dominantes de S. cerevisiae que podem ser comercializadas como fermento para destilarias de álcool combustível (SILVA-FILHO et al., 2005b). Os resultados que têm sido publicados sobre a caracterização da população de S. cerevisiae em vários processos fermentativos mostram uma diversidade maior do que a esperada. Existem três possíveis explicações para este fato: 1) a entrada de células de diferentes linhagens no processo industrial, 2) a multiplicação diferencial das células das diferentes linhagens em momentos distintos dos processos ou 3) 5

6 variação genética ocorrendo no genoma das células pré-existentes que geram novas combinações reveladas pelos marcadores, seguidos de multiplicação diferencial das células das diferentes variantes. Caso esta terceira alternativa seja verdadeira, o uso destes marcadores de tipagem pode ficar comprometido, assim como ocorre para as variações cromossômicas que aportam certo grau de incerteza à técnica de cariotipagem para análise de rotina da dinâmica populacional de leveduras nos processos industriais. Desta forma, foi necessário se calcular as taxas de variação destas marcas ou mesmo estudar o padrão de segregação de algumas delas para se calcular o quanto eventos de recombinação e segregação meiótica podem afetar os padrões de tipagem das linhagens industriais. A linhagem P25 foi identificada pela presença dos fragmentos comuns que caracterizam a espécie S. cerevisiae, tais como de 3100 pb, 2200 pb, 1500 pb, 1450 pb, 1300 pb, 1080 pb, 1050 bp, 980 pb e 650 pb, e pela presença dos fragmentos polimórficos de 2800 pb e 750 pb (Figura 2; SILVA-FILHO et al., 2005a). A linhagem P1 foi identificada pela presença dos fragmentos comuns que caracterizam a espécie S. cerevisiae, tais como os fragmentos de 3100 pb, 2200 pb, 1500 pb, 1450 pb, 1300 pb, 1080 pb, 1050 bp, 980 pb e 650 pb, e pela presença dos fragmentos polimórficas de 2500 pb e 750 pb (Figura 2; SILVA- FILHO et al., 2005a). 6

7 As células da linhagem P25 apresentam uma taxa de esporulação normal com tétrades completas. Os produtos de segregação desta linhagem foram analisados e pode-se observar a presença de todos os fragmentos espécie-específicas citadas. Além disso, os resultados mostraram a segregação na proporção de 2:2 para cada uma dos fragmentos polimórficos, indicando que a linhagem P25 é heterozigota em relação às bandas de 2800 pb e 750 pb (Figura 1). Como mostrado na tabela 1, dentre as 8 tétrades analisadas, 3 apresentaram a proporção gamética de 1:1:1:1 (Figura 1), sugerindo-se que os locos correspondentes a estes fragmentos devem se localizar em cromossomos distintos. Porém, as linhagens provenientes das tétrades 1 e 2 apresentaram ligação na segregação dos fragmentos. As células da linhagem P1 apresentam uma taxa de esporulação menor do que a da linhagem P25 e produz a maioria dos ascos com apenas três ascosporos, indicando a presença de aneuploidia para pelo menos um dos 16 pares de cromossomos homólogos. Neste trabalho, apenas as tétrades completas foram analisadas e nos produtos de segregação desta linhagem pode ser observada a presença de todos os fragmentos espécie-específicas citados acima. Os resultados de tipagem com o iniciador (GTG) 5 mostraram que esta linhagem é homozigota em relação os dois fragmentos marcadores de 2500 pb e 750 bp (Tabela 2). 7

8 Isto mostra que este marcador é capaz de distinguir os estados homozigotos e heterozigotos destas linhagens. Figura 1. Padrão de amplificação do DNA com o iniciador (GTG) 5 de quatro linhagens haplóides derivadas da linhagem parental P25. A: linhagem 13A; B: linhagem 13B; C: linhagem 13C; D: linhagem 13D. Os fragmentos polimórficos de 2800 pb e 750 pb estão apontados. A análise das proporções gaméticas da linhagem P25 nas diferentes tétrades levanta duas hipóteses para o padrão de segregação dos marcadores 2800 pb e 750 pb. A primeira sugere que os dois marcadores estariam ligados no mesmo cromossomo na configuração cis (tétrades 1 e 2) ou trans (tétrade 3), mas a uma distância genética em torno de 50 cm que permite uma alta taxa de aparecimentos das formas recombinantes (tétrades 5, 9, 12, 13 e 14). A segunda hipótese é que os genes se encontram em cromossomos distintos, a partir da observação das tétrades que apresentam o padrão Mendeliano de segregação 8

9 esperado para genes não-ligados (tétrades 12, 13 e 14). A análise global das proporções para os quatro arranjos alélicos possíveis revela uma leve distorção das proporções para a configuração de ligação em cis. Entretanto, a aplicação do teste estatístico do qui-quadrado indica que a segunda hipótese parece a mais aceitável, de que os genes estão localizados em cromossomos diferentes. Além disso, as proporções gaméticas das tétrades 5 e 9 sugerem um evento de conversão gênica que converte o alelo no alelo Tabela 1. Composição gamética das linhagens haplóides derivadas da linhagem industrial P25 quanto à presença ou ausência dos fragmentos de DNA de 2800 pb e 750 pb geradas pela amplificação com o iniciador (GTG) 5. (A = presença de 2800, a = ausência de 2800, B = presença de 750, b = ausência de 750). TÉTRADE FRAGMENTOS DE DNA (pb) Proporção Esporo A Esporo B Esporo C Esporo D Gamética AB: 0Ab: 0aB: 2ab AB: 0Ab: 0aB: 2ab AB: 2Ab: 2aB: 0ab AB: 0Ab: 2aB: 0ab AB: 0Ab: 2aB: 0ab AB: 1Ab: 1aB: 1ab AB: 1Ab: 1aB: 1ab AB: 1Ab: 1aB: 1ab TOTAL 11AB: 5Ab: 9aB: 7ab 9

10 Tabela 2. Composição gamética das linhagens haploides derivadas da linhagem industrial P1quanto a presença ou ausência das bandas de 2500 pb e 750 pb geradas pela amplificação com o iniciador (GTG) 5. (A = presença de 2800, a =ausência de 2800, B = presença de 750, b =ausência de 750). TÉTRADE FRAGMENTOS DE DNA (pb) PROPORÇÃO Esporo A Esporo B Esporo C Esporo D GAMÉTICA AB: 0Ab: 0aB: 2ab AB: 0Ab: 0aB: 2ab AB: 2Ab: 2aB: 0ab TOTAL 4AB: 2Ab: 2aB: 4ab CONCLUSÃO Com este trabalho tornou-se possível identificar o padrão de segregação dos fragmentos gerados pela amplificação do DNA de linhagens haplóides de S. cerevisiae com o iniciador (GTG) 5. Adicionalmente, estes resultados mostram que estes loci podem se encontrar tanto no estado homozigoto como no estado heterozigoto. Isto demonstra que esses fragmentos apresentam um padrão Mendeliano de segregação e que podem ser considerados alelos de um determinado locus cromossômico. O estado heterozigoto foi mostrado pelo aparecimento na progênie de descendentes que não apresentavam os fragmentos de 2800 bp ou 750 pb, a despeito do seu parental apresentar amplificação destes fragmentos, assim, o caráter presença de fragmento é conferido pela presença do alelo considerado dominante e que a ausência de 10

11 fragmento corresponde à presença do alelo recessivo. Também foi possível mostrar a ocorrência de eventos de recombinação recíproca e não recíproca ocorrendo entre os dois alelos definidos pela amplificação do fragmento de comprimento correspondente. A linhagem industrial P25 foi então identificada como sendo heterozigota para os dois fragmentos, cujos loci devem estar situados em cromossomos diferentes. Por outro lado, a linhagem P1 mostrou-se homozigota para os loci correspondentes aos dois fragmentos marcadores. No trabalho de Silva-Filho et al. (2005b; 2005c; Figura 5) mostrou que o padrão de fragmentos gerados pelo iniciador (GTG) 5 é útil na tipagem e discriminação de linhagens de S. cerevisiae, exatamente, pela presença ou ausência de fragmentos polimórficos para mais de 900 linhagens de S. cerevisiae, dentre linhagens de coleção, linhagens comerciais e isolados industriais. Nota-se, por exemplo, a ausência nas linhagens P4, P4a, P5, P15, P15a e P20 do fragmento de 750 bp. Assumindo que estas linhagens são diplóides, mesmo com alguma aneuploidia, os resultados apresentados no presente trabalho podem concluir que estas linhagens são homozigotas para o alelo recessivo (750 - /750 - ). 11

12 Pb Figura 2. Eletroferograma de 16 perfis de amplificação gerados pelo iniciador (GTG) 5 a partir da amplificação do DNA de S. cerevisiae isoladas de uma destilaria de álcool combustível. Os perfis P21 e P22 correspondem ao de duas leveduras que não são S. cerevisiae. Fonte: Silva-Filho et al. (2005b; 2005c). REFERÊNCIAS BASSO, L. C., AMORIM, H. V., OLIVEIRA, A. J., LOPES, L. M. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Research. 8: , BROSNAM, M. P., DONNELLY, D., JAMES, T.C., BOUD, U. The estress response is repressed during fermentation in brewery strains of yeast. Journal of Appied Microbiology. 88: , CASTANHEIRA, D.D. Estudos sobre a produção de etanol em células de Saccharomyces cerevisiae com maior atividade da enzima H+-ATPase de membrana citoplasmática. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto (MG), DÁRIO, M. G. Análise molecular do metabolismo de sacarose por linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Santa Catarina, Santa Catarina (SC), DELLA-BIANCA, B. E. ; BASSO T.O. ; STAMBUK, B. U. ; BASSO, L. C. ; GOMBERT, A. K.. What do we know about the yeast strains from the Brazilian fuel 12

13 ethanol industry? Applied Microbiology and Biotechnology, v. 97, p , LIBERAL, A.T.S.; BASÍLIO, A.C.M.; RESENDE, A.M.; BRASILEIRO, B.T.R.V.; SILVA-FILHO, E.A.; MORAIS, J. O. F. DE; SIMÕES, D.A.; MORAIS JUNIOR, M.A. DE. Identification of Dekkera bruxellensis as major contaminant yeast in the fuel-ethanol fermentation process. Journal of Applied Microbiology, 102: , SAMBROOK, J.; FRISTSCH, E.F.; MANIATS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory. New York, SILVA-FILHO, E. A.; MELO, H. F.; ANTUNES, D.F.; SANTOS, S. K.; RESENDE, A. M.; SIMÕES, D. A.; MORAIS, M. A. Jr. Isolation by genetic and physiological characteristics of a fuel-ethanol fermentative Saccharomyces cerevisiae strain with potential for genetic manipulation. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 32(10): , 2005a. SILVA-FILHO, E. A.; SANTOS, S. K. B.; RESENDE, A. M.; MORAIS, J. O. F.; MORAIS JR, M. A.; SIMÕES, D. A. Yeast population dynamics of industrial fuelethanol fermentation process assessed by PCR-fingerprinting. Antonie Van Leeuwenhoek, 88: 13-23, 2005b. SILVA-FILHO, E. A.; MORAIS JUNIOR, M. A.; SIMÕES, D. A.; BRASILEIRO, B. T. R. V.; MORAIS, J. O. F. OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO ATRAVÉS DA TIPAGEM GENÉTICA DE LEVEDURAS POR DNA. Visão da Agroindústria, Alagoas/PE, p , 2005c. 13