UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE DE DNA MITOCONDRIAL PARA CARACTERIZAR A BIODIVERSIDADE DE LEVEDURAS ISOLADAS DA FERMENTAÇÃO DA CACHAÇA.

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1 UTILIZAÇÃO DA ANÁLISE DE DNA MITOCONDRIAL PARA CARACTERIZAR A BIODIVERSIDADE DE LEVEDURAS ISOLADAS DA FERMENTAÇÃO DA CACHAÇA. Lucas Carvalho Santiago¹; Waldesse Piragé de Oliveira Júnior². ¹Aluno do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de ²Orientador do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de RESUMO O presente trabalho teve como base analisar o grau de parentesco de leveduras,oriundas de alambiques de cidades do Tocantins.As leveduras foram identificadas taxonomicamente pelo Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia e estocadas em um refrigerador a -80 C. Inicialmente, realizou-se a reativação destas leveduras, em meio sólido YMA e em meio líquido YEPD, respectivamente. Posteriormente, houve a extração do DNA mitocondrial (DNA-mt),seguindo protocolo descrito pelo Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras-ICB-UFMG.Logo após avaliou-se qualitativamente e quantitativamente o DNA. Na restrição enzimática do DNA-mt utilizou-se o protocolo descrito pelo Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras-ICB-UFMG,porém, não se obteve nenhum resultado significativo mesmo reformulando todos os processos e metodologias, o mesmo ocorreu com o grupo da UFMG. Outra alternativa a ser testa é a utilização da PCR específica com o primer EI-1, que está em execução para obter uma análise da diversidade das leveduras. Palavra chave:alambiques;leveduras;dnamt. INTRODUÇÃO Cachaça é a denominação típica e exclusiva da bebida produzida no Brasil, que é obtida pela destilação do mosto de cana-de-açúcar fermentado (BRASIL, 2005). Durante o processo fermentativo, uma grande diversidade de microrganismos está presente no mosto. As leveduras são responsáveis pelo consumo dos açúcares e pela formação de etanol e outros compostos secundários, que contribuem para a qualidade organoléptica da cachaça (SCHWAN et al., 2001). Saccharomycescerevisiae (S. cerevisiae) é a levedura

2 predominante por sua maior tolerância ao estresse osmótico e ao etanol, mas os gêneros Kloeckera, Candida, Kluyveromyces e Pichia são comumente isolados. Bactérias também podem estar presentes, principalmente em meios pouco ácidos ou em altas temperaturas (MORAIS et al., 1997; PATARO et al., 1998, 2000). A maior parte das destilarias produz fermento (pé-de-cuba) de forma espontânea. Devido à maneira como o fermento é produzido e pelo fato de o caldo de cana ser constantemente adicionado à dorna, diferentes linhagens de S. cerevisiae podem ser isoladas durante o período de produção, o que faz com que a cachaça esteja sujeita a variações no aroma e no sabor (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001; GOMES et al., 2007). Neste contexto, este projeto propõe a realização de uma investigação, através de métodos moleculares, das linhagens de S. cerevisae isolados a partir de substratos oriundos de alambiques do Estado do Tocantins para determinar a biodiversidade associada ao processo de produção de cachaça. O conhecimento gerado poderá fornecer subsídios para a utilização de metodologias de acompanhamento do processo ou ainda identificar microrganismos que possam ser utilizados em aplicações biotecnológicas. MATERIAL E MÉTODOS As espécies foram identificadas através de chaves taxonômicas presentes em Kurtzman e Fell (1998) e estão armazenadas na Coleção de Culturas de Leveduras do Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia Banco de Leveduras. Os procedimentos foram realizados pela equipe coordenada pelos professores Dra. Paula Benevides e Dr. Raphael S. Pimenta.As leveduras utilizadas são de alambiques de diferentes cidades do estado. As leveduras estavam estocadas em um refrigerador -80 C.Para reativação e posterior crescimento das leveduras utilizou se inicialmente o meio YMA(Peptona 0.5%,Extrato de Leveduras 0.3%,Glicose 2%,Malte 0.3%,Ágar 3%) onde foram cultivadas em placas de petri e colocadas em uma incubadora B.O.D(THELGA) por um período de 48 horas a uma temperatura de 30 C,logo após esse primeiro crescimento eram repicadas novamente em

3 meio YMA e encubadas por mais 48 horas,com o intuito de diminuir o risco de contaminação da amostra. Depois eram repicadas em meio líquido YME(Extrato de leveduras 1%,Peptona 2%, Glicose 1%), em tubos Falcon com 5 ml do meio e armazenadas em uma incubadora refrigerada(tecnal) com rotação de 150 RPM e temperatura de 25 C,por 18 horas. Para a extração do DNA-mt foi utilizado o protocolo descrito pelo Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras ICB/UFMG. Após esta etapa de otimização no LABIOTEC UFT foram estocadas no refrigerador a um temperatura de 4 C para posterior análise. Para avaliar a qualidade do DNA extraído foi realizada eletroforese horizontal em gel de agarose de 1% e com 3µL de Brometo de Etideo, durante 2 horas,a uma voltagem de 100V.No gel foram acrescentados 3µL de DNA-mt de cada indivíduo e 2µL de Loading(solução de azul de bromofenol M e sacarose 2.34M). Foi utilizado como tampão de corrida, TBE(Tris 1M; ácido bórico 0.83M e EDTA 10mM),diluído 0,5 vezes.o resultado foi analisado em um sistema de foto documentação (VILBER LOUMART). A quantificação do mt-dna foi realizada utilizando-se densidade óptica em espectrofotômetro THERMO CIENTIFIC NANODROP 2000 SPECTRO HOTOMETER (NanoDrop ),onde se obteve a quantidade de Acido Nucléico por µl da amostra,e também resultado no comprimento de onda de 260/280,260/230 e 260nm (λ = 260nm). Para restrição do mt-dna foi utilizado a metodologia descrita pelo Laboratório de Ecologia e Biotecnologia deleveduras-icb-ufmg,onde se utilizou a enzima Hinf I(INVITROGEN).Foi escolhida a Hinf I,por ser a endonuclease para melhor diferenciação das linhagens de S.cerivisiaesegundo Querolet al.(1994).o mix era composto por 6µL de H 2 O,2µL de Tampão10x(500mM-Tris-HCL ph 7.5,100 mm MgCl 2,10 mm Dithiothreitol (DTT),1.000 mm NaCl),1µL da enzima Hinf I(10U) e 1µL de RNAse(10mg/mL)(AMRESCO)),para cada amostra. Na reação de PCR utilizou-se o Intron Splice Site primerei-1 (CTGGCTTGGTGTATGT), descrito por Barros Lopes et al. (1996), contendo 2,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntps, 1x Tampão Taqbuffer, 50 ng de DNA genômico, 20pmoles de

4 primer e 1,5 U de Taqpolymerase. As amostras foram inicialmente desnaturadas a 95 C por 5 min. e submetidas a 35 ciclos a 95 C por 40 seg., 35 C por 2 min. e 72 C por 40 seg. e extensão final a 72 C por 2 minutos e 4 C por 10 minutos para resfriamento. Na eletroforese foi utilizado gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio. Os fragmentos de DNA foram separados por aproximadamente 2 horas a 80V em tampão TBE 0,5x (Tris-Borato-EDTA). RESULTADO E DISCUSSÕES No total, foram reativadas 48 leveduras e algumas outras não apresentaram crescimento suficiente para as análises. O protocolo com melhores resultados de crescimento e isolamento foi o que adotou a incubação por 48 horas em meio sólido YMA(2 vezes) e 18 horas em meio líquido YME onde 1 apresentou contaminação por fungos filamentosos e bactérias, mas foi reativada novamente Extração do DNA Ao analisar o gel percebe-se a formação de bandas bem definidas,mostrando apenas uma pequena contaminação por RNAs,mas sem prejudicar o processo de restrição enzimática. Restrição do DNA(mt-DNA-RFLP) A validação dos DNA-mt, realizada pela Dra. Badotti,mostraram que muitas amostras não atingiram grau de pureza e concentração desejáveis a restrição enzimática. Entretanto, mesmo as amostras validadas não resultaram em padrões de restrição com qualidade conclusiva. Alguns problemas podem explicar o ocorrido, dentre eles pode-se apontar a qualidade das enzimas utilizadas. Mesmo com diversos testes laboratoriais, mudando a quantidade de DNA-mt, diluições diferentes, uso e não uso de RNase, tempo diferentes de restrição enzimática e mudanças na eletroforese, não foi possível estabelecer um padrão de eletroforese com qualidade para as análises. A partir disto, o método de PCR com o primer EI-1 foi testado, onde foram variadas as diluições dos DNAs, as condições de reação e também os parâmetros de ciclagem. A partir das análises do agrupamento, foram observados 7 clusters que demonstraram grande diversidade. Somente duas linhagens demonstraram 100% de similaridade e estas eram

5 oriundas de locais diferentes. A grande diversidade molecular encontrada não estava relacionada com o local onde foi coletada. LITERATURA CITADA BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa n. 13 de 29 de junho de Regulamento técnico para fixação dos padrões de identidade e qualidade para aguardente de cana ecachaça. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, seção 1, p. 3, 30 jun GOMES, F. C. O.; SILVA, C. L. C.; MARINI, M. M.; OLIVEIRA, E. S.; ROSA, C. A. Use of selected indigenous Saccharomycescerevisiae strains for the production of the traditional cachaça in Brazil. Journal of Applied Microbiology, Malden, v. 103, n. 6, p , GUERRA, J. B.; ARAÚJO, R. A. C.; PATARO, C.; FRANCO, G. R.; MOREIRA, E. S. A; MENDONÇA-HAGLER, L. C.; ROSA, C. A. Genetic diversity of Saccharomycescerevisiaestrains during the 24h fermentative cycle for the production of the artisanal Brazilian cachaça. Letters in Applied Microbiology, Malden, v. 33, n. 2, p , MORAIS, P. B.; ROSA, C. A.; LINARDI, V. R.; PATARO, C.; MAIA, A. B. R. A. Characterization and succession of yeast populations associated with spontaneous fermentations during the production of Brazilian sugar-cane aguardente. World Journal of Microbiology and Biotechnology.Amsterdam, v. 13, n. 2, p , PATARO, C.; SANTOS, A.; CORRÊA, S. R.; MORAIS, P. B.; LINARDI, V. R.; ROSA, C. A. Physiological characterization of yeasts isolated from artisanal fermentation in an aguardente distillery. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, n. 1, p , PATARO P, GUERRA JB, PETRILLO-PEIXOTO ML, MENDONÇA-HAGLER LC, LINARDI VR & ROSA CA.Yeast communities and karyotype polymorphism of Saccharomycescerevisiae strains associated with artisanal fermentations in Brazil. J. Appl. Microbiol.89: 24-31, SCHWAN, R. F.; MENDONÇA, A. T.; SILVA Jr., J. J.; RODRIGUES, V.; WHEALS, A. E. Microbiology and physiology of cachaça fermentations. Antonie van Leeuwenhoek, Amsterdam, v. 79, n. 1, p , AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil.

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