Avaliação de procedimentos analíticos para a determinação de lipídios e ácidos graxos em produtos alimentícios.

Transcrição

1 SABRIA AUED-PIMENTEL Avaliação de procedimentos analíticos para a determinação de lipídios e ácidos graxos em produtos alimentícios. Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências da Coordenadoria do Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Prof. Dr. Odair Zenebon SÃO PAULO 2007

2

3 À Deus por ter concluído mais uma etapa... Aos meus pais, Taufic (in memoriam) e Nilza, por me transmitirem valores como a responsabilidade, honestidade e ética. Aos meus filhos, Victor e Ricardo, e ao meu marido, Celso, pelo carinho, apoio e compreensão.

4 Este trabalho teve o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Processo nº 04/

5 AGRADECIMENTOS Ao Dr Odair Zenebon, Diretor da Divisão de Bromatologia e Química do Instituto Adolfo Lutz, cujo apoio, confiança e orientação foram essenciais para a concretização deste trabalho. À FAPESP pelo suporte financeiro concedido para o desenvolvimento do trabalho. À Dra Deise Aparecida Marsiglia Pinatti, Diretora do Serviço Alimentos da Divisão de Bromatologia e Química do Instituto Adolfo Lutz, por autorizar a execução do presente trabalho. À Mahyara Markievicz Mancio Kus e Edna Emy Kumagai pela inestimável colaboração na execução das análises laboratoriais. À Miriam Solange Fernandes Caruso, pelo apoio, sugestões e por compartilhar as responsabilidades do Laboratório de Cromatografia durante a execução deste trabalho. Ao Valter Ruvieri pelo estudo estatístico. À Célia Maria Gaudêncio do Nascimento e Simone Alves da Silva, pelo apoio durante o trabalho. Aos funcionários do Programa de Pós-graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças, pelos auxílios prestados. À bibliotecária Sandra Alves de Moraes, do Centro de Documentação da Coordenadoria do Controle de Doenças da Secretaria do Estado de Saúde de São Paulo, pela revisão das referências bibliográficas. Aos colegas da Seção de Óleos e Gorduras e do Serviço de Alimentos do Instituto Adolfo Lutz, e a todos aqueles que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

6 RESUMO: Tendo em vista a informação nutricional no rótulo dos alimentos, diferentes procedimentos para a determinação de lipídios ou gordura total (GT), ácidos graxos saturados (AGS), polinsaturados (AGP) e trans (AGT) foram avaliados. Diferentes amostras de referência foram analisadas, sendo: óleo vegetal fornecido pelo Conselho Oleícola Internacional, Espanha; gordura vegetal parcialmente hidrogenada (GVPH), obtida do Central Science Laboratory do Reino Unido (FAPAS 27/04); ovo, leite, queijo, fórmula infantil e pudim de baunilha adquiridos da American Oil Chemist Society, Estados Unidos, além de uma amostra comercial de biscoito de chocolate. Os métodos gravimétricos de extração de gordura empregados foram: hidrólise ácida (HA) e Bligh e Dyer ou Folch, Lees e Stanley (todas as amostras), hidrólise básica (HB) (Roese Gottlieb) (leite em pó e fórmula infantil), hidrólise mista (HM) (queijo em pó) e Soxhlet (ovo em pó e biscoito de chocolate), conforme Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz e métodos da Association of Official Analytical Chemistry (AOAC). O teor de GT dos alimentos foi também determinado a partir da composição de ácidos graxos obtida por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC) conforme método AOAC (ou ), com modificações. Foram otimizadas as condições da análise por CG/DIC e comparados os procedimentos de determinação de GT, preparação de ésteres metílicos (IUPAC e Hartman e Lago, modificados) e de cálculo para expressar a concentração dos ácidos graxos em g/100g do alimento. A precisão dos métodos foi avaliada pelos coeficientes de variação e a exatidão por comparações dos valores de referência com os obtidos experimentalmente utilizando o índice z, considerando os intervalos de variação aceitáveis dos estudos interlaboratoriais, e de 20% previsto no regulamento técnico brasileiro sobre informação nutricional. Foi aplicado ANOVA, teste de Tukey e teste-t (5% de significância). Os métodos de metilação apresentaram precisão e exatidão similares para a maioria dos ácidos graxos de referência. Tanto para os AG quanto para GT o desempenho dos métodos foi satisfatório com valores do índice z entre -2<z<2, exceto para os AGT, cujos teores ultrapassaram os 20% de tolerância prevista na legislação. Foram verificadas diferenças significativas entre os procedimentos de determinação de GT e de cálculo para expressar o teor dos AG (p < 0,05). O método AOAC , para extração e quantificação de GT, AGS e AGT por CG/DIC, com as modificações implementadas no trabalho, tais como a esterificação dos AG segundo Hartman e Lago, simplificação dos aparatos para extração, entre outras, revelou exatidão e precisão satisfatórias (%CVr <5% para analitos em concentração acima de 1%), rapidez e emprego de solventes de baixa toxicidade e em menor volume, sendo uma metodologia viável a ser adotada no Brasil para fins de rotulagem nutricional.

7 ABSTRACT: Considering the nutritional labeling information, different procedures to determine lipids or total fat (TF), saturated (SFA), polyunsaturated (PUFA) and trans fatty acids (TFA) were evaluated. Several reference samples were analyzed, such as: vegetable oil from International Olive oil Council, Spain; partially hydrogenated vegetable fat (PHVF) from Central Science Laboratory, United Kindon (FAPAS 27/04); egg, milk, cheese, infant formula, and vanilla pudding purchased from AOCS nutritional labeling series 2004/2005 and 2005/2006, United States, as well as one commercial chocolate biscuit sample. Gravimetric determination of total fat followed both AOAC methods and Normas Analílicas do Instituto Adolfo Lutz. Also, TF was determined from fatty acid composition by gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID) in accordance with AOAC method (or ) with some modifications. Two methylation methods (IUPAC 2301 and Hartman and Lago) and three forms for calculating the fatty acid concentration, expressed in grams per 100 grams of food (by means of internal standard, and by normalization of area multiplied by theoretical conversion factors), were evaluated. GC analyses were optimized. Precision was evaluated under repeatability condition expressed as relative standard deviation (%rsd) and trueness by comparing experimental and reference values (z-score) considering the acceptable variation of inter-laboratorial tests and 20% established in Brazilian nutritional labeling legislation. Variance analysis, Tukey test and t-test (5% significance) were applied. Methylation procedures showed similar results. Significant difference was observed in total fat obtained from different procedures and for calculating the fatty acid concentration (p< 0,05). The z-score values for both TF and FA stood between -2<z<2, except for TFA, which varied more than 20% from the reference values. The AOAC method, to extract and quantify TF, SFA, TFA with the modifications introduced in this work such as Hartman and Lago FA methylation and extraction apparatus simplification, showed satisfactory trueness and precision (% rsd < 5% for analytes with concentration >1%). The method was quick and used lower quantity and less toxicity solvents. It is an option of methodology to be introduced in Brazil for nutritional labeling purposes.

8 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA AG AGE AGM GP AGS AGT ANVISA AOAC AOCS CCD CG CG-DIC CG-DM CLA CLAE COI CVr CVR DHA DP EAS EFSC EFS EMAG EPA EtOH FAO FAPAS FDA FE FL GVPH GT HA HB Ácido araquidônico Ácidos graxos Ácidos graxos essenciais Ácidos graxos monoinsaturados Ácidos graxos polinsaturados Ácidos graxos saturados Ácidos graxos trans Agência Nacional de Vigilância Sanitária Association of Official Analytical Chemistry American Oil Chemist Society Cromatografia em camada delgada Cromatografia gasosa Cromatografia gasosa com detector de ionização de chama Cromatografia gasosa com detector de massas Conjugated linoleic acid Cromatografia líquida de alta eficiência Conselho Oleícola Internacional Coeficiente de variação da repetitividade Coeficiente de variação da reprodutibilidade Docosahexaenoic acid Desvio padrão Extração acelerada com solvente Extração com fluido super crítico Extração em fase sólida Ésteres metílicos de ácidos graxos Eicosapentaenoic acid Etanol Food and Agriculture Organization of the United Nations Food Analysis Performance Assessment Scheme Food and Drug Administration Fase estacionária Fosfolipídios Gordura vegetal parcialmente hidrogenada Gordura total Hidrólise ácida Hidrólise básica

9 HDL HM IAL IARC INMETRO ISO IUPAC IV LD LDL LQ LT MetOH MS NIST OMS PE PG PI r R RMN SNC S r S R SUS VLDL TAG TX USA USDA UV WHO High Density Lipoprotein Hidrólise mista Instituto Adolfo Lutz International Agency for Research on Cancer Instituto Nacional de Metrologia International Organization for Standarization International Union of Pure and Applied Chemistry Infravermelho Limite de detecção Low Density Lipoprotein Limite de quantificação Leucotrienos Metanol Ministério da Saúde National Institute of Standards and Technology Organização Mundial de Saúde Ponto de ebulição Prostaglandinas Padrão interno Limite de repetitividade Limite de Reprodutibilidade Ressonância Magnética Nuclear Sistema Nervoso Central Desvio padrão da repetitividade Desvio padrão da reprodutibilidade Sistema Único de Saúde Very Low Density Lipoprotein Triacilgliceróis Tromboxanas United States of America United States Department of Agriculture Ultravioleta World Health Organization

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Ácidos graxos saturados encontrados nos alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes...28 Tabela 2. Ácidos graxos insaturados encontrados nos alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes...29 Tabela 3. Ácidos graxos trans encontrados em alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes...29 Tabela 4. Grau de evidência da associação entre exposição a fatores ligados ao estilo de vida (dieta e atividade física) e o risco para doenças cardiovasculares Tabela 5. Recomendações da OMS para ingestão diária de alguns nutrientes Tabela 6. Propriedades físicas e aspectos de toxicidade de alguns solventes orgânicos empregados na extração de lipídios dos alimentos...53 Tabela 7. Métodos convencionais de extração de lipídios: princípio, campo de aplicação, vantagens e limitações Tabela 8. Principais reagentes para preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos, vantagens e limitações Tabela 9. Fatores de conversão teóricos de gordura para ácidos graxos em diferentes alimentos Tabela 10. Condições analíticas de metodologias oficiais para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG...79 Tabela 11. Condições analíticas de metodologias para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG...81 Tabela 12. Materiais de referência: produto, fornecedor e componentes de referência Tabela 13. Mistura de 37 padrões de EMAG variando de 4:0 a 24:0, com quantidades certificadas de cada ácido graxo, conforme descrito abaixo:...89 Tabela 14. Mistura de ésteres metílicos de isômeros cis(c)/trans(t) do ácido linoléico (18:2), com quantidades aproximadas de cada isômero Tabela 15. Mistura de ésteres metílicos de isômeros cis (c)/trans (t) do ácido linolênico (18:3), com quantidades aproximadas de cada isômero Tabela 16. Condições cromatográficas para análise de EMAG em coluna capilar de sílica fundida de 100m SP 2560 por CG/DIC...92 Tabela 17. Métodos para a determinação de GT nas amostras de alimentos...97 Tabela 18. Fatores de conversão de EMAG para AG (f agi ) e TAG equivalente (f Tgi ) Tabela 19. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões de EMAG empregando as condições cromatográficas do método Tabela 20. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões de EMAG empregando as condições cromatográficas do método Tabela 21. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões de EMAG empregando as condições cromatográficas do método

11 Tabela 22. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100m, para o padrão de mistura de isômeros cis/trans de EMAG 18:2, empregando as condições cromatográficas dos métodos 1,2 e Tabela 23. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100m, para o padrão de mistura de isômeros cis/trans de EMAG 18:3, empregando as condições cromatográficas dos Métodos 1,2 e Tabela 24. Parâmetros cromatográficos obtidos na análise de padrões de EMAG graxos, empregando a programação cromatográfica do método Tabela 25. Parâmetros cromatográficos obtidos na análise de padrões individuais de EMAG, empregando a programação cromatográfica do método 1* Tabela 26. Valores designados e alvos do desvio padrão para alguns ácidos graxos das amostras de referência de óleo vegetal (COI 28/05) e GVPH (FAPAS 27/04) Tabela 27. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 1 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metilicos Tabela 28. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 2 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos Tabela 29. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 3 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos Tabela 30. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 1 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos Tabela 31. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 2 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos Tabela 32. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 3 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos Tabela 33. Contribuição das frações lipídicas do ovo para o total de ácidos graxos..148 Tabela 34. Composição de ácidos graxos em amostra de referência de ovo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos experimentalmente por diferentes métodos de extração (% p/p de ésteres metílicos)

12 Tabela 35. GT, AGS, AGM, AGP e AGT em amostra de referência de ovo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura e formas de cálculo Tabela 36. Composição de ácidos graxos da amostra de referência de leite em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de GT (% p/p de ésteres) Tabela 37. GT, AGS, AGM, AGP e AGT em amostra de referência de leite em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura e formas de cálculo Tabela 38. Composição de ácidos graxos da amostra de referência de queijo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração (% p/p de ésteres metílicos) Tabela 39. GT, AGS, AGM, AGP e AGT em amostra de referência de queijo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura e formas de cálculo Tabela 40. Composição de ácidos graxos da amostra de referência de fórmula infantil em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2005/2006). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração (% p/p de ésteres metílicos) Tabela 41. GT, AGS, AGM, AGP e AGT em amostra de referência de fórmula infantil (AOCS série rotulagem nutricional 2005/2006). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura e formas de cálculo Tabela 42. Composição de ácidos graxos da amostra de referência de sobremesa pronta, pudim de baunilha (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração (% p/p de ésteres metílicos) Tabela 43. GT, AGS, AGM, AGP e AGT em amostra de referência de pudim de baunilha (AOCS série rotulagem nutricional 20054/2005). Valores de referência e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, formas de cálculo e empregando fator de correção do DIC teórico (FT) com relação a EMAG 16:0 ou experimental (FE) com relação ao 13: Tabela 44. GT, AGS, AGP e AGT em amostra de biscoito de chocolate obtida do comércio. Valores de referência da rotulagem e obtidos por diferentes métodos de extração de gordura e formas de cálculo Tabela 45. Recuperação do EMAG 11:0 adicionado à gordura dos diferentes alimentos (método de quantificação com PI EMAG 13:0) Tabela 46. Recuperação do TAG 11:0 adicionado aos diferentes alimentos (método de quantificação AOAC /06 com PI TAG 13:0) Tabela 47. Recuperação do EMAG 11:0 adicionado à diferentes massas de gordura de leite empregando o método de metilação de Hartman e Lago com diferentes quantidades de reagentes Tabela 48. Estimativa de tempo de análise (h) e volume (ml) de solvente gastos para os diferentes procedimentos de extração de gordura dos alimentos*

13 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação gráfica da formação da molécula de triacilglicerol a partir de uma molécula de glicerol e de três de ácidos graxos Figura 2. Representação gráfica das moléculas de ácidos graxos saturado e monoinsaturados nas configurações geométricas cis e trans...26 Figura 3. Passos metabólicos dos AGE das séries n-6 e n-3 (Mayes, 1996) Figura 4. Distribuição relativa dos isômeros trans 18:1 em: A) Gordura de leite de vaca B) Margarina. Fonte: Mossoba et al., Figura 5. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo o método 1 de programação cromatográfica Figura 6. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo método 2 de programação cromatográfica Figura 7. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo método 3 de programação cromatográfica Figura 8. Cromatogramas obtidos pela análise por CG-DIC da mistura de padrões de EMAG isômeros cis/trans 18: Figura 9. Cromatogramas obtidos pela análise por CG-DIC da mistura de padrões de EMAG isômeros cis/trans 18: Figura 10. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelos métodos de metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método Figura 11. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelo método metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método Figura 12. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelo método metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método Figura 13. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos trans (18:1, 18:2 e soma dos trans (Soma T)) para a amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 analisada por dois métodos de metilação (Hartman e Lago e IUPAC 2.301) empregando as programações cromatográficas dos métodos: A) Método1; B) Método 2 e C) Método Figura 14. Cromatogramas obtidos pela separação de EMAG por CG-DIC de uma mistura de óleos vegetais, amostra de referência COI 28/05, em coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária cianopropil siloxana (SP 2560) de 100m de comprimento (0,25 mm diâmetro interno e 0,20 µm espessura do filme), empregando diferentes programações cromatográficas: A) Método 1. B) Método 2 C) Método 3. Componentes: 1. 16:0; 2. 16:1c; 3.17:0; 4. 17:1; 5. 18:0; 6. 18:1t; :1c; 9. 18:2t; :2c; :0; :3t; :1; :3c; :0;16. C24: Figura 15. Cromatogramas obtidos pela separação de EMAG por CG-DIC de amostra de referência FAPAS 27/04 de GVPH, em coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária cianopropil siloxana (SP 2560) de 100m de comprimento (0,25 mm

14 diâmetro interno e 0,20 µm espessura do filme), com diferentes programações cromatográficas: A) Método 1 B) Método 2 C) Cromatograma destacando ácidos graxos inclusive os trans obtido pelo Método 1. Componentes: 1.12:0; 2. 14:0; :0; 4. 18:0; 5. 18:1t; 6,7,8. 18:1c; 9. 18:2t; 10.18:2c; :0;12. 18:3t; :1; :3c; : Figura 16. Cromatogramas obtidos pela separação de EMAG por CG-DIC de amostra de referência de GVPH (FAPAS 27/04), com destaque para a região dos isômeros cis/trans 18:1, empregando as programações cromatográficas:a)método 1; B)Método 2; C)Método Figura 17. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de GT da amostra de ovo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (CG/DIC AOAC /06; HA (AOAC ); Soxhlet e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 18. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGS da amostra de ovo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura: HA (AOAC /06); HA (AOAC ); Soxhlet e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 19. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGP da amostra de ovo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (HA AOAC /06; HA (AOAC ); Soxhlet e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 20. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGT da amostra de ovo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (HA AOAC /06; HA (AOAC ); Soxhlet e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 21. Cromatograma obtido na análise por CG-DIC de EMAG de gordura de ovo em pó, amostra de referência AOCS serie 2004/2005 rotulagem nutricional. Condições: coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária cianopropil siloxana (SP 2560) de 100m de comprimento (0,25 mm diâmetro interno e 0,20 µm espessura do filme); Condições: Método 1. Componentes: 1.14:0; 2. 16:0; 3.16:1c; 4.17:0; 5.17:1; 6.18:0; 7.18:1t; 8.18:1c; 9.18:2t; 10.18:2c; 11.20:0; 12.18:3t; 13.20:1; 14.18:3c;15.20:2; 16.22:0; 17.20:4; 18.22: Figura 22. Cromatograma obtido na análise por CG-DIC de EMAG de gordura de leite em pó, amostra de referência AOCS, serie rotulagem nutricional 2004/2005. Condições: coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária cianopropil siloxana (SP 2560) de 100 m de comprimento (0,25 mm diâmetro interno e 0,20 µm espessura do filme); Método 1. Componentes: 1. 4:0; 2. 6:0; 3. 8:0; 4.10:0; 5.12:0; 6.13:0; 7. 14:0;. 8.14:1c; 9.16:0; 10.16:1; 11.18:0; 12.18:1t (principal trans-vacênico); 13.18:1c; 14.18:2t; 15.18:2c; :0; 17.20:1; 18.18:3c; 19.CLA, 18:2 9c,11t; 20 20: Figura 23. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de GT (Z=0) da amostra de leite em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (AOAC /06; HA (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e

15 Dyer). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 24. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGS (z=0) da amostra de leite em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura: HA (AOAC /06); HA (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 25. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGP (z=0) da amostra de leite em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (HA AOAC ; HA (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial AOCS Figura 26. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGT (z=0) da amostra de leite em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura (HA AOAC /06; HA (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer). Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial AOCS Figura 27. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de GT (z=0) da amostra de queijo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura [HM (CG/DIC AOAC /06); HA (AOAC ); HM (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer]. Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 28. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGS (z=0) da amostra de queijo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura [HM (AOAC /06); HA (AOAC ); HM (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer]. Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial AOCS Figura 29. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGP (z=0) da amostra de queijo em pó analisada por quatro métodos de extração de gordura [HM (AOAC /06); HA (AOAC ); HM (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer]. Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial AOCS Figura 30. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGT (z=0) da amostra de queijo em pó analisada por quatro métodos de

16 extração de gordura [HM (AOAC /06); HA (AOAC ); HM (AOAC ); Roese-Gottlieb e Bligh e Dyer. Valores calculados considerando: A) GT de cada método e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. B) GT obtido por HA AOAC e o intervalo de aceitação de um S R do estudo interlaboratorial. C) GT de cada método e o intervalo de aceitação de 20% do valor médio do estudo interlaboratorial AOCS Figura 31. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de GT (z=0) da amostra de fórmula infantil em pó analisada por cinco métodos de extração de gordura [HB (AOAC /06); HA (AOAC ); HM (AOAC ); Roese-Gottlieb, Bligh e Dyer e HB (AOAC /06)]. Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 32. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGS (z=0) da amostra de fórmula infantil em pó analisada por cinco métodos de extração de gordura [HB (AOAC /06); HA (AOAC ) HM (AOAC ); Roese-Gottlieb, Bligh e Dyer]. Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 33. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGP (z=0) da amostra de fórmula infantil em pó analisada por cinco métodos de extração de gordura [HA (AOAC /06); HA (AOAC ); Roese- Gottlieb, Bligh e Dyer e HB (AOAC /06)]. Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 34. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGT (z=0) da amostra de fórmula infantil em pó analisada por cinco métodos de extração de gordura [HB (AOAC /06); HA (AOAC ); Roese- Gottlieb, Bligh e Dyer e HB (AOAC /06)]. Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial Figura 35. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de GT (z=0) da amostra de pudim de baunilha analisada por quatro métodos de extração de gordura [HB CG/DIC (AOAC /06); HA (AOAC ); HA CG/DIC AOAC (996.01/06) e Folch, Lees e Stanley]. Valores calculados considerando o conteúdo de gordura de cada método e diferentes formas de cálculo (normalização ou PI) e fatores de correção do DIC, teórico (16:0) e experimental (13:0). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial. Letras iguais: não existe diferença significativa (p>0,05) Figura 36. Representação gráfica do Índice z-score com relação aos valores de referência de AGS (z=0) da amostra de pudim de baunilha analisada por quatro métodos de extração de gordura [HB (AOAC /06); HA (AOAC ); HA CG/DIC AOAC (996.01/06) e Folch, Lees e Stanley]. Valores obtidos considerando o teor de gordura de cada método e diferentes formas de cálculo (normalização ou PI) e fatores de correção do DIC, teórico (16:0) e experimental (13:0). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo

17 interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial. Letras iguais: não existe diferença significativa (p>0,05) Figura 37. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de AGP (z=0) da amostra de pudim de baunilha analisada por quatro métodos de extração de gordura [HB AOAC (996.01/06); HA (AOAC ); HA AOAC (996.01/06) e Folch, Lees e Stanley]. Valores obtidos considerando o teor de gordura de cada método e diferentes formas de cálculo (normalização ou PI) e fatores de correção do DIC, teórico (16:0) e experimental (13:0). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% do valor médio do estudo interlaboratorial. Letras iguais: não existe diferença significativa (p>0,05) Figura 38. Representação gráfica do Índice z-score com relação aos valores de referência de AGT (z=0) da amostra de pudim de baunilha analisada por quatro métodos de extração de gordura [HB (AOAC /06); HA (AOAC ); HA AOAC (996.01/06) e Folch, Lees e Stanley]. Valores obtidos considerando o teor de gordura de cada método e diferentes formas de cálculo (normalização ou PI) e fatores de correção do DIC, teórico (16:0) e experimental (13:0). Valores calculados considerando o intervalo de variação aceitável de: A) um S R do estudo interlaboratorial. B) 20% com relação ao valor médio do estudo interlaboratorial. Letras iguais: não existe diferença significativa (p>0,05); Letras diferentes: existe diferença significativa (p< 0,05) Figura 39. Cromatograma de EMAG obtido por CG/DIC da gordura da amostra comercial de biscoito de chocolate elaborada com GVPH, analisada pelo método 1 de programação cromatográfica, com destaque para os isômeros trans 18: Figura 40. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT da amostra de ovo em pó, obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, com relação à média de referência (ordenada zero ) do estudo interlaboratorial da AOCS (série rotulagem nutricional 2004/2005) Figura 41. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT da amostra de leite em pó, obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, com relação à média de referência (ordenada zero ) do estudo interlaboratorial da AOCS (série rotulagem nutricional 2004/2005) Figura 42. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT da amostra de queijo em pó, obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, com relação à média de referência (ordenada zero ) do estudo interlaboratorial (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005) Figura 43. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT da amostra de fórmula infantil em pó, obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, com relação à média de referência (ordenada zero ) do estudo interlaboratorial da AOCS (série rotulagem nutricional 2005/2006). A) Valores obtidos para GT, AGS, AGP e AGT. B) Valores obtidos para GT, AGS e AGP Figura 44. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT com relação à média de referência (ordenada zero ) da amostra de pudim de baunilha (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005). Valores calculados para diferentes métodos de extração de gordura, procedimentos de quantificação dos analitos e fatores de correção de resposta do DIC: fator teórico (FT) (16:0) e experimental ( FE) (13:0)...198

18 Figura 45. Representação gráfica da porcentagem de variação de GT, AGS, AGP, AGT da amostra de biscoito de chocolate comercial, obtidos por diferentes métodos de extração de gordura, com relação aos teores declarados no rótulo do produto (ordenada zero )...198

19 ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS I. INTRODUÇÃO Os lipídios dos alimentos Classificação dos lipídios Os ácidos graxos Características estruturais dos ácidos graxos Nomenclatura dos ácidos graxos Aspectos sobre a digestão, absorção e transporte dos ácidos graxos Aspectos nutricionais dos ácidos graxos Ácidos graxos monoinsaturados (AGM) Ácidos graxos polinsaturados (AGP) Ácidos graxos saturados (AGS) Ácidos graxos trans (AGT) Ácidos graxos conjugados Processos que levam a formação de AGT nos alimentos Biohidrogenação Hidrogenação industrial de óleos vegetais insaturados Refino industrial de óleos vegetais polinsaturados e processo de fritura dos alimentos Ácidos graxos saturados e trans: fatores de risco para doenças cardiovasculares Políticas mundiais de saúde para prevenir as enfermidades crônicas Legislação brasileira sobre rotulagem nutricional de alimentos embalados Determinação de lipídios ou gordura total (GT) e ácidos graxos (AG) nos alimentos Extração dos lipídios Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos Determinação de AG por cromatografia em fase gasosa (CG) Princípios da análise por CG Análise qualitativa Análise quantitativa Determinação de AG em produtos alimentícios Determinação de AGT Determinação de AG cis/trans por CG em colunas capilares Isômeros do ácido octadecenóico (18:1) Isômeros dos ácidos octadecadienóico (18:2) e octadecatrienóico (18:3) Ácidos graxos da gordura de animais ruminantes Determinação de GT e AG cis/trans visando a informação nutricional na rotulagem dos alimentos...77 II. OBJETIVOS...85 III. MATERIAIS Amostras...86

20 2. Solventes, reagentes e padrões Vidraria, equipamentos e acessórios...90 IV. MÉTODOS Análise por CG/DIC Otimização das condições cromatográficas Determinação dos fatores de correção de resposta no DIC Identificação dos componentes Preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos Extração e quantificação dos lipídios dos alimentos...96 Procedimento para determinação de lipídios totais Quantificação dos ácidos graxos por CG/DIC Cálculo com PI de EMAG (13:0), após extração dos lipídios Cálculo por normalização de área e fatores de conversão teóricos Cálculo com PI de TAG 13:0 (método AOAC ou ) Recuperação dos métodos com padrão interno Estudo estatístico V. RESULTADOS E DISCUSSÃO Otimização das condições cromatográficas Avaliação dos resultados da análise dos padrões de EMAG Avaliação dos resultados da análise de amostras de referência de óleos e gorduras Avaliação dos resultados da análise de amostras de alimentos de referência (AOCS) e obtidas no comércio Ovo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005) Leite e queijo em pó (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005) Fórmula infantil (AOCS série rotulagem nutricional 2005/2006) Pudim de baunilha (AOCS série rotulagem nutricional 2004/2005) Biscoito de chocolate obtido no comércio Recuperação dos métodos com PI e avaliação do método de esterificação (Hartman e Lago (1973) modificadopor Maia e Rodrigues-Amaya (1993) Avaliação dos resultados de GT, AGS, AGP e AGT obtidos pelos diferentes métodos com relação à tolerância de 20%, prevista no regulamento técnico brasileiro sobre informação nutricional Comparação dos procedimentos de extração GT quanto a tempo de análise (h) e volume de solvente (ml) empregado Considerações gerais VI. CONCLUSÕES VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO I. Pesos moleculares e fatores de conversão de ácidos graxos (AG) e ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG) para o correspondente triacilglicerol (TAG) ANEXO II. Parâmetros de desempenho de métodos analíticos

21 I. INTRODUÇÃO 1.Os lipídios dos alimentos Os lipídios da dieta humana, por muitos anos, foram considerados apenas como fonte de energia e componentes estruturais das membranas celulares. Entretanto, o avanço das pesquisas tem demonstrado o enorme potencial biológico destas moléculas (Fahy et al., 2005). Os ácidos graxos (AG), constituintes principais dos lipídios das dietas, podem modular a função de vários sistemas e reduzir ou favorecer a ocorrência de diversas doenças (Curi et al., 2002; Simpoulos, 2006). As gorduras, quando consumidas com moderação, são importantes para o crescimento, desenvolvimento e manutenção da saúde, entretanto a ingestão inadequada de certos componentes, como os ácidos graxos saturados, os insaturados trans e o colesterol, tem sido correlacionada ao aumento no risco de doenças cardiovasculares, as quais são a principal causa de mortalidade nos países desenvolvidos e em desenvolvimento (Ascherio et al., 1999; Curi et al., 2002; Mayes, 1996; Martinez et al., 2003; OMS, 2003). Juntamente com carboidratos e proteínas, os lipídios são os principais constituintes dos alimentos, sendo encontrados na natureza, tanto em vegetais como em animais. Formam um conjunto heterogêneo e amplo de compostos que diferem em natureza e organização. Energeticamente, são importantes porque produzem 9 Kcal por grama quando oxidados no organismo. Desempenham outros papéis tais como: reserva de fosfolipídios e de esteróis; contêm ácidos graxos essenciais, que não são produzidos pelos mamíferos, mas precisam estar presentes na dieta; auxiliam no transporte e absorção das vitaminas lipossolúveis A, D, E, e K, pelo intestino; influenciam na expressão gênica; atuam como mensageiro celular bem como, conferem sabor, consistência e estabilidade ao alimento (Christie, 2006; Curi et al., 2002; Mayes,1996; Simpolos 2006). Os triacilgliceróis (TAG) são ésteres de ácidos graxos com glicerol e os principais constituintes dos lipídios das dietas (mais de 90%). Fosfo e glicolipídios, esteróis, ésteres de esteróis, ceras e ácidos graxos livres, estão presentes em menores quantidades, sendo que os ácidos graxos podem estar ligados a estes componentes 21

22 por ligações éster ou amida (Curi et al., 2002). Outros componentes, como ácido fosfórico, bases orgânicas, carboidratos, também podem compor as moléculas dos lipídios e são liberados por processos hidrolíticos, assim como os ácidos graxos (Christie, 2006). Dependendo do alimento, os lipídios terão diferentes quantidades de triacilgliceróis, fosfolipídios e outros componentes que fornecerão teores variados de ácidos graxos (Anderson, 1976; Anderson, Kinsella, Watt, 1975; Brignoli, Kinsella, Weihrauch, 1976; Exler, 1975; Posati, Kinsella, Watt, 1975 a, b; Weihrauch et al., 1977). Os lipídios de óleos, gorduras e sementes oleaginosas são constituídos essencialmente de TAG, os quais contêm cerca de 0,956g de ácidos graxos por grama de gordura. Por outro lado, os lipídios de diversos alimentos, como os ovos e os produtos cárneos, contêm quantidades consideráveis das outras frações lipídicas. Na gordura do ovo encontramos, por exemplo, cerca de 65% TAG e 29% de fosfolipídios (FL), sendo que um grama de FL contém, em média, 0,720 g de AG. Sendo assim, um grama dos lipídios do ovo terá cerca de 0,62 g de AG, provindos dos TAG e cerca de 0,21g dos FL (Posati, Kinsella, Watt, 1975b) Classificação dos lipídios Na literatura podem ser encontradas definições distintas para gorduras e lipídios. Para alguns especialistas, as primeiras são definidas como acilgliceróis de ácidos graxos e os lipídios qualquer substância encontrada em organismos vivos, solúvel em solvente orgânico, incluindo assim as gorduras, ceras, fosfolipídios, entre outros (Adrian et al., 2000; Bobbio e Bobbio, 2003; Kirk, Sawer, Egan, 1996). Outros especialistas restringem o uso do termo lipídios aos ácidos graxos e seus derivados naturais ou àqueles relacionados a suas vias metabólicas e propõem uma definição diferente, isto é: lípídios são ácidos graxos e seus derivados e substâncias relacionadas biossintéticamente ou funcionalmente a estes compostos (Christie, 2006; Visentainer e Franco, 2006). 22

23 Considerando a análise química dos constituintes dos lipídios dos alimentos, principalmente por técnicas cromatográficas, torna-se conveniente a divisão nas seguintes classes: Lipídios simples (neutros), os quais por hidrólise formam, no máximo, dois tipos de produtos primários por mol. Incluem-se nesta categoria os acilgliceróis, as ceras, os esteróis e ácidos graxos livres. Lipídios complexos (polares), que formam por hidrólise três ou mais produtos primários por mol. Pertencem a esta categoria glicerofosfolipídios ou fosfolipídios, com uma região polar da molécula contendo fósforo e o esqueleto de glicerol; glicolipídios (glicoglicerolipdios e glicoesfingolipídios) cujas moléculas apresentam uma região polar constituída por um carboidrato. Também são considerados lipídios complexos os fosfoglicolipídios e esfingofosfolipídios (Christie, 2006). Uma outra maneira de classificação dos lipídios os divide de acordo com a interação com a matriz do alimento, isto é: Lipídios livres, os quais são também chamados de extrato etéreo, gorduras neutras ou totais, formados por triacilgliceróis e ácidos graxos livres, e podem ser extraídos por solventes de menor polaridade como éter de petróleo e éter etílico; Lipídios ligados, que se encontram ligados a proteínas ou glicídios dos alimentos, sendo necessário para a extração solvente mais polar, hidrólises ou outros tratamentos químicos (Kirk, Sawer, Egan, 1996). 23

24 2. Os ácidos graxos Os ácidos graxos desempenham a principal função nutricional das gorduras e derivam, principalmente, dos triacilgliceróis (TAG) (mais de 90%). Os acilgliceróis são formados pela ligação química do glicerol com ácidos graxos. H 2 C-OH HOOC(CH 2 )nch 3 I HC-OH HOOC(CH 2 )nch 3 Ácidos graxos I H 2 C-OH HOOC(CH 2 )nch 3 Glicerol Figura 1. Representação gráfica da formação da molécula de triacilglicerol a partir de uma molécula de glicerol e de três de ácidos graxos. Quando três moléculas de ácidos graxos são combinadas com uma molécula de glicerol temos um TAG. Por hidrólise total, uma molécula de TAG origina três moléculas de ácidos graxos livres e uma de glicerol. No caso de hidrólise parcial, é formado ácido graxo livre, diacilglicerol ou monoacilglicerol. Estes compostos estão presentes como traços nos tecidos animais e vegetais, entretanto são importantes na biossíntese dos triacilgliceróis (Bobbio e Bobbio, 2003; Christie, 2006). A hidrólise química dos TAG leva ao rompimento indiscriminado dos ácidos graxos ligados ao glicerol enquanto a enzimática (lípase pancreática) atua somente nas posições 1 e 3 da molécula. Nestas posições, os ácidos graxos são distribuídos ao acaso, enquanto na posição 2, que é mais impedida estericamente, ligam-se ácidos graxos de cadeia mais curta e insaturados. Os lipídios, quando aquecidos em soluções concentradas de álcalis, são hidrolisados, isto é, sofrem um processo de saponificação, sendo separados em duas frações: saponificável e insaponificável. A fração saponificável, majoritária, é constituída por ácidos graxos e glicerol, sendo que na reação de saponificação são liberados glicerol e sais de potássio ou sódio e ácidos graxos livres. A fração insaponificável, onde estão os componentes minoritários, 24

25 contem esteróis, álcoois, pigmentos, hidrocarbonetos e vitaminas lipossolúveis (Bobbio e Bobbio, 2003). Os triacilgliceróis são compostos sólidos com pontos de fusão bem definidos. Suas propriedades estão fortemente relacionadas com as dos ácidos graxos constituintes da molécula. Para efeito metabólico, nutricional ou funcional é importante considerar a estrutura dos TAG e não apenas dos AG. Os TAG podem ser reestruturados ou modificados, por reações químicas ou enzimáticas, para alterar a composição em ácidos graxos e/ou sua distribuição nas moléculas de glicerol. Estes lipídios resultantes têm sido utilizados como alimentos funcionais podendo proporcionar efeito benéfico à saúde, como valor calórico reduzido, fornecimento de ácidos graxos para fins nutritivos ou terapêuticos e também para melhorar características físicas ou químicas dos produtos (Gioielli, 2006). Um exemplo é a produção de margarinas, obtidas por processo de interesterificação, com baixo teor de AGT (Terrago-Trani et al., 2006) Características estruturais dos ácidos graxos Ácidos graxos são ácidos carboxílicos formados por vários átomos de carbono (normalmente de 4 a 24), ligados geralmente em cadeia linear. Na cadeia carbônica podem estar ligados grupamentos como: hidroxil, epóxi, ciclopropano ou ciclopropeno, entre outros. Quanto ao número de átomos de carbono na molécula, os ácidos graxos podem ser de: cadeia curta com menos de 4; cadeia média contendo de 6 a 10 e cadeia longa com mais de 12 átomos de carbono. Os ácidos graxos são chamados saturados (AGS), quando não possuem duplas ligações na cadeia e insaturados (AGI) quando contêm uma ou mais insaturações. Quando contêm duas ou mais duplas ligações, o ácido é denominado polinsaturado 25

26 (AGP). Nestes ácidos graxos, as insaturações normalmente são isoladas, isto é, separadas por um ou mais grupos metilênicos (CH 2 ). Entretanto, podem ser encontrados ácidos graxos polinsaturados com duplas ligações conjugadas, por exemplo, na gordura de animais ruminantes (Evans, Broown, Mcintosh, 2002). Os ácidos graxos insaturados apresentam isomeria geométrica cis quando os hidrogênios das insaturações estão no mesmo lado da cadeia alifática e trans quando estes estão em lados opostos (Figura 2). Naturalmente, as gorduras da dieta possuem ácidos graxos na forma cis. As suas características físico-químicas dependem do número de átomos de carbono que formam a molécula, do número de duplas ligações, além da posição e do tipo de isomeria que estas ocupam na molécula (Bobbio e Bobbio, 2003; Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993). Saturado Cis Trans Insaturados Figura 2. Representação gráfica das moléculas de ácidos graxos saturado e monoinsaturados nas configurações geométricas cis e trans. Os ácidos graxos, em diferentes conformações geométricas, têm propriedades químicas e físicas bastante diferentes. Em geral, os ácidos graxos trans têm ponto de fusão mais alto que os correspondentes isômeros cis. Aqueles formam cristais mais 26

27 compactos e simétricos, assemelhando-se aos dos ácidos graxos saturados (Kodali e List, 2005). 2.2 Nomenclatura dos ácidos graxos Nomes comuns, derivados de suas origens ou propriedades, têm sido utilizados para denominar os ácidos graxos. Entretanto, a forma completa de designá-los é por intermédio da nomenclatura sistemática da International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) para ácidos carboxílicos. O carbono da carboxila é o carbono número um. As insaturações, ramificações ou substituições são indicadas a partir deste carbono. Pode-se indicar a posição da insaturação pela letra grega delta. Por exemplo, o ácido 16:1 pode ser representado por ácido 9 -hexadecenóico, sendo que neste caso temos a indicação do número de carbonos da molécula e da posição da insaturação. Além da posição, deve ser indicada a configuração cis ou trans das insaturações. A presença de insaturações e da isomeria pode ser indicada por exemplo como: 18:1(9c) ou 18:1(9t), para o ácido monoinsaturado ou 18:2 (9c,12c) para um polinsaturado (Bobbio e Bobbio, 2003; Visentainer e Franco, 2006). Do ponto de vista metabólico e fisiológico, tem sido importante indicar a posição da última dupla ligação dos ácidos graxos insaturados em relação ao grupo metila terminal da cadeia carbônica. Por esta terminologia, os ácidos graxos são agrupados em séries ou famílias com diferentes atividades biológicas, isto é: ômega 3, ômega 6 e ômega 9. São empregadas as letras n ou w, seguida de um número que indica o carbono onde está a insaturação, a partir do grupo metila terminal (Visentainer e Franco, 2006). Os nomes comuns, os oficiais da IUPAC e os símbolos dos ácidos graxos mais encontrados nos alimentos, inclusive na forma geométrica trans, encontram-se nas Tabelas de 1 a 2. 27

28 Tabela 1. Ácidos graxos saturados encontrados nos alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes. Nome comum Nome sistemático IUPAC Simbologia Fontes Butírico Ácido butanóico 4:0 Gordura de leite Capróico Ácido hexanóico 6:0 Gordura de leite, óleo de coco e babaçu Caprílico Ácido octanóico 8:0 Gordura de leite, óleo de coco e de babaçu Cáprico Ácido decanóico 10:0 Gordura de leite, gordura de coco Láurico Mirístico Palmítico Esteárico Araquídico Behênico Ácido dodecanóico Ácido tetradecanóico Ácido hexadecanóico Ácido octadecanóico Ácido eicosanóico Ácido docosanóico 12:0 Oleos láuricos (dendê e babaçu), gordura do leite e de coco 14:0 Gordura de coco, óleo de noz-moscada, gordura do leite 16:0 Óleos vegetais (soja, algodão, oliva, abacate, amendoim) milho) manteiga de cacau, toucinho 18:0 Gordura animal e plantas tropicais (manteiga de cacau) 20:0 Óleo de amendoim, óleo de colza, manteiga, banha 22:0 Óleo de amendoim, oleo de colza, óleo de mostarda Lignocérico Ácido tetracosanóico 24:0 Pequenas quantidades nos óleos de amendoim, mostarda, gergelim, colza e girassol Fonte: Bobbio e Bobbio, 2003; Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993; Visentainer e Franco,

29 Tabela 2. Ácidos graxos insaturados encontrados nos alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes. Nome comum Nome sistemático IUPAC Simbologia Fontes Miristoléico Ácido 9-tetradecenóico 14:1 (9c) Gordura do leite, óleo de fígado de peixe Palmitoléico Ácido 9-hexadecenóico 16:1 (9c) ou 16:1 n-7 Gordura do leite, oleo de peixe, gordura animal ou vegetal Ácido 10-heptadecenóico 17:1 (10c) Gordura do leite, óleos vegetais (traços) Oléico Ácido 9-octadecenóico 18:1 (9c) ou 18:1 n-9 Gorduras animal e vegetal (oliva, castanha do Pará) Petroselídico Ácido -6-octadecenóico 18:1(6c) Gordura vegetal hidrogenada Vacênico Ácido 11-octadecenóico 18:1 (11c) Gordura do leite Gadoléico Ácido 9-eicosenóico 20:1 (9c) ou 20:1n-11 Fosfolipídios do tecido cerebral, óleo de fígado de peixe Gondóico Ácido 11-eicosenóico 20:1(11c) Óleos vegetais Erúcico Ácido 13-docosenóico 22:1 (13c) Óleo de colza e outros óleos vegetais Cetoléico Ácido 11-docosenóico 22:1 (11c) Peixes marinhos Nervônico Ácidos 15-tetracosenóico 24:1 (15c) Linoléico Ácido 9,12-octadecadienóico 18:2 (9c,12c) ou 18:2 n-6 Gorduras animal e vegetal Linolênico Ácido 9,12,15 - Octadecatrienóico Gama-linolênico Ácido 6, 9,12- octadecatrienóico 18:3(9c,12c,15c) ou18:3 n-3 18:3(6c,9c,12c) ou 18:3 n-6 Óleos vegetais (soja, milho, girassol, linhaça) Óleos de prímola e borage Di-homo-gamalinolênico Ácido 8,11,14 - eicosatrienóico 20:3(8c,11c,14c) ou 20:3 n-6 Óleos de pescado Di-homo-alfalinolênico Ácido 11,14,17 - eicosatrienóico 20:3(11c,14c,17c) ou 20:3 n-3 Óleos de pescado Estearadônico ou morótico Ácido 6,9,12,15- octadecatetraenóico 18:4(6c,9 c,12 c,15 c) ou 18:4 n-3 Óleo de peixes marinhos Araquidônico Ácido 5,8,11,14- eicosatetraenóico 20:4(5c,8c,11c,14c) ou 20:4 n-6 Fosfolipídios de origem animal, gordura animal Suplementação de fórmulas infantis Timnodônico Ácido 5,8,11,14,17-20:5(5,8,11,14,17) ou Óleo de peixes marinhos EPA eicosapentaenóico 20:5 n-3 Fosfolipídios do cérebro Clupanodônico 7,19,13,16,19-22:5(7,19,13,16,19) ou Fosfolipídios(cérebro fígado) DPA docosapentaenóico 22:5 n-3 Óleo de peixes marinhos Cervônico DHA 4,7,10,13,16,19- docosahexaenóico 20:6(4,7,10,13,16,19) 20:6 n-3 Óleo de peixes marinhos Fonte: Bobbio e Bobbio, 2003; Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993; Visentainer e Franco,

30 Tabela 3. Ácidos graxos trans encontrados em alimentos: nome comum, sistemático, simbologia e principais fontes. Nome comum Nome sistemático IUPAC Simbologia Fontes Miristelaídico Ácido trans 9-tetradecenóico 14:1(9 t) t14:1 n-5 Gordura de leite Palmitelaídico Ácido trans 9--hexadecenóico 16:1(9 t) t16:1 n-7 Gordura do leite, gordura de animal ruminante Elaídico Ácido trans-9-octadecenóico 18:1(9 t) t18:1 n-9 Gordura vegetal hidrogenada trans - Vacênico Ácido trans-11-octadecenóico 18:1(11 t) t18:1 n-7 Gordura do leite, gordura de animal ruminante Petroselaídico Ácido trans-6-octadecenóico 18:1(6 t) t18:1 n-12 Gordura vegetal hidrogenada Ácido trans-10-octadecenóico 18:1(10 t) t18:1 n-8 Gordura vegetal hidrogenada Linolelaídico Ácido t9-t12 octadecadienóico 18:2(9t,12t) t,t,18:2 n-6 Óleos vegetais refinados Gordura vegetal hidrogenada Ácido c9-t12 octadecadienóico 18:2(9c,12t) c,t,18:2 n-6 Ácido t9-c12 octadecadienóico 18:2(9t,12c) t,c,18:2 n-6 Gordura vegetal hidrogenada Ácido c9-t13 octadecadienóico 18:2(9c,13t) c,t,18:2 n-5 Rumênico CLA Ácido c9-t11 octadecadienóico 18:2(9c,11t) c,t,18:2 n-7 Gordura do leite, gordura de animal ruminante CLA Ácido t10-c12 octadecadienóico 18:2(10t,12c) t,c,18:2 n-6 Gordura do leite, gordura de animal ruminante 18:3(9t,12t,15t) Óleos vegetais refinados Linolenelaiídico Ácido t9-t12 t15 octadecatrienóico t,t,t 18:3 n-3 Gordura vegetal hidrogenada Fonte: Bobbio e Bobbio, 2003; Cruz-Hernandez et al., 2004; Hatnayake, 2004; Visentainer e Franco,

31 3. Aspectos sobre a digestão, absorção e transporte dos ácidos graxos O processo de digestão e absorção dos lipídios é complexo, iniciando-se no estômago e passando pelo intestino delgado no qual ocorre a parte principal da digestão e absorção. A borda em escova dos enterócitos no intestino delgado é o sítio inicial da absorção dos mono e diacilgliceróis, produtos da digestão lipídica no lúmen intestinal. Os processos de absorção, metabolismo e liberação na circulação dos ácidos graxos presentes no lúmen intestinal variam conforme o tamanho da cadeia carbônica. Ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6) e média (6 a 12), após a absorção, são conduzidos diretamente pela via sangüínea ao fígado. Já os AG de cadeia longa (acima de 12 átomos de carbono) são re-sintetizados a TAG no interior dos enterócitos formando os quilomícrons, os quais através do sistema linfático, atingem a circulação sangüínea. Os quilomícrons são lipoproteínas grandes contendo principalmente triacilgliceróis em seu interior. O transporte dos lipídios ou AG da dieta é composto pelas vias metabólicas exógena e endógena. A exógena representa o transporte do AG do intestino para o fígado e a endógena das lipoproteínas sintetizadas nos hepatócitos e adipócitos para os tecidos periféricos. No plasma sangüíneo, o transporte de AG é realizado de várias formas dependendo da constituição química em que se encontra. Na circulação, além da forma livre, os AG podem fazer parte de lipídios mais complexos como éster de colesterol, fosfolipídios (FL) e TAG, entre outros que constituem as lipoproteínas plasmáticas. Estas são classificadas de acordo com suas densidades da seguinte forma: Quilomicron: lipoproteína de menor densidade, transportadora de triacilglicerol exógeno na corrente sangüínea. VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade, transportadora de AG na forma esterificada, como triacilglicerol, éster de colesterol e FL endógenos. LDL: lipoproteína de baixa densidade, rica em colesterol e responsável pela distribuição deste para os tecidos extra-hepáticos; o aumento de seus níveis na corrente sangüínea pode levar a formação de placas de ateromas nas artérias e elevar o risco da ocorrência de doenças cardiovasculares. 31

32 HDL: lipoproteína de alta densidade; promove o transporte reverso do colesterol, removendo o excesso deste dos tecidos periféricos e o transportando para o fígado, no qual é metabolizado e eliminado na forma de ácidos e sais biliares (Curi et al., 2002; Vaz et al., 2006). 4. Aspectos nutricionais dos ácidos graxos Os principais ácidos graxos encontrados nos lipídios das dietas são os de cadeia longa, destacando como saturados, o palmítico (16:0) e o esteárico (18:0) e como insaturados, o oléico (18:1, n-9) e o linoléico (18:2, n-6). Os triacilgliceróis de origem animal são ricos em ácidos graxos saturados e são sólidos à temperatura ambiente (gorduras); já os de origem vegetal são ricos em ácidos graxos insaturados e líquidos à temperatura ambiente. A composição lipídica no tecido adiposo e no plasma sangüíneo refletem a natureza e quantidade de gordura ingerida pela dieta (Curi et al., 2002) Ácidos graxos monoinsaturados (AGM) Os ácidos graxos monoinsaturados podem ser encontrados em óleos vegetais como oliva, soja, milho, da castanha do Pará, entre outros. Estudos mostram que dietas ricas em ácido oléico, C18:1 n-9, reduzem as concentrações plasmáticas de LDL e protegem estas lipoproteínas da oxidação, sendo que as modificações oxidativas da LDL são fatores determinantes no desenvolvimento da aterosclerose. O grande potencial antiaterogênico dos AGM parece explicar parcialmente os benefícios da dieta mediterrânea (Curi et al., 2002; Judd et al., 2002; Lima et al., 2000) Ácidos graxos polinsaturados (AGP) Os ácidos polinsaturados das séries ômega 6 e ômega 3 são os mais importantes para o homem e para outras espécies animais. São ácidos graxos essenciais (AGE), os quais não são produzidos endogenamente pelos seres humanos, devendo ser 32

33 fornecidos pela dieta (Curi et al., 2002; Mayes, 1996). As duas séries n-3 e n-6 e seus derivados originam-se dos ácidos linoléico (18:2 (9c,12c)) e alfa-linolênico (18:3 (9c,12c,15c)), conforme é ilustrado na Figura 3. Concentrações adequadas de cada ácido graxo daquelas séries são necessários para que os processos metabólicos ocorram satisfatoriamente, prevenindo certas doenças (Simpoulos, 2006). A deficiência dos AG n-6 está associada a problemas dérmicos enquanto a dos da série n-3 a distúrbios neurológicos e visuais, entre outros (Curi et al., 2002). Os ácidos linoléico, 18:2 n-6 e o linolênico, 18:3 n-3, são encontrados em algumas oleaginosas, como girassol, canola, milho e soja. O ácido linolênico, 18:3 n-3, é precursor de alguns ácidos graxos muito importantes para o metabolismo, como o EPA (eicosapentaenóico, 20:5, n-3) e o DHA (docosahexaenóico, 22:6, n-3). Os óleos de origem marinha são boas fontes de EPA e DHA (Bobbio e Bobbio, 2003; Curi et al., 2002). Ácidos polinsaturados como araquidônico (AA) (20:4 n-6), EPA (20:5) e DHA (22:6), fazem parte da estrutura dos fosfolipídios das membranas celulares, tais como as do sistema nervoso central (Curi et al., 2002; Mayes, 1996). Os ácidos graxos polinsaturados das séries n-3 e n-6 apresentam efeitos antiaterogênicos, com a capacidade de redução da concentração do colesterol associado a LDL e efeitos antiinflamatórios sobre as células vasculares (Curi et al., 2002; Lima et al., 2007). São precursores de compostos denominados eicosanóides os quais são sintetizados em pequenas quantidades, a partir de ácidos graxos com cadeia acima de 20 átomos de carbonos. Apresentam potente atividade biológica na modulação de vários processos celulares. Por exemplo, o ácido EPA é precursor das prostaglandinas (PG) da série 3, as quais são fracos agregadores plaquetários, enquanto as tromboxanas (TX), derivadas do AA, possuem ação de vaso-constrição e agregação plaquetária, além de aumentarem a pressão sanguínea. O balanço entre PG e TX tem sido considerado importante para a função cardiovascular, uma vez que na aterosclerose a formação de placa fibrogordurosa (ateroma) resulta da agregação plaquetária (Chiara et al., 2002; Lima et al., 2007). 33

34 Ácido linoléico 18:2 n-6 Ácido α-linolênico 18:3 n-3-6-dessaturase Ácido γ-linolênico 18:3 n-6 Ácido estearidônico 18:4 n-3 PG Série 1 PGE1 Ácido dihomo-γ-linolênico 20:3 n-6 elongase Ácido eicosatetraenóico 20:4 n-3 cicloxigenase -5-dessaturase lipoxigenase Ácido araquidônico 20:4 n-6 Ácido eicosapentaenóico (EPA) 20:5 n-3 LT Série 4 elongase lipoxigenase LT Série 5 PG Série 3 PG série 2 TX série 2 Ácido adrênico 22:4 n-6-4-dessaturase Ácido docosapentaenóico 22:5 n-3 Ácido docoapentaenóico (DPA) 22:5 n-6 Ácido docosahexaenóico (DHA) 22:6 n-3 Figura 3. Passos metabólicos dos AGE das séries n-6 e n-3 (Mayes, 1996). 34

35 Estudos antropológicos, nutricionais e genéticos indicam uma mudança muito acentuada no balanço das séries n-6/n-3 das dietas humanas. Nos primórdios consta que esta relação era ao redor de 1:1, enquanto, atualmente nas dietas ocidentais, tem sido observada uma relação superior a 10:1, o que pode promover a patogênese de muitas doenças crônicas tais como: doenças cardiovasculares, câncer, osteoporoses, doenças inflamatórias e auto-imunes. (Simpoulos, 2006). O metabolismo dos ácidos graxos essenciais e o balanço e regulagem entre as séries n-3 e n-6, a partir das dietas, permanecem como uma das mais importantes áreas de pesquisa para o futuro (Curi et al., 2002; Mayes, 1996; Simpoulos, 2006) Ácidos graxos saturados (AGS) Os ácidos graxos saturados são encontrados na gordura das carnes vermelhas, principalmente de suínos e bovinos, em produtos lácteos e também em gorduras vegetais como a do óleo de coco e palma. Diversos estudos, realizados tanto em animais de experimentação como em seres humanos, têm demonstrado que a presença de ácidos graxos saturados na dieta aumenta os níveis de colesterol plasmático e, portanto, indicam uma correlação positiva com a incidência de doenças cardiovasculares (Lima et al., 2000). Esta evidência vem sendo confirmada desde os primeiros estudos de Ancel Keys (Keys, Anderson, Grande, 1957), na década de 50. O efeito varia segundo o tamanho da cadeia de ácido graxo, quantidade de colesterol da dieta e níveis prévios de colesterol plasmático (Bonanome e Grundy, 1988; Curi et al., 2002; Fattah, Fernandez, Namara, 1995) Os ácidos saturados láurico (12:0), mirístico (14:0) e palmítico (16:0) elevam os níveis de LDL-colesterol no sangue, sendo que os ácidos mirístico e o palmítico apresentam maior efeito hipercolesterolêmico (Curi et al., 2002; Fattah, Fernandez, Namara, 1995; Kris-Etherton e Yu, 1997; Lima et al., 2000). A contribuição na dieta de ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 átomos de carbono) é pouco significativa, sendo encontrados, principalmente, no leite e derivados. Estes ácidos graxos são metabolizados prontamente, e provavelmente não afetam os níveis de lipoproteínas no sangue (Curi et al., 2002; Vaz et al., 2006). 35

36 4.4. Ácidos graxos trans (AGT) Na gordura dos alimentos, a maioria dos ácidos graxos insaturados está presente na configuração geométrica cis. As enzimas envolvidas na síntese dos ácidos graxos são seletivas para esta configuração. Os ácidos graxos trans são digeridos, absorvidos e incorporados pelo organismo humano de forma similar aos ácidos graxos na configuração cis. Entretanto, a alteração da estrutura para a forma trans pode afetar vários processos fisiológicos influindo na função e no metabolismo dos ácidos graxos, como por exemplo, na sua incorporação nos fosfolipídios e sua transformação em prostaglandinas e outros eicosanóides sem atividade biológica (Padovesi e Mancini- Filho, 2002; Mayes, 1996). A configuração molecular mais estendida dos ácidos graxos trans confere maior similaridade de estrutura com a dos ácidos graxos saturados do que com os isômeros insaturados na forma cis (Padovesi e Mancini- Filho, 2002). Os ácidos graxos trans podem alterar a fluidez das membranas celulares e afetar a função e resposta de muitos tipos de células. Estes ácidos graxos têm sido correlacionados com a etiologia de várias disfunções metabólicas, como por exemplo, a inibição do metabolismo de ácidos graxos essenciais podendo, assim, influenciar o desenvolvimento infantil (Dyerberg et al., 2006; Padovesi e Mancini-Filho, 2002; Mayes, 1996; Mazoffarian et al., 2006). Entretanto, o efeito adverso à saúde mais marcante está relacionado a alteração dos níveis das lipoproteínas plasmáticas com aumento, por exemplo, da LDL-colesterol de forma semelhante aos ácidos graxos saturados e, portanto, do risco das doenças cardiovasculares (Aro et al., 1997; Ascherio et al., 1999; Judd et al., 2002; Mazoffarian et al., 2006; Muller et al.,1998; Padovesi e Mancini-Filho, 2002). Evidências consistentes da correlação da ingestão elevada dos ácidos graxos trans com o risco das doenças cardiovasculares só foram obtidas na década de 90. Ascherio et al. em um trabalho publicado em 1999, resumem os resultados de várias pesquisas (estudo randomizado) sobre a influência das dietas ricas em ácidos graxos saturados e trans nos lipídios do plasma sangüíneo, isto é nos níveis de LDL-colesterol e HDL- colesterol e na relação LDL/HDL-colesterol. A partir destes resultados tornouse mais evidente que os ácidos graxos saturados e trans aumentam os níveis de LDLcolesterol no plasma, enquanto os trans também diminuem os níveis de HDL- 36

37 colesterol, levando a uma variação mais acentuada na relação LDL/HDL, o que indica um efeito adverso à saúde superior ao dos ácidos saturados. Tem sido demonstrado que dietas ricas em AGT aumentam os níveis de triacilgliceróis no sangue e das lipoproteínas Lp(a), considerados fatores de risco para as doenças cardiovasculares, e podem elevar o risco para o desenvolvimento de diabetes tipo II (Dyerberg et al., 2006; Mazoffarian et al., 2006). Estudos recentes mostram que a relação entre ingestão dos AGT e a incidência de doenças cardiovasculares é maior do que a prevista pelas alterações nos níveis dos lipídios plasmáticos, sugerindo que os AGT influenciam o risco daquelas doenças por outros mecanismos, tais como a promoção de disfunção endotelial e de processos inflamatórios (Ascherio, 2006; Dyerberg et al., 2006; Mazoffarian et al., 2006). Estes estudos reforçam as evidências dos malefícios à saúde pela ingestão inadequada dos ácidos graxos trans Ácidos graxos conjugados CLA, conjugated linoleic acid, é o termo geral empregado para designar a mistura de isômeros posicionais e geométricos do ácido linoléico com duplas ligações conjugadas. O CLA pode ser formado no rúmen pela ação de bactérias, as quais isomerizam e biohidrogenam os ácidos linoléico, linolênico e outros ácidos graxos polinsaturados provindos da dieta (Cruz-Hernandez et al., 2004). Também podem ser formados endogenamente, pela desaturação do ácido graxo trans vacênico C18:1 (11t), pela ação da enzima 9-desaturase presente na glândula mamária e nos tecidos adiposos, levando a formação do isômero 18:2 (9c,11t) (Evans, Broown, Mc Intosh, 2002; Christie, 2006). Pelo menos vinte isômeros têm sido identificados, sendo que o 18:2 (9c,11t) é o isômero natural mais comum e responsável por 85 a 90% do total de CLA na dieta. Na gordura de animais ruminantes (gordura bovina, ovina), tem sido encontrado de 3,0 a 6,0 mg CLA/g de gordura e nos produtos lácteos, isto é, leite, queijo, iogurte, de 3,6 a 6,7 mg CLA/g de gordura (Evans, Brown, Mc Intosh, 2002; Christie, 2006). 37

38 São descritas propriedades anticarcinogênicas, hipocolesterolêmicas, de modulação da resposta imunológica e do metabolismo energético, em modelos com animais, atribuídas a dois isômeros trans dos CLA: 18:2 (9c,11t) e 18:2 (10t,12c) (Evans, Brown, Mc Intosh, 2002). Entretanto os estudos de tais benefícios para o homem ainda não são conclusivos. No Brasil, a ANVISA publicou em 28 de março de 2007 a resolução RE n 833, que determina a apreensão de todos os lotes do produto ácido linoléico conjugado (CLA) e não autoriza a fabricação, importação ou comercialização desse produto no país. Tal medida foi adotada pois os estudos científicos sobre o CLA, não comprovaram a segurança de uso e a eficácia das alegações de benefícios à saúde (Ministério da Saúde, 2007). Devido às evidências de que o ácido trans vacênico 18:1 (11t) seja o precursor do CLA 18:2 (9c,11t), tem sido importante considerar a determinação conjunta destes isômeros nas dietas e tecidos (Cruz-Hernandez et al., 2004). 5. Processos que levam a formação de AGT nos alimentos A conversão da ligação cis para trans nos ácidos graxos requer cerca de 65 Kcal/mol de energia. Devido a esta barreira energética, a isomerização não ocorre facilmente a menos que se utilizem catalisadores (Kodali e List, 2005) Biohidrogenação Pequenas quantidades de ácidos graxos trans podem estar presentes, naturalmente, na gordura de animais ruminantes (produtos lácteos, carnes bovina, ovina). São formados pelo processo de biohidrogenação no rúmen por ação de enzimas bacterianas. Nas gorduras, são encontradas quantidades de ácidos graxos trans que variam de 3 a 8% e o principal isômero formado é o do ácido octadecenóico com a dupla ligação no carbono 11, isto é, o ácido trans vacênico (18:1 11t). Este isômero é formado pela ação de isomerase e redutase nas duplas ligações dos carbonos 12 e 9, respectivamente, do ácido linoléico (Evans, Broown, Mc Intosh, 2002; Badolato, 2000; Mancini-Filho e Chemin, 1996; Tarrago-Trani et al., 2006). 38

39 5.2. Hidrogenação industrial de óleos vegetais insaturados A introdução dos ácidos graxos trans em quantidades consideráveis na dieta humana iniciou-se com a utilização do processo de hidrogenação das gorduras, já no começo do século XX (Badolato, 2000). Cerca de 80% dos ácidos graxos trans da dieta provêm das gorduras parcialmente hidrogenadas, obtidas em processo industrial de hidrogenação de óleos vegetais insaturados, como óleo de soja. Neste processo os óleos são submetidos a altas temperaturas em uma atmosfera de hidrogênio, sendo que a reação de adição de hidrogênios às duplas ligações é catalisada por metais finamente divididos, como o Ni. Na hidrogenação, ocorre a saturação de duplas ligações, algumas migram de posição e outras passam da forma cis para trans, sendo que no processo forma-se uma gama variada de isômeros geométricos e de posição dos ácidos graxos (Padovesi e Mancini-Filho, 2002). O principal isômero trans formado é o ácido elaídico, isto é, o ácido trans 9 octadecenóico (18:1 9t). A Figura 4 ilustra as diferentes distribuições dos isômeros trans do ácido octadecadienóico em gordura de leite, isto é de animal ruminante e na GVPH empregada na elaboração da margarina. A B Figura 4. Distribuição relativa dos isômeros trans 18:1 em: A) Gordura de leite de vaca B) Margarina. Fonte: Mossoba et al.,

40 As duplas ligações dos ácidos graxos insaturados têm energias de ativação diferentes e, portanto, não adicionam o hidrogênio com igual facilidade. Em compostos polinsaturados a hidrogenação se dá de maneira seletiva, atacando em primeiro lugar apenas uma das insaturações, preferencialmente do ácido mais insaturado. O ponto de fusão dos ácidos aumenta com a diminuição do número de insaturações na molécula e, portanto, por este processo são obtidos produtos sólidos ou semi-sólidos. Geralmente emprega-se a hidrogenação parcial uma vez que a saturação completa das duplas resulta em produtos com ponto de fusão muito alto, que são inadequados nas indústrias alimentícias (Badolato, 2000; Kodali e List, 2005). Diferentes fatores influenciam na reação de hidrogenação quanto a formação de AGT. O aumento da temperatura aumenta a seletividade e o teor de ácidos graxos trans. O aumento da pressão de gás, da concentração do catalisador e da agitação diminui a seletividade e o teor de ácidos graxos trans (Kodali e List, 2005). As gorduras hidrogenadas são empregadas na elaboração de margarinas, produtos de panificação tais como biscoitos, bolos, batatas fritas, sendo que estes produtos são muito consumidos por crianças e adolescentes (Aued-Pimentel et al, 2003; Chiara, Schieri, Carvalho, 2003; Martin et al., 2005; Winter et al., 2006). Algumas gorduras hidrogenadas podem conter de 10-60% de AGT, sendo o mais comum o conteúdo entre 25 a 45%. Já as margarinas podem conter de 0,1-15% de isômeros trans (Badolato, 2000; Tarrago-Trani et al., 2006). A hidrogenação dos óleos vegetais tem como objetivo produzir gorduras de baixo preço, as quais promovam melhorias na plasticidade dos alimentos e sejam mais resistentes à oxidação (Kodali e List, 2005). As indústrias de óleos e gorduras dos países da Europa e dos Estados Unidos vêm há alguns anos empregando processos tecnológicos que visam minimizar a formação de isômeros trans nas gorduras hidrogenadas ou substituí-las por outras com equivalente aplicação industrial. Este processo tem ocorrido face às implicações à saúde e as exigências legais de declaração dos níveis daqueles componentes na rotulagem dos alimentos (Kodali e List, 2005). No Brasil, atualmente, tem sido sinalizada esta mesma tendência. 40

41 Os seguintes processos têm sido utilizados para diminuir os níveis de AGT nos alimentos: Utilização das frações do óleo de palma na elaboração das gorduras. Interesterificação: hidrólise dos TAG e redistribuição dos ácidos graxos na molécula de TAG de maneira aleatória ou dirigida. Hidrogenação total da gordura, seguida de mistura com óleo ou gorduras líquidas ou ainda seguida de interesterificação. Misturas de gorduras parcialmente hidrogenadas com óleos com alto teor de ácido oléico. Condições especiais no processo de hidrogenação (temperatura e pressão). Produção de sementes oleaginosas com composição modificada de AG (processos tradicionais de reprodução de sementes ou engenharia genética) ( Badolato, 2000; Bobbio e Bobbio, 2003, Kodali e List, 2005; Ribeiro et al., 2007; Tarrago-Trani et ali., 2006). A utilização de gorduras alternativas, para a substituição dos AGT, deve ser avaliada com cuidado, uma vez que tais mudanças podem gerar produtos alimentícios com altos teores de AGS e baixos de AGE, os quais também poderiam implicar em efeitos adversos à saúde do consumidor (Tarrago-Trani et ali., 2006) Refino industrial de óleos vegetais polinsaturados e processo de fritura dos alimentos No processo de refino dos óleos vegetais, podem ser formados ácidos graxos trans, principalmente, quando são empregadas altas temperaturas de desodorização. São formados principalmente ácidos graxos trans com duas e três insaturações (18:2 e 18:3), os quais apresentam maior reatividade nas condições de desodorização. Neste caso, as duplas não mudam de posição ocorrendo apenas a isomerização da dupla ligação da forma cis para trans (Van Bruggen et al., 1998; Duchateau, Van Oosten, Vasconcelos, 1996). A quantidade de ácidos graxos trans formados durante a desodorização é dependente da temperatura, do tempo do processo e da quantidade de ácidos graxos polinsaturados presentes nos óleos vegetais. A desodorização acorre 41

42 em temperaturas entre 180 e 260 C, sendo que abaixo d e 200 C pode -se evitar a formação de AGT (Grob, 2007). Entretanto, em condições de temperatura de desodorização extremas (> 250 C) o nível daqueles ácidos graxos pode ser superior a 3% (Ceriani e Meirelles, 2007; Wolff, 1993). Ácidos graxos trans também se formam, em pequenas quantidades, durante a fritura de alimentos. Sua formação está relacionada com o tipo de óleo, temperatura e tempo de utilização deste óleo no processo de fritura (Martin et al., 2007; Sanibal e Mancini-Filho, 2004). Tem sido demonstrado que os AGT começam a se formar, por exemplo, em frituras com óleos vegetais polinsaturados, em temperaturas a partir de 150 C, sendo que os teores aumentam significativamente a cima de 250 C (Martin et al., 2007). Em vários países da Europa a recomendação é de que a temperatura dos óleos de fritura não exceda 180 C (Martin et al., 2007). N o Brasil, a RDC 216/04 da ANVISA (Ministério da Saúde, 2004b) contem orientações aos preparadores de alimentos quanto às boas práticas de fabricação para utilização e descarte de óleos utilizados em frituras, e também limita a 180 C a temperatura d o processo. 6. Ácidos graxos saturados e trans: fatores de risco para doenças cardiovasculares Os relatórios da OMS, nas últimas décadas, têm evidenciado uma crescente epidemia de doenças crônicas, como doenças cardiovasculares, obesidade e diabetes, que atingem tanto países desenvolvidos como em desenvolvimento. Os principais fatores de risco para as doenças crônicas são: hipertensão arterial, altos níveis de colesterol plasmático (hipercolesteremia), ingestão inadequada de frutas e verduras, sobrepeso ou obesidade, sedentarismo e tabagismo, sendo que cinco fatores de risco estão intimamente relacionados à dieta e à atividade física. No mundo, e também no Brasil, as doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade (Martinez et al., 2003; OMS, 2003) e o número de obesos dobrou nos últimos 20 anos, sendo que a obesidade cresceu sensivelmente também entre crianças e adolescentes (Zorzeto e Bicudo, 2003). 42

43 A partir de meados do século XX, o mundo tem sofrido mudanças que se refletem nos hábitos alimentares, a princípio nas regiões industrializadas e, mais recentemente, nos países em desenvolvimento. As dietas tradicionais baseadas principalmente em alimentos de origem vegetal foram substituídas rapidamente por dietas com alto teor de gordura e, portanto mais calóricas. Em resposta às mudanças nos hábitos alimentares e no modo de vida, houve um aumento das enfermidades crônicas. Cerca de metade do total das mortes por doenças crônicas são atribuídas às doenças cardiovasculares. A obesidade e a diabetes também mostram tendências preocupantes, pois afetam uma grande parte da população e estão começando a aparecer em faixas etárias mais jovens (OMS, 2003). Estudos epidemiológicos e metabólicos têm evidenciado que a ingestão inadequada de ácidos graxos saturados e trans está associada ao risco das doenças cardiovasculares (Keys, Anderson, Grande, 1957; Ascherio et al, 1999; Mazoffarian et al., 2006). A Tabela 4 apresenta o grau de evidência da associação entre exposição a fatores ligados ao estilo de vida (dieta e atividade física) e o risco para doenças cardiovasculares, segundo relatório da OMS (2003). 43

44 Tabela 4. Grau de evidência da associação entre exposição a fatores ligados ao estilo de vida (dieta e atividade física) e o risco para doenças cardiovasculares. Grau da evidência Convincente Diminuição do risco Atividade física regular Ácido linoléico Peixes e óleos de peixe (EPA e DHA) Vegetais e frutas Potássio Ingestão baixa a moderada de álcool Não correlacionado Suplementação com Vitamina E Aumento do risco Ácido mirístico e palmítico Ácidos graxos trans Alta ingestão de sódio Sobrepeso Ingestão alta de álcool Provável Ácido alfa linoléico Ácido oléico Cereais integrais Sementes oleaginosas Esteróis e estanóis dos vegetais Folatos Ácido esteárico Colesterol da dieta Possível Flavonóides Produtos de soja Gorduras ricas em ácido láurico Insuficiente Cálcio Magnésio Vitamina C Carboidrato Ferro Fonte: OMS, Políticas mundiais de saúde para prevenir as enfermidades crônicas As doenças crônicas oneram o sistema de saúde e atingem uma grande parte da população economicamente ativa. Em função disto, os países membros da Organização Mundial de Saúde têm interesse crescente de adotar políticas eficazes e sustentáveis para prevenir estas enfermidades. Em maio de 2004, a OMS e seus 192 países membros, na 57 a Assembléia Mundial de Saúde, lançaram a Estratégia Global sobre Dieta, Atividade Física e Saúde. Trata-se de uma campanha que está sendo implementada mundialmente para incentivar a adoção de uma dieta balanceada e da prática regular de exercícios físicos (OMS, 2004a). 44

45 Nos países do ocidente, no começo desta década, a gordura consumida diariamente correspondia de 35 a 45% da energia total da dieta (80 a 150g/dia); os ácidos graxos saturados contribuiam com cerca de 13% da energia (30 g/dia) e os trans de 1,0 a 2,5% da energia (2,5-5,5 g/dia) (Allison et al.,1999; Hulshof et al.,1999). As recomendações da OMS é que a gordura total da dieta não ultrapasse 30% da energia, que os AGS não passem de 10% e os trans contribuam com menos que 1% desta energia, isto é, que não seja ingerida mais de 2 g por dia de ácidos graxos trans (OMS, 2003; OMS 2004a). A Tabela 7 apresenta as recomendações diárias da OMS para alguns nutrientes. Tabela 5. Recomendações da OMS para ingestão diária de alguns nutrientes. Nutriente Valores recomendados (% total de energia diária) Gordura total 15-30% Saturada < 10% Polinsaturada 6-10% n % n-3 1-2% Trans < 1% Monoinsaturada Obtida por diferença a Carboidratos totais 55-75% Proteína 10-15% Colesterol 300mg/dia Frutas e vegetais 400g por dia Fonte:OMS, a Calculado como: gordura total - (gordura saturada+gordura polinsaturada+gordura trans). A Comissão do Codex Alimentarius, criada em 1962 pela FAO/WHO, tem como objetivo estabelecer padrões para os alimentos, protegendo assim a saúde do consumidor e incentivando práticas justas no comércio internacional. Entre os vários comitês do Codex, existe um dedicado à rotulagem nutricional o qual tem desenvolvido guias de orientação para a rotulagem nutricional. Estes guias recomendam que a declaração dos nutrientes na rotulagem seja voluntária. A declaração obrigatória deve ser feita para aqueles alimentos cujos rótulos apresentem alguma alusão ou apelo nutricional e alimentos para fins especiais. Diversos países têm adotado esta orientação, principalmente os da Europa. Outros países, considerando a condição de 45

46 saúde de sua população, têm adotado a rotulagem obrigatória, sendo que este grupo tem aumentado (Hawke, 2004). As legislações em diversos países do mundo têm exigido maior detalhamento na rotulagem dos alimentos sobre determinados grupos de ácidos graxos, como por exemplo, os ácidos graxos saturados e trans, os quais estão relacionados com o risco de doenças cardiovasculares, além do nível de ácidos graxos essenciais (Ministério da Saúde, 1998; Ministério da Saúde, 2001a; Ministério da Saúde, 2001b; Ministério da Saúde, 2003a; Ministério da Saúde, 2003b; Federal Register,1993, 2003; OMS, 2003). As informações nutricionais na rotulagem têm facilitado aos consumidores conhecerem as propriedades nutricionais dos alimentos e contribuído para um consumo adequado dos mesmos, sendo uma estratégia da Organização Mundial de Saúde no combate as doenças crônicas (OMS, 2004a). Israel e os Estados Unidos, em 1993, foram os primeiros países a exigirem a declaração de nutrientes na rotulagem dos alimentos embalados. Esta exigência entrou em vigor no Brasil a partir de setembro de 2001 (Ministério da Saúde, 2001b). Outros países como Nova Zelândia, Canadá e Malásia adotaram a declaração obrigatória sendo que a partir de 2006 tal exigência foi estendida aos paises do Mercosul, além do Brasil (Hawke, 2004; Mancini-Filho, Takemoto e Aued-Pimentel, 2007). Com relação à declaração de ácidos graxos trans, esta passou a ser obrigatória nos Estados Unidos desde julho de 2003 e a partir de dezembro do mesmo ano, no Brasil e países do Mercosul, sendo que os produtores tiveram o prazo de adequação dos rótulos até o ano 2006 (Ministério da Saúdel, 2003b; Federal Register, 2003). Na Dinamarca, em 2004, foi estabelecida uma legislação limitando a 2% os níveis de AGT, obtidos por processos industriais, dos alimentos comercializados naquele país (Leth et al., 2006). Em 2005, na cidade de Nova York, Estados Unidos, o Departamento de Saúde e Higiêne Mental passou a exigir dos restaurantes e fornecedores de alimentos que eliminassem de suas cozinhas as GVPH, visando produzir alimentos livres de AGT provenientes de processo industrial (Mazoffarian et al., 2006). 46

47 8. Legislação brasileira sobre rotulagem nutricional de alimentos embalados O Sistema Único de Saúde, SUS, atualmente em vigor no Brasil, foi estabelecido na Constituição Federal de Estão no campo de atuação do SUS a execução de ações de vigilância sanitária, de nutrição e a orientação nutricional (Brasil, 1990). A partir de 1998, no Brasil, foram publicadas pelo Ministério da Saúde várias portarias internalizando recomendações do Codex Alimentarius, referentes à rotulagem de alimentos e alimentos para fins especiais, visando a orientação nutricional do consumidor. Pela lei n 9782 de 1999 ficou definido o Sistema Naci onal de Vigilância Sanitária e foi criada a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, ANVISA (Brasil, 1999). Compete a Agência coordenar o Sistema Nacional de Vigilância Sanitária por meio de ações como o estabelecimento de normas e padrões sobre limites de contaminantes, resíduos tóxicos, desinfetantes, metais pesados e outros que envolvam risco à saúde; propor, acompanhar e executar as políticas, as diretrizes e as ações de vigilância sanitária (Brasil, 1999). No Brasil, a política de Alimentação e Nutrição do Ministério da Saúde, é voltada para a redução da prevalência das doenças nutricionais e orientação para o consumo de alimentos saudáveis. A partir de 2001 passou a vigorar uma resolução da ANVISA com exigências de declarações de rotulagem nutricional. A Resolução RDC 40/01(ANVISA/MS) de março de 2001, trouxe um regulamento mais consistente para rotulagem nutricional de alimentos embalados. Esta resolução vigorou até final do ano de 2003 (Ministério da Saúde, 2001b). Em 2003, a RDC n 40/01 foi substituída pela RDC n 3 60/03, que é uma legislação harmonizada entre os países do Mercosul. Nela consta a exigência da declaração de valor energético e teores de carboidratos, proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans, fibra alimentar e sódio. A partir desta resolução, a declaração no rótulo do conteúdo de colesterol, ferro e cálcio deixaram de ser obrigatórias. Empresas de alimentos, brasileiras e do mercosul, tiveram o prazo até 31 de julho de 2006 para se adequarem (Mancini-Filho, Takemoto e Aued-Pimentel, 47

48 2007). Abaixo são relacionados alguns pontos importantes que foram estabelecidos pelas legislações sobre rotulagem nutricional no Brasil: A obrigatoriedade da Informação Nutricional do valor energético (Kcal e KJ), carboidratos, proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans, fibra alimentar e sódio. A padronização dos rótulos para facilitar a leitura e o entendimento das informações pelo consumidor. Tolerância: 1. É admitida uma tolerância de ±20% com relação aos valores de nutrientes declarados no rótulo. 2. Para os produtos que contenham micro-nutrientes em quantidade superior a tolerância estabelecida no item anterior, a empresa responsável deve manter a disposição os estudos que justifiquem tal variação. A informação Nutricional deve ser apresentada na porção e em medidas caseiras. Pela legislação em vigor não é obrigada a declaração em 100g ou 100 ml do produto. Todas as informações contidas nos rótulos dos alimentos devem ser apresentadas em porções. Porção é a quantidade média do alimento que deveria ser consumida por pessoas sadias, maiores de 36 meses de idade em cada ocasião de consumo, com a finalidade de promover uma alimentação saudável. Medida Caseira: é um utensílio comumente utilizado pelo consumidor para medir alimentos. As resoluções RDC n 39/01 e RDC n 359/03, esta última at ualmente em vigor, apresentam os Regulamentos Técnicos de Porções de Alimentos para fins de Rotulagem Nutricional (Ministério da Saúde, 2001a; Ministério da Saúde 2003a). Pela legislação em vigor, os teores de ácidos graxos saturados e trans podem ser declarados como zero, quando presentes no alimento em quantidade inferior a 0,2g na porção. Para gordura total, o teor é considerado não significante, ou zero, quando 48

49 menor que 0,5g na porção do alimento e nenhum outro tipo de gordura seja declarado com quantidades superiores a zero (Ministério da Saúde, 2003b). Quanto aos ácidos graxos monoinsaturados ou polinsaturados e o teor de colesterol, a declaração na rotulagem dos alimentos tem caráter opcional segundo a Portaria nº 27/98, da ANVISA/MS, a qual dispõe sobre a informação nutricional complementar, entretanto, quando são apresentados apelos na embalagem, relativos à presença destes nutrientes no alimento, a declaração na rotulagem é obrigatória. Alegações para ácidos graxos trans tais como: zero trans, livre de trans e outras, previstas na Portaria n 27/98, podem ser utilizadas de sde que o alimento pronto para o consumo atenda às seguintes condições: máximo de 0,2 g de gordura trans por porção e máximo de 2g de gordura saturada por porção (Ministério da Saúde, 1998; Ministério da Saúde, 2007). Aos laboratórios brasileiros credenciados, cabe verificar tais teores declarados. 9. Determinação de lipídios ou gordura total (GT) e ácidos graxos (AG) nos alimentos Um dos objetivos da determinação de GT (ou lipídios) e da composição de AG nos alimentos é gerar dados para a informação nutricional. Dependendo da legislação sobre rotulagem nutricional em vigor em cada país, teremos diferentes definições para a GT que deve constar na rotulagem nutricional dos alimentos. Nos Estados Unidos e o Canadá foi adotada a definição química de gordura total, para fins de rotulagem nutricional, como a soma dos ácidos graxos que originam-se das diferentes classes de lipídios (mono, di, triacilgliceróis, fosfolipídios e ésteres de esteróis), expressa como triacilgliceróis. Os ácidos graxos saturados, mono e polinsaturados devem ser expressos como ácidos graxos livres (Federal Register, 1993). Na legislação brasileira em vigor sobre rotulagem nutricional dos alimentos, Resolução RDC n 360/03, as definições relacionadas aos comp onentes lipídicos dos alimentos são as seguintes: 49

50 Gorduras ou lipídios: são substâncias de origem vegetal ou animal, insolúveis em água, formadas de triglicerídeos e pequenas quantidades de não glicerídeos, principalmente fosfolipídios ; Gorduras saturadas: são os triglicerídeos que contêm ácidos graxos sem duplas ligações expressos como ácidos graxos livres. Gorduras monoinsaturadas: são os triglicerídeos que contêm ácidos graxos com uma dupla ligação cis, expressos como ácidos graxos livres. Gorduras polinsaturadas: são os triglicerídeos que contêm ácidos graxos com duplas ligações cis-cis separadas por grupo metileno, expressos como ácidos graxos livres. Gorduras trans: são os triglicerídeos que contêm ácidos graxos insaturados com uma ou mais dupla ligação trans, expressos como ácidos graxos livres. A legislação brasileira não especifica metodologias analíticas para a determinação de GT e de AG que farão parte da informação nutricional. A técnica de cromatografia em fase gasosa é a recomendada para a análise de rotina de ácidos graxos (Mossoba et al., 2003). Quanto à determinação de gordura total, pela definição da legislação brasileira, diferentes metodologias podem ser aplicadas (Adrian et al., 2000; Antoniassi e Lago, 2000; Kirk, Sawer, Egan, 1996; Lago, Piombo, Antoniassi, 2004). Portanto a determinação da GT e, conseqüentemente dos AG, estará sujeita a variações que dependerão da metodologia analítica. Três etapas analíticas são críticas: extração dos lipídios; preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir dos lipídios extraídos; quantificação por CG Extração dos lipídios A extração de lipídios é uma etapa importante no estudo nutricional dos alimentos e, especialmente, na determinação da composição de ácidos graxos. A preparação da amostra para esta determinação deve ser cuidadosa sendo que em 50

51 alguns procedimentos e matrizes pode ocorrer a co-extração dos não-lipídios, oxidação indesejada, perda dos compostos mais voláteis e dificuldade de extração dos lipídios ligados a outras moléculas, influenciando na qualidade final do óleo, e, principalmente, no perfil de ácidos graxos (Adrian et al., 2000; Antoniassi e Lago, 2000; Kirk, Sawer, Egan, 1996; Lago, Piombo, Antoniassi, 2004; Lutheia, 2004). A quantificação dos lipídios dos alimentos é realizada, tradicionalmente, por extração com solventes orgânicos e determinação gravimétrica. A habilidade de recuperar os vários componentes dos lipídios varia com o solvente de extração. A ampla faixa de polaridade dos lipídios faz com que a escolha do solvente seja uma tarefa difícil. Diferentes tipos de ligações e energias envolvem as moléculas que deverão ser extraídas. Os solventes mais usados são: éter etílico, éter de petróleo e clorofórmio-metanol. Todos estes solventes extraem triacilgliceróis. O éter etílico e o de petróleo extraem mono, di e triacilgliceróis, esteróis e ácidos graxos. Solventes mais polares, como a mistura de clorofórmio e metanol, também extraem lipídios polares como fosfolipídios, esteróis, terpenos, ceras, hidrocarbonetos e outros componentes não lipídicos (AOAC, 2005; Carpenter, Ngeh-Ngwainbi e Lee, 1993; Kirk, Sawer e Egan,1996; Lutheia, 2004; Report AOAC, 1993). Os métodos que empregam a mistura clorofórmio metanol são reconhecidos como os mais adequados para a extração de todos os componentes dos lipídios, sendo que o extrato obtido pode ser empregado para a caracterização das frações (Christie, 2006; Hubbard et al., 1977; Sahasrabudhe e Smallbone,1983). A AOAC reconheceu alguns procedimentos empregando estes solventes para extração de lipídios em alimentos, para os quais não há metodologia estabelecida. Em um dos métodos são utilizadas enzimas (amilases e proteases) para facilitar a extração (AOAC , 1984). Nos métodos de Bligh e Dyer (1959) e de Folch, Lees, Stanley (1957), que empregam a mistura de clorofórmio e metanol, as proporções entre os solventes de extração, entre a massa da amostra e os solventes, o modo de preparação da amostra, o tempo de agitação, o teor de gordura e o tipo de produtos, são críticos, influenciando a eficiência de extração (Iverson, Lang, Cooper, 2001, Ametaj et al., 2003). 51

52 Para facilitar a extração dos lipídios ligados a outros componentes dos alimentos, as matrizes alimentares são freqüentemente tratadas (Adrian et al., 2000; AOAC, 2005; Lago, Piombo, Antoniassi, 2004; Antoniassi e Lago, 2000; Kirk, Sawer, Egan, 1996; Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993). Estes tratamentos incluem: adição de álcali para solubilizar proteína (ex: hidróxido de amônio) e quebrar emulsões; adição de ácidos para quebrar emulsões ou hidrolisar matrizes e lipídios complexos; hidrólise ácida com HCl para liberar os ácidos graxos dos acilgliceróis, fosfo e glicolipídios e de ésteres de esteróis; hidrólise química ou enzimática de proteínas e polissacarídios; pré-lavagem das amostras que contêm muito açúcar para remoção deste interferente; secagem do solvente e re-extração com um solvente de diferente polaridade; pré-secagem da amostra para a remoção de água como interferente. Os métodos que envolvem hidrólise ácida tendem a decompor os fosfolipídios e, possivelmente, os triacilgliceróis, dependendo da concentração do ácido utilizado. A hidrólise ácida, seguida da extração com éter de petróleo, extrai os lipídios neutros e também pode extrair outros constituintes que não compõem a gordura, tais como: glicerol, carboidratos de baixo peso molecular e seus produtos de polimerização, aminoácidos e sais de uréia. Os resultados obtidos por este método normalmente superestimam o valor da gordura total do alimento (Carpenter, Ngeh-Ngwainbi e Lee, 1993). Sendo assim, a gordura extraída empregando hidrólise pode não ser apropriada na avaliação correta da composição de ácidos graxos de alguns alimentos (Kirk, Sawer, Egan, 1996, Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993). Nos Estados Unidos, a partir do estabelecimento, em 1990, da lei sobre educação nutricional e rotulagem dos alimentos (Federal Register, 1990), uma força tarefa ( Task Force on Methods for Nutritional Labeling Analysis ) organizada pela Association of Official Analytical Chemists, AOAC, reconheceu alguns métodos que devem ser aplicados para análise de gordura em diferentes matrizes alimentares para 52

53 fins de rotulagem nutricional, mas considerou que tais métodos deveriam ser aperfeiçoados (Report AOAC, 1993). Nos Estados Unidos e Canadá, foi adotada uma definição química para gordura, para fins de rotulagem nutricional, a qual limita o que é quantificado e expresso como gordura, evitando, assim, o emprego de diferentes metodologias que forneçam resultados muito discrepantes (Federal Register, 1993). Outro ponto a se considerar é a toxicidade dos solventes que são empregados nos métodos convencionais de extração de gordura. As legislações de proteção ambiental e de biossegurança têm previsto a redução na utilização de solventes tóxicos e exigido o descarte adequado (Ministério da Saúde, 2004a). A Tabela 6 apresenta algumas constantes físicas destes solventes e aspectos sobre toxicidade. Tabela 6. Propriedades físicas e aspectos de toxicidade de alguns solventes orgânicos empregados na extração de lipídios dos alimentos. Solvente PE ( C) b Constante dielétrica (25 C) Toxicidade a,b,c, n-hexano* 69 1,89 Baixa Irritante da pele Tolueno 110 2,38 Alta Éter etílico 35 4,33 Média Clorofórmio 61,7 4,81 Alta Irritante para os olhos e pele. Depressor do sistema nervoso central (SNC) Irritante para os olhos e sistema respiratório. Pode afetar SNC Nocivo quando inalado, ingerido ou em contato com a pele. Possivelmente carcinogênico para o homem d Iso-Propanol 82,5 18,3 Baixa Tóxico se ingerido Acetona 56,5 20,7 Baixa Levemente irritante para os olhos, nariz e garganta. A inalação pode causar tontura, narcose e coma Metanol Alta Nocivo quando inalado, ingerido ou em contato com a pele. Afeta SNC Água a OMS, 2004b; b The Merck Index, 1996; c Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993; d IARC, 1999, * Hidrocarbonetos saturados de cadeia curta reta (pentano, hexano até octano) são bons solventes para lipídios e possuem baixa toxicidade c. PE: ponto de ebulição 53

54 Algumas técnicas mais modernas de extração de gordura têm sido propostas para reduzir significativamente o tempo e o consumo de solvente e fornecer resultados equivalentes. Entre estas técnicas, destacam-se a extração acelerada com solvente (EAS), a extração com fluído supercrítico (EFSC), a extração dinâmica por ultrassom e com auxílio de microondas (Lutheia, 2004). A EAS é uma técnica automatizada de extração onde o solvente, à alta temperatura (de 80 a 200 C) e pressão (500 a 3000 psi), é bombeado em celas de extração que contêm as amostras. O aumento da temperatura permite que a extração seja feita num tempo bem inferior aos processos tradicionais (Buldini, Cavalli, Trifiro, 1997). O EAS tem sido utilizado na extração de compostos lipossolúveis para diversas finalidades. Schäfer (1998) empregou a EAS para testar misturas binárias (clorofórmiometanol e isopropanol-hexano) quanto à eficiência de extração dos lipídios e determinação de ácidos graxos em alimentos como: gema de ovo, cereais e peito de frango. A eficiência foi testada em comparação com o método de Folch modificado. Para os cereais e gema de ovo, os melhores resultados foram observados empregando isopropanol-hexano e para produto cárneo com clorofórmio e metanol. A AOCS aprovou em 2004 um método rápido de extração de lipídios, com solvente a alta temperatura, para diversos alimentos, entre eles sementes oleaginosas e produtos cárneos. O processo emprega éter de petróleo e os compostos extraídos são essencialmente triacilgliceróis. Este método mostrou-se equivalente ao método que emprega os extratores de Butt e Soxhlet (AOCS Am 5-04, 2004). A extração com fluído supercrítico utilizando CO 2 e modificado com metanol ou etanol (auxiliar na extração dos lipídios polares), tem sido um método alternativo para isolar a gordura de diferentes produtos processados. Fluidos supercríticos exibem propriedades físico-químicas intermediárias de um líquido e um gás, o que aumenta sua ação como solvente. Possuem difusividade alta e viscosidade baixa, propriedades que conferem bom poder de solvência. Berg e Dahlberg (2002) e Snyder, King, Jackson (1996) empregaram a EFSC para determinar a gordura e os ácidos graxos em produtos cárneos. Um processo de transmetilação enzimática (hidrólise enzimática) para preparação de ésteres metílicos também foi testado e comparado com o procedimento convencional. Nos dois trabalhos, os valores obtidos foram 54

55 compatíveis com os métodos tradicionais de extração com solventes e de preparação de ésteres metílicos. Esta técnica tem sido reconhecida também pela equivalência com métodos convencionais de extração de gordura e foi incluída entre os métodos da AOCS para extração de gordura em sementes oleaginosas (AOCS Am 3-96, 2000; Carrapiso e Garcia, 2000; Hopper et al., 1995). Métodos que empregam energias, tais como, microondas e ultrassom, para facilitar a extração de gordura em produtos alimentícios, têm sido comparados aos tradicionais. Ruiz-Jiménez e Castro (2004) compararam a extração dinâmica por ultrassom com o método de extração por Soxhlet, em produtos de panificação, empregando como solvente, nos dois casos, n-hexano. Aqueles pesquisadores verificaram resultados equivalentes entre os procedimentos, com boa repetitividade e reprodutibilidade (inferiores a 3%) e redução significativa do tempo (5 a 8 vezes menor) e volume de solvente (20-25 ml), para a maioria dos alimentos analisados. O fenômeno associado à sonicação produz altas temperaturas e pressões, resultando em um maior poder de extração. Em outro trabalho, Ruiz-Jiménez et al. (2004) compararam a extração por Folch aos métodos de extração dinâmica por ultrassom e microondas, obtendo resultados equivalentes para produtos de panificação. Outros trabalhos comparativos do uso da energia de microondas com métodos tradicionais de extração de gordura em produtos alimentícios como leite, ovo em pó e carne, têm demonstrado a equivalência das metodologias (Carrapiso e Garcia, 2000; Lutheia, 2004; Priego-Capote et al., 2007). Uma desvantagem destes métodos de extração é a necessidade de otimizar as variáveis que influenciam na extração para cada tipo de produto, uma vez que os teores de gordura e de água dos alimentos afetam a eficiência de extração (Carrapiso e Garcia, 2000; Lutheia, 2004). A Tabela 7 apresenta um resumo sobre os principais métodos convencionais de extração de lipídios, campo de aplicação, vantagens e limitações. 55

56 Tabela 7. Métodos convencionais de extração de lipídios: princípio, campo de aplicação, vantagens e limitações. Método Princípio Campo de aplicação/métodos oficiais Extração com éter etílico ou de petróleo Extração por passagem contínua ou intermitente de solvente na amostra em equipamento como Soxhlet Sementes oleaginosas AOAC Produtos cárneos AOAC Cereais AOAC A Manteiga AOAC Rações AOAC B,C Vantagens Automação Boa repetitividade Padronização Limitações Procedimento demorado Não extrai lipídios polares Não aplicado a alimentos com muita umidade Subestima teor de gordura total Extração a frio com clorofórmio/metanol/ gravimetria Extração baseada nos métodos de: Folch, Lees e Stanley (1957) Clorofórmio:Metanol (2:1) solvente/amostra 20:1 Bligh e Dyer (1959) Clorofórmio:Metanol:água(1:2:0,8) Tecidos biológicos (produtos cárneos, ovos, produtos lácteos). Qualquer alimento que não possua metodologia estabelecida: AOAC (com enzima, amilase+protease) AOAC (sem enzima) para pescados Extração de lipídios neutros e polares Preservação de componentes lipídios (AG de baixo PM e polinsaturados) Procedimento demorado. Co-extração de proteínas Proporções entre os solventes e entre solvente e amostra são críticas para a eficiência de extração Solventes tóxicos Custos com descarte de resíduos Hidrólise ácida/ extração com solventes/gravimetria Hidrólise com aquecimento e extração com solventes (éter petróleo e/ou etílico) Produtos de cacau AOAC Ovos AOAC Molhos AOAC Farinhas pães e produtos de panificação AOAC Macarrão AOAC 925,12; D; Frutos do mar AOAC e outros Métodos oficiais Boa repetitividade Extração de lipídios neutros e polares Procedimento demorado Hidrólise de TAG e FL Extração de compostos não lipídicos (glicerol, carboidratos de baixo PM, e produtos de polimerização) Emprego de ácidos fortes Comprometimento de ácidos graxos com sítios reativos (insaturações) Hidrólise alcalina/ extração com solventes/gravimetria Hidrólise com NH 4OH etanólico/ extração com éter de petróleo+éter etílico/gravimetria. (Roese Gottlieb) Leite e produtos lácteos -AOAC Método oficial Extração de lipídios neutros e polares Hidrólise de TAG Perda de componentes dos lipídios na fase aquosa Fonte: Report AOAC, 1993; AOAC, 2005; Kirk, Sawer, Egan,1996, Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993; Lago, Piombo, Antoniassi,

57 9.2. Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos A análise por cromatografia em fase gasosa dos ácidos graxos, livres ou ligados aos diferentes componentes lipídicos dos alimentos, requer sua prévia transformação em derivados mais voláteis e, normalmente, são preparados ésteres metílicos de ácidos graxos. Dependendo da aplicação, outros ésteres menos voláteis podem ser preparados como o etílico, butírico e isopropílico. São descritos muitos procedimentos e cada método possui vantagens e limitações, dependendo das características da gordura a ser analisada (Adrian et al., 2000; Christie, 1993). As reações de derivação são geralmente catalisadas por ácidos ou bases, e envolvem dois processos: hidrólise e esterificação (normalmente metilação) ou transesterificação. Os ésteres metílicos se formam a partir de: 1. Ácidos graxos livres em meio ácido ou com diazometano (esterificação). 2. Ácidos graxos ligados a lipídios por ligações ésteres, (triacilgliceróis, fosfolipídios) em meio ácido ou básico. 3. Ácidos graxos ligados a grupamento N-acila em lipídios complexos em meio ácido. O Esquema 1 apresenta uma reação de esterificação em meio ácido. São empregados catalisadores, como trifluoreto de Boro (BF 3 ), para que a esterificação ocorra rapidamente. Cada passo da reação é reversível, mas com excesso de álcool o equilíbrio é deslocado e a reação pode ser considerada completa. Entretanto, na presença de água, que é um doador de elétrons mais forte que o álcool, a formação do intermediário 2 não é favorecida e a esterificação não ocorre completamente. Esquema 1. Esterificação dos ácidos graxos com catálise ácida. 57

58 Com o intuito de abreviar o tempo de reação, pode ser feita uma transesterificação direta (alcoólise ou metanólise) dos lipídios com um único reagente. A reação ocorre, por exemplo, para ácidos graxos ligados aos lipídios por ligação éster, isto é, triacilgliceróis e fosfolipídios. Nesta reação, um dos álcoois da molécula, por exemplo o glicerol do triacilglicerol, é substituído por outro, normalmente metanol. Esquema 2. Transesterificação dos lipídios com catálise ácida. A transesterificação ocorre com refluxo e na presença de catalisadores ácidos (HCl, H 2 SO 4, BF 3 ) (Esquema 2) ou básicos (NaOH, KOH, metóxido de sódio) (Esquema 3). No esquema 2 todos os passos são reversíveis e novamente na presença de excesso de álcool o equilíbrio é deslocado para a formação do novo éster. A água provoca hidrólise e dissociação do intermediário 4. Esquema 3. Transesterificação dos lipídios em meio alcalino. A transesterificação em meio básico (Esquema 3) ocorre em condições de temperatura mais amenas e tempo reduzido. Entretanto, os ácidos graxos livres não são suscetíveis ao ataque nucleofílico de álcoois ou bases e, portanto não 58

59 ocorre a esterificação em condições de catálise básica. A reação de transesterificação ocorre satisfatoriamente com excesso de álcool e na ausência de água. O emprego de KOH metanólico não é recomendado devido a ocorrência de hidrólise e formação de ácido graxo livre. Este hidróxido é substituído, com vantagem, por alcoolatos formados pela reação de metal alcalino como sódio ou potássio e álcool (Ex: metóxido de sódio) (Bobbio e Bobbio, 2003; Christie, 1993). Os ácidos graxos ligados a grupamento N-acila em lipídios complexos também formam ésteres metílicos em meio ácido (Esquema 4). H+ R -CO-NHR + CH 3 -OH R -CO-OCH 3 + R NH 2 Esquema 4. Esterificação de ácidos graxos ligados a grupamentos N-acila. Os métodos mais eficientes empregam os dois tratamentos, ácido e básico. Em meio ácido pode ocorrer isomerização de ácidos graxos insaturados, principalmente os conjugados, quebra de grupamentos reativos como os grupos ciclopropenídicos, além dos processos em meio ácido necessitarem de aquecimento, o que pode comprometer os ácidos graxos de baixo peso molecular presentes em quantidades significativas, por exemplo, na gordura do leite. Por outro lado, a transesterificação em meio básico pode levar à saponificação de ácidos graxos de baixo peso molecular (Christie, 1993; Christopherson e Glass, 1969; Kramer et al., 1997). A transesterificação alcalina, entretanto, tem sido empregada para a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos em gordura de leite e margarina, produtos ricos em ácidos graxos saturados voláteis e de baixo peso molecular (Kramer et al., 1997), na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos ciclopropenídicos que são grupamentos altamente lábeis (Aued- Pimentel et al., 2004), em óleos vegetais refinados (Ratnayake, 2004) e também na análise de produtos alimentícios diversos, mostrando resultados comparáveis a procedimentos com catálise mista (Aued-Pimentel et al., 2005). A Tabela 8 apresenta os principais reagentes utilizados para preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos, suas vantagens e limitações. 59

60 Tabela 8. Principais reagentes para preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos, vantagens e limitações. Reagente Tipo de catalisador Grupos de moléculas esterificadas Vantagens Limitações 5% HCl anidro (gasoso) em metanol (formação de cloreto de hidrogênio) Ácido Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou colesterol Reagente eficiente na esterificação. Não derivam todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos como as amidas Tempo longo de reação e aquecimento Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno NaOH 0,5N/ NH 4Cl/ metanol/h 2SO 4 (formação de cloreto de hidrogênio) Ácido/Básico Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou colesterol Procedimento rápido e simples Tempo e temperatura reduzidos Não derivam todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno Metanol + H 2SO 4 (1-2%) Ácido Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou colesterol Reagente barato e eficiente na esterificação Tempo longo de reação e aquecimento. Pode alterar os ácidos graxos polinsaturados Destrói grupos funcionais ligados aos ácidos graxos tais como: epóxi, ciclopropano e ciclopropeno Trifluoreto de boro BF 3 em metanol (7% -14%) + NaOH metanólico 0,5N Ácido/Básico Ácidos graxos livres ou ligados ao glicerol ou colesterol Método Oficial AOAC AOCS Reagente instável. Não promove a derivação de todos os componentes da gordura ligados aos ácidos graxos Formação de produtos secundários Tempo longo de reação e aquecimento KOH metanólico 2M Básica Transesterificação Ácidos graxos ligados ao glicerol Reação rápida e a frio Preserva AG de baixo peso molecular, polinsaturados, cíclicos e conjugados Saponificação de ácidos graxos de baixo peso molecular Não se aplica a ácidos graxos livres Não recomendado na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir de óleos com acidez acima de 2,0% Metóxido de sódio (NaOCH 3) Básica Transesterificação Ácidos graxos ligados ao glicerol, esteróis Preserva AG de baixo peso molecular, Polinsaturados, cíclicos e conjugados Fonte: Adrian et al., 2000; Bobbio e Bobbio, 2003; Christie, 1993; Christopherson e Glass, 1969; Kramer et al., Não se aplica a ácidos graxos livres e ligados a amidas (esfingolipídios). Não recomendado na preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir de gorduras com acidez acima de 2,0% 60

61 Na literatura, são descritos procedimentos de transesterificação direta ( in situ ) sem extração prévia de gordura, empregados para pequenas quantidades de amostras de óleos vegetais, tecidos ou fluidos biológicos. Estes métodos, primeiramente, foram desenvolvidos para análise de lipídios em microorganismos (Abel, Deschmertzing, Peterson, 1963) e posteriormente foram modificados e aplicados para uma grande gama de produtos alimentícios (Carrapiso e Garcia, 2000; Golay et al., 2006; Méier ect al., 2006; Ulberth e Henninger, 1992). Os procedimentos consistem da mistura da amostra com os reagentes de esterificação, aqueles já utilizados para a reação nos lipídios previamente extraídos, tais como: cloreto metanólico de hidrogênio; 5% (v/v) cloreto metanólico de acetila; metóxido de sódio metanólico para produtos lácteos (Golay et al., 2006); hidróxido de sódio metanólico (90 C por 10 min ) e solução de BF 3 (Carrapiso e Garcia, 2000; Ulberth e Henninger, 1992). Nestes procedimentos há economia de tempo de análise e solventes, pois ocorre a síntese de ésteres de ácidos graxos por extração e derivação simultâneas. A diminuição na manipulação da amostra contribui para diminuir o erro experimental. Por outro lado, o teor de água dos alimentos, a tomada de amostra, a escolha dos reagentes (catalisador) e as condições da análise, por exemplo a temperatura, são fatores decisivos na eficiência das reações diretas (Carrapiso e Garcia, 2000). Mazalli e Bragagnolo (2007), em trabalho recente, comparando metodologias de metilação in situ e na gordura extraída de amostras de ovos, verificaram desempenho inadequado no processo de metilação direta, para a determinação de AGP Determinação de AG por cromatografia em fase gasosa (CG) A evolução da técnica de cromatografia em fase gasosa está diretamente associada com a análise de ácidos graxos. James e Martin (1952) foram os primeiros a separar uma série de ácidos graxos voláteis em um cromatógrafo a gás com coluna empacotada. A partir da década de 70, a técnica de CG iniciou sua consolidação como substituta dos métodos químicos por via úmida na análise de ácidos graxos e de lipídios em geral. Com a introdução das colunas capilares de alta resolução e a 61

62 evolução da tecnologia dos cromatógrafos, como o acoplamento a detectores de massas, aliados ao aumento da disponibilidade de padrões cromatográficos de alta pureza, houve uma grande ampliação na possibilidade de separação, identificação e quantificação de ácidos graxos, propiciando maior confiabilidade nos resultados analíticos (Ackman, 2002) Princípios da análise por CG A base para a separação dos componentes na CG é a partição da amostra no estado de vapor entre duas fases, uma fase estacionária (FE) (sólida ou líquida) e uma fase gasosa móvel. Na separação de ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG) haverá diferentes afinidades com a FE, de acordo com a estrutura química de cada componente, isto é, número de insaturações, presença de isomeria (geométrica ou de posição) ou de grupamentos na cadeia carbônica. Para esta separação as FE mais adequadas são de polímeros polares como poliésteres (Carbowax 20M) e cianosiliconas (SP 2340, SP 2560). Os componentes terão tempos de eluição da coluna, ou tempos de retenção diferenciados. O tempo de retenção é característico para determinado composto em uma FE, em condições padronizadas de análise. Após a separação, na coluna cromatográfica, os componentes são direcionados ao sistema de detecção. Na análise de EMAG, normalmente, é empregado um detector de ionização de chama. Os componentes da amostra são queimados originando uma corrente de íons os quais são coletados e transformados em sinais elétricos e registrados como picos. Estes detectores emitem sinais para compostos orgânicos voláteis. Empregam N 2, H 2 ou He como gás de arraste; possuem alta sensibilidade e ampla faixa de resposta linear (Lanças, 1993). Inicialmente, a separação de EMAG era feita em colunas empacotadas, mais curtas (0,5 a 3 m) e com diâmetros maiores (1/8 polegada). Estas colunas ofereciam uma menor eficiência de separação dos componentes. Com o advento das colunas capilares de alta resolução, atualmente estão disponíveis no mercado colunas capilares longas (20 a 100m) com pequenas espessuras de filme de fase 62

63 estacionária (0,10 a 0,53 µm), o qual recobre ou está ligado a parede interna do capilar. Na análise por CG deve-se trabalhar com a máxima eficiência gerando cromatogramas com picos finos e separados a partir de sua base. Esta eficiência se expressa pelo número de pratos teóricos. Já a resolução indica o grau de separação de dois componentes. As condições de análise que devem ser escolhidas na análise de EMAG são as que produzirem (coluna empacotada) ou 3000 (coluna capilar) pratos teóricos por metro de coluna e resolução igual, no mínimo, a 1,25, entre picos adjacentes (AOAC , 1984; ISO 5509E, 1978). Atualmente, os equipamentos possuem softwares que calculam os parâmetros de desempenho da coluna, auxiliando na seleção rápida da melhor condição de análise Análise qualitativa O objetivo da análise qualitativa é determinar a natureza química das espécies separadas por CG. Algumas técnicas de identificação podem ser empregadas tais como os parâmetros de retenção, isto é: Tempo de retenção: intervalo de tempo (min ou s) entre a injeção e a altura máxima de um pico. Retenção relativa: relação entre os tempos de retenção de duas substâncias. A identificação é feita comparando os parâmetros cromatográficos (tempo de retenção) dos compostos em estudo com os de padrões puros nas mesmas condições da análise. Os parâmetros acima variam de acordo com as modificações das condições experimentais, portanto o método é impreciso. Os métodos gráficos também são utilizados na identificação. Em condições isotérmicas de análise, o gráfico do logaritmo do tempo de retenção como uma função do número de átomos de carbono dos ésteres metílicos de séries homólogas e cadeia linear, deve ser uma reta. As retas são praticamente paralelas para diferentes séries homólogas (AOAC , 1984);. 63

64 O melhor procedimento de identificação dos compostos, entretanto, é pela associação da CG com outras técnicas analíticas, tais como: espectrofotometria UV-Visível, Infra-vermelho, espectrometria de massas (CG/DM), ressonância magnética nuclear (RMN), entre outras (Lanças, 1993). A cromatografia a gás com detector de massas (CG/DM) é um método analítico bastante eficaz na identificação positiva de compostos e também na quantificação, especialmente no caso dos AG dos alimentos presentes em pequenas quantidades (Ratnayake, 2004; Thurnhofer e Vetter, 2005) Análise quantitativa O objetivo da análise quantitativa é saber quanto de cada espécie está presente na amostra analisada. Desta forma, a área do componente obtida no cromatograma será relacionada com a concentração. Os principais métodos quantitativos na análise por CG envolvem os seguintes cálculos: Normalização de Área: Cálculo da porcentagem de um componente (A Agi ), com relação à soma das áreas de todos os componentes (ΣA). % A Agi = Limitações: Assume que todos os compostos injetados foram eluídos. Assume que o detector apresenta a mesma resposta para todos os picos, o que usualmente não é verdadeiro. A Agi.100 Σ. A Normalização com área corrigida: O detector de ionização de chama (DIC) não responde de maneira similar para todos os compostos orgânicos. Os carbonos dos grupos metilênicos, numa 64

65 cadeia carbônica, são os responsáveis pela resposta total no detector de ionização de chama. A resposta no DIC é proporcional ao número de carbonos ativos (n). Para os ácidos graxos e seus ésteres metílicos, a presença de dois átomos de oxigênio na molécula resulta em uma diferença mais acentuada na porcentagem de massa de carbono nas moléculas e numa resposta do detector não proporcional ao número de carbonos ativos (n), mas a porcentagem relativa de massa destes carbonos na molécula (Ackman e Sipos, 1964; Bannon et al., 1986). Portanto, existem n 1 átomos de carbonos ativos e o fator de resposta Ag i teórico do detector é: ( 1) n.a Ag i M Ag i c As áreas, obtidas experimentalmente, devem ser corrigidas para fornecer o valor real da massa dos ésteres metílicos empregando o fator teórico de correção que é obtido pela fórmula abaixo: M Agi K Agi =. ( nagi 1) Ac K Agi = fator de correção da resposta para o ácido graxo i. M Agi = massa molecular do éster metílico de ácido graxo i. n Agi = número de átomos de carbono do éster metílico do ácido graxo i. Ac = massa atômica do carbono (12,01). Pesos atômicos utilizados no cálculo: Carbono =12,01; Hidrogênio = 1,0079; Oxigênio =15,994. Ackman e Sipos (1964) introduziram o conceito da aplicação de fatores teóricos relativos de correção de resposta do DIC, para a análise de EMAG. Estes fatores são determinados pelo cálculo teórico de resposta relativa, considerando a quantidade de carbono nos EMAG, que está ligada a um ou mais hidrogênios, em 65

66 relação à quantidade ligada a um EMAG específico como 16:0 ou 13:0 (padrão interno). O fator teórico de correção de resposta do DIC para cada componente com relação a outro EMAG, por exemplo, 16:0, ou o padrão interno (13:0) é dado pela fórmula: K ' = Agi K K C Agi 13ou16 K Ag i = fator relativo de correção, para o EMAG i. K C 13 = fator de resposta do DIC para o 13:0 (ou 16:0). K Agi = fator de resposta do DIC para o ácido graxo i. A determinação de fatores de correção da resposta do DIC pode ser feita experimentalmente a partir da análise de padrões de EMAG. Estes fatores incluem as correções relativas à massa dos componentes e aquelas originadas de desvios de parâmetros químicos e instrumentais. O cálculo pode ser feito por repetições de injeções de padrões dos EMAG. Calcula-se a média das áreas para massas conhecidas dos padrões e o fator é obtido pela fórmula abaixo: Onde: K ' Agi = M M Agi C 13. A. A C 13 Agi M Ag i = % do EMAG no padrão A C13 = média das áreas do pico EMAG 13:0 (ou 16:0) M C13 = % do EMAG 13:0 no padrão EMAG A Agi = média das áreas EMAG no padrão Cálculo com padrão interno: O padrão interno (PI) é um composto adicionado à solução da amostra que contém os componentes cujas concentrações se quer determinar. O PI deve apresentar as seguintes características: 66

67 Não deve estar naturalmente presente na amostra. Deve ser disponível em elevado grau de pureza. Ser adicionado em concentrações similares aos compostos analisados. Estar bem resolvido em relação aos outros picos. Possuir natureza química semelhante aos componentes que serão quantificados. Para a quantificação constrói-se uma curva de calibração com o valor da relação da área do composto, dividida pela área do padrão interno (áreas corrigidas), lançada no gráfico contra a massa do componente dividida pela massa do padrão interno. Este é um método muito útil, pois independe de pequenas mudanças nas variáveis experimentais como temperatura da coluna, fluxo do gás de arraste, tamanho de amostra (Lanças, 1993) Determinação de AG em produtos alimentícios Em grande parte dos trabalhos encontrados na literatura, principalmente em trabalhos de nutrição, os teores de ácidos graxos têm sido expressos em porcentagens de área ou massa no total de ésteres metílicos. Esta é uma maneira simplificada de apresentar a concentração dos componentes sem a necessidade de cálculos mais complexos ou de padrões de alta pureza. Na década de 70, vários trabalhos de revisão foram realizados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) sobre os dados analíticos de lipídios e ácidos graxos de diferentes classes de alimentos para a elaboração de tabelas nutricionais, indo ao encontro dos objetivos de uma política de vigilância nutricional adotada por aquele país. Visando fornecer uma base de conversão de gramas de cada ácido graxo em cem gramas do alimento, foram calculados fatores apropriados que ponderam a contribuição das frações dos lipídios no fornecimento dos ácidos graxos. As classes de lipídios individuais (TAG, FL, esteróis) e o conteúdo delas foram quantificados para diferentes alimentos, com base em dados da literatura e calculado um fator de conversão médio aplicável ao total de lipídios (Mc Cance, 67

68 Widdowson s, 2002; Weihrauch et al.,1977). Foram estabelecidos fatores teóricos para diferentes classes de alimentos, a saber: produtos lácteos (Posati, Kinsella, Watt, 1975a), ovos e derivados (Posati, Kinsella, Watt, 1975b), sementes oleaginosas, sopas (Fristrom et al.; 1975), óleos e gorduras (Brignoli, Kinsella, Weihrauch, 1976), carne de porco e derivados (Anderson, 1976), carne bovina (Anderson, Kinsela, Watt, 1975), cereais (Weihrauch, Kinsella, Watt, 1976), diferentes tipos de peixes (Exler, 1975), entre outros. A conversão da porcentagem em massa do éster metílico de ácido graxo (%EMAG) para gramas de ácido graxo por cem gramas do alimento é fornecida pela seguinte equação: Massa AG (g) = % EMAG. F. % lipídios 100 g da amostra Onde: % EMAG= porcentagem em massa (ou área) do éster metílico de ácido graxo obtido por normalização (cromatograma). F= fator de conversão, o qual é variável conforme o tipo de alimento e definido como a massa de ácidos graxos em um grama de lipídios (Mc Cance e Widdowson s, 2002). No caso de alimentos cujos lipídios são constituídos essencialmente por TAG, o fator de conversão é obtido pela fórmula: F = g g Ag EMAG.1,005 A constante 1,005 é a razão de 3 vezes o peso molecular (PM) do EMAG dividido PM do TAG correspondente (Anexo I). Neste caso, o fator calculado será 0,956. Na elaboração de tabelas de composição de alimentos de vários países são empregados aqueles fatores de conversão teóricos. Para a obtenção dos fatores é considerado que 1g de TAG fornece 0,956 g de ácidos graxos (como 68

69 exemplificado acima) e de fosfolipídios cerca de 0,72 g. Por exemplo, no caso do ovo que contém cerca de 65% de TAG e 29% de FL, um grama dos lipídios do ovo terá cerca de 0,62 g de ácidos graxos, provindos dos TAG, e cerca de 0,21g dos FL. Portanto, diferentes frações lipídicas do ovo fornecerão um total de cerca de 0,83 gramas de ácidos graxos por grama de lipídio (Posati, Kinsella, Watt, 1975b). A Tabela 9 apresenta os fatores de conversão teóricos de gordura para ácidos graxos para diferentes alimentos. Tabela 9. Fatores de conversão teóricos de gordura para ácidos graxos em diferentes alimentos. Alimento Fator g de ácidos graxos/ g de lipídios Óleos, gorduras e sementes oleaginosas 0,956 Produtos lácteos 0,945 Ovos 0,830 Frutas e vegetais 0,800 Carnes gordas bovina, suínas e ovinas 0,953 Carne magra bovina e ovina 0,916 Carne magra suína 0,910 Carne de frango 0,945 Carne gorda de peixe 0,900 Carne magra de peixe 0,700 Fonte: Mc Cance e Widdowson s, Este procedimento de cálculo tem sido utilizada em laboratórios brasileiros, pois simplifica muito a análise, mas sua aplicabilidade deve ser avaliada na determinação dos ácidos graxos, principalmente, em produtos com ingredientes diversos, os quais não possuem fatores de conversão determinados. Nas duas versões da Tabela Brasileira de Composição de Alimentos, o método de cálculo acima descrito foi o adotado para expressar a concentração dos ácidos graxos em grama por cem gramas dos alimentos (NEPA, 2004; NEPA, 2006) A demanda de informações mais precisas sobre os ácidos graxos, aliados a uma maior disponibilidade de padrões e a evolução nas tecnologias das colunas e equipamentos de CG, tem se refletido em um maior rigor quantitativo dos métodos oficias. 69

70 Nos métodos oficiais de determinação da composição de AG em óleos e gorduras (AOCS Ce 1h-05, 2005; AOCS Ce 1f-96, revisão 2001; ISO 5508,1990), são preparados EMAG, obtidos por diferentes metodologias, isto é metilação em meio metanólico por catálise ácida, básica ou combinada (ISO 5509E, 1978; AOCS, Ce 2-66, 1997; IUPAC 2.301, 1987). Os EMAG são analisados por cromatografia em fase gasosa e detector de ionização de chama (CG/DIC) empregando colunas empacotadas ou capilares com fases estacionárias polares. Dependendo das condições operacionais, das fases estacionárias e do comprimento da coluna cromatográfica, é possível obter a separação dos isômeros geométricos e de posição dos ácidos graxos. Organizações internacionais de excelência em química analítica como AOAC AOCS e ISO preconizam a determinação quantitativa dos ácidos graxos por cromatografia em fase gasosa empregando metodologia com adição de padrão interno (AOCS Ce 1h-05, 2005; AOCS, Ce 1f-96, revisão 2001; ISO 15304(E), 2002; ISO 5508, 1990). O padrão interno é normalmente um EMAG (13:0, 11:0) ou um TAG (13:0; 17:0, 19:0, 21:0, 23:0) com número ímpar de carbonos, uma vez que muitos destes não são encontrados na gordura dos alimentos. O cálculo da composição dos analítos de interesse é feito com relação à área e massa daqueles padrões. São empregados fatores de correção de resposta do detector de ionização de chama (DIC), experimentais ou teóricos, e de conversão de ésteres metílicos de ácidos graxos para ácidos graxos. Os valores das somas dos ácidos graxos saturados, mono e polinsaturados são multiplicados pelo teor de lipídios da amostra para expressar o resultado em gramas de ácidos graxos por cem gramas do alimento (ISO 5508, 1990; AOCS Ce 1-62, 1997; AOCS Ce 1f-96, revisão 2001). Para atender a definição química de gordura estabelecida na legislação dos Estados Unidos e Canadá sobre rotulagem nutricional foram desenvolvidos métodos hidrolíticos de extração de GT e AG e de determinação da GT a partir dos AG obtidos por CG/DIC. O método AOAC (1996) foi avaliado e adotado como oficial para a determinação de gordura e ácidos graxos para produtos a base de cereais contendo de 0,5 a 13% de GT (Ngeh-Ngwainbi, Lin, 70

71 Chandler,1997; AOAC, 2005). House et al., (1994) desenvolveram um método hidrolítico, semelhante ao anterior, para a extração e determinação da gordura total dos alimentos, em geral, a partir da análise de ácidos graxos por CG/DIC. Após estudo colaborativo este procedimento foi adotado como método oficial para análise de GT e ácidos graxos para fins de rotulagem nutricional (AOAC , revisado em 2001). A aplicabilidade destes métodos tem sido comprovada para outras matrizes de alimentos com variadas quantidades de gordura (Ali et al., 1997; Rader et al., 1995; Satchithanandam, Fritsche, Rader, 2001). Nos métodos da AOAC, (para cereais) e (para alimentos em geral), a gordura e os ácidos graxos são extraídos das amostras de alimentos pelos processos de hidrólise (hidrólise ácida para a maioria das amostras, hidrólise básica para produtos lácteos e hidrólise combinada para amostras de queijos). Antes da extração dos lipídios, um padrão interno de TAG (11:0 ou 13:0) e um antioxidante (pirogalol) são adicionados. A gordura é extraída com éter de petróleo e etílico e então, transformada em ésteres metílicos de ácidos graxos usando trifluoreto de boro (BF 3 ) em metanol. Os EMAG são quantificados por cromatografia em fase gasosa por comparação com a massa e área do padrão interno, isto é do EMAG 11:0 ou 13:0 gerado. A coluna cromatográfica empregada no método original era de 60m, apresentando resolução inferior à das colunas cromatográficas disponíveis atualmente. A gordura total é calculada como a soma dos ácidos graxos individuais expressos como TAG equivalentes (AOAC, 2005). A determinação da GT, como triacilgliceróis a partir dos ácidos graxos, provenientes de mono, di, triacilgliceróis, fosfolipídios e ésteres de esteróis, requer um modelo de condensação de três moléculas de ácidos graxos com uma de glicerol Determinação de AGT As metodologias descritas na literatura para a análise dos ácidos graxos trans incluem: análise por espectroscopia no infravermelho com leitura em 966 cm 1, onde ocorre absorção das insaturações que possuem hidrogênios na configuração trans. Por esta metodologia oficial são determinados os ácidos 71

72 graxos trans totais, isto é, duplas ligações isoladas, entretanto sem diferenciar os isômeros, sendo apropriada para análise de óleos e gorduras contendo mais de 5% de ácidos graxos trans (AOCS Cd 14d-99, 1999; AOCS Cd 14-95, 2000). O método envolve a preparação de EMAG e a varredura da amostra na região de 900 a 1050 cm -1. A quantificação para teores de AGT inferiores a 5% é prejudicada em gorduras que contenham, por exemplo, duplas ligações trans de sistemas conjugadas e outros interferentes que alterem a região de absorção dos AGT. Avanços na técnica de infravermelho, utilizando células para atenuação de reflexão total, associada ao processamento matemático dos espectros por transformada de Fourier tem tornado possível a determinação dos AGT de forma mais rápida e/ou mais acurada (Kodali e List., 2005; Mossoba et al., 2003). A ressonância magnética nuclear (RMN) também é utilizada para determinar ácidos graxos trans em gordura vegetal parcialmente hidrogenada (GVPH). Entretanto, trata-se de uma técnica cara e aplicada para níveis superiores a 3% de AGT (Miyake e Yokomizo, 1998). As legislações atuais sobre rotulagem nutricional não exigem a diferenciação dos isômeros trans. Entretanto, devido às evidências científicas que alguns isômeros trans podem ser nutricionalmente ou fisiologicamente benéficos à saúde, tais como o isômero conjugado 18:2 (9c,11t) e seu precursor, o ácido trans vacênico 18:1(11t), o emprego de técnicas que permitam a separação dos vários componentes torna-se mais apropriado (Cruz-Hernandez et al., 2004) Determinação de AG cis/trans por CG em colunas capilares. O método indicado para as análises de rotina de ácidos graxos, inclusive trans, devido à sensibilidade, ao custo e por possibilitar a determinação de toda a composição de ácidos graxos em uma única corrida, emprega a técnica de cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). Para a separação dos isômeros são utilizadas colunas capilares de sílica fundida longas (pelo menos 100 m) com fases estacionárias de alta polaridade (ciano propilsiloxano), com os nomes comerciais: SP 2560, CPSil 88, SP 2380, BPX 70 72

73 (AOCS, Ce 1f-96, revisão 2001, AOCS Ce 1h-05, 2005; ISO 15304, 2002). Entretanto, mesmo com a otimização dos parâmetros cromatográficos é difícil a resolução de todos os isômeros geométricos e de posição presentes numa amostra de GVPH ou gordura de animais ruminantes, inclusive os isômeros CLA. Esta separação pode ser obtida em análise prévia por cromatografia em camada delgada ou cromatografia líquida de alta eficiência com íon prata para fracionar os diversos isômeros. Os íons de prata formam complexos com os ácidos graxos insaturados possibilitando o fracionamento. O ponto desfavorável desta associação de técnicas é o tempo elevado de análise, não sendo apropriado nos procedimentos rotineiros (Mossoba, 2003). Uma breve discussão é feita abaixo com relação à separação e identificação de isômeros cis trans dos ácidos graxos em GVPH, gorduras de animais ruminantes e óleos vegetais, empregando colunas capilares e CG/DIC Isômeros do ácido octadecenóico (18:1) Os isômeros do ácido octadecenóico são os mais abundantes e em maior número nas GVPH e de animais ruminantes. A adequada separação destes componentes é um ponto importante na definição da melhor metodologia de quantificação do total de ácidos graxos trans. As colunas cromatográficas SP 2560, CPSil 88, SP 2380, BPX 70 fornecem uma boa resolução (a partir da linha de base) para a maioria dos isômeros cis e trans do ácido octadecenóico presentes em gorduras vegetais parcialmente hidrogenadas e de animais ruminantes. Os isômeros trans encontrados nestas gorduras são: 18:1(4t) a 18:1(16t) e o principal cis é o 18:1(9c), além de quantidades menores de 18:1(11c) a 18:1(16c). Considerando uma determinada posição da dupla ligação, os isômeros trans sempre eluem antes do correspondente isômero cis majoritário, nas colunas acima citadas. Por exemplo, o metil elaidato (18:1(9t)) elui antes do metil oleato (18:1(9c)). Entretanto, pode ocorrer sobreposição de alguns isômeros cis e trans com diferentes posições das duplas ligações. A extensão das sobreposições depende da fase estacionária, do comprimento da coluna capilar e das temperaturas de operação do cromatógrafo a 73

74 gás. Na coluna SP 2340 de 60 m, indicada no método AOCS Ce 1f-96, há sobreposição dos isômeros: 18:1(6c) e 18:1(12t); 18:1(9c) e 18:1(15t). Já os isômeros de 18:1(4t) a (11t) são resolvidos. Os isômeros de 18:1(12t) a (16t) sobrepõem a região de eluição dos isômeros cis. Os resultados quantitativos para AGT, nesta coluna ficam comprometidos, podendo ser subestimados em até 30% (Ratnayake, 2004). As colunas de 100 m (ou mais) são as mais eficientes, e indicadas para a análise de AGT, sendo que a sobreposição dos isômeros pode ser minimizada. A otimização da temperatura de operação é fundamental para evitar co-eluições. Tem sido demonstrado que numa coluna SP 2560 aquecida a 180 C (isotérmica) obtém -se a melhor condição para determinação de ácidos graxos trans totais para fins de rotulagem nutricional em óleos vegetais e produtos que contenham gorduras parcialmente hidrogenadas (AOCS Ce 1h-05, 2005). Ocorre a resolução dos isômeros 18:1(12t) e 18:1(9c). Os picos dos grupos de isômeros 18:1 (13t,14t + 6-8c) que normalmente co-eluem com o 18:1(9c) podem ser separados. Também ocorre a separação dos isômeros 18:1(16t) e 18:1(14c). Somente o isômero 18:1(15t) não é totalmente resolvido, entretanto a não inclusão deste componente não compromete, na maioria dos casos, a quantificação dos ácidos graxos trans. Nas condições acima, o pico contendo 18:1(13t+14t) co-elui com os isômeros 18:1 (6c- 8c). Quando a temperatura da coluna for 5 a 10 C inferior a 180 C, teremos sobreposição de picos. A 170 C há sobreposição do 18:1(9c) e 18:1(13t+14t) e co-eluição dos isômeros C18:1(16t) e 18:1(14c) (Ratnayake 2004; Ratnayake et al., 2002) Isômeros dos ácidos octadecadienóico (18:2) e octadecatrienóico (18:3) Os isômeros dos ácidos octadecadienóico (18:2) e octadecatrienóico (18:3) estão sempre presentes, porém em baixas concentrações, nas GVPH, nas gorduras de animais ruminantes e nos óleos vegetais polinsaturados refinados. Para uma determinação mais exata dos isômeros trans nos alimentos é necessário a inclusão destes componentes. Os principais isômeros do ácido 18:2, presentes na GVPH, são: 9t,13t; 9c,12t; 9t,12c, podendo chegar a 6% na gordura submetida à hidrogenação moderada (Ceriani e Meirelles, 2007; Ratnayake, 74

75 2004). Os padrões disponíveis comercialmente contêm os isômeros: 9t,12t; 9c,12t; 9t,12c; 9c,12c Eles eluem, nesta ordem, nas colunas com fases estacionárias de cianopropilsiloxano, com boa resolução dos outros componentes. Entretanto, outros isômeros com menores concentrações podem ocorrer e co-eluirem com os isômeros do 18:1. Os principais isômeros do ácido octadecatrienóico (18:3) estão presentes em menores quantidades nas gorduras. Os mais comuns são: 9t,12c,15t; 9c,12c,15t; 9t,12t,15c; 9t,12c,15c e 9c,12c,15c (ácido alfa-linolênico), sendo esta a ordem de eluição numa coluna com FE de cianopropilsiloxano. Em algumas programações, dependendo da temperatura da coluna, o ácido eicosaenóico 20:1(11c), presente em pequenas quantidades em óleos vegetais, pode eluir antes ou depois do ácido alfa linolênico (18:3 (9c,12c,15c)) ou mesmo co-eluirem. A análise isotérmica a 180 C, em coluna SP 2560, é a que tem apresentado a m elhor separação para estes componentes. A coluna CP Sil 88 de 100 m não apresenta o mesmo desempenho a 180 C para a resolução daqueles componentes (Ratnayake, 2004). Ratnayake et al. (2006), em estudo recente, compararam a eficiência do método AOCS Ce 1h-05 desenvolvido para análise de AG, inclusive trans, em GVPH e óleos vegetais, nas duas colunas comerciais SP-2560 e CP-Sil 88, ambas de 100 m. O método emprega temperatura isotérmica de 180 C, no forno da coluna, tendo sido confirmada a eficiência da SP na separação do par crítico 18:3 n- 3 e 20:1 n-11, enquanto a coluna CP-Sil 88 foi mais eficiente na separação dos isômeros 18:1 das GVPH. A determinação quantitativa de ácidos graxos trans em níveis muito baixos, como nos óleos vegetais, não é um procedimento analítico muito simples. Os principais isômeros cis/trans formados, no caso dos óleos vegetais refinados polinsaturados, são 18:2 e 18:3, principalmente quando emprega-se temperaturas de desodorização altas ( C)(Ceriani e Meirelles, 2007). Os níveis destes ácidos variam normalmente entre 0-2% e os teores obtidos são muitas vezes utilizados na avaliação do processamento ou como critério de rejeição de produto nas transações comerciais. A análise nesta faixa de concentração requer a otimização dos parâmetros analíticos tais como: tipo e temperatura da coluna, 75

76 quantidade de amostra injetada, parâmetros de processamento dos picos como mínima área, visando detectar picos com cerca de 0,01% (% p/p de ésteres metílicos), isto é com uma relação do sinal pelo ruído maior que 3 (Van Bruggen et al., 1998). A partir dos resultados de estudos colaborativos chegou-se ao método oficial AOCS Ce 1h-05 (2005) para óleos vegetais refinados e GVPH (Buchgraber e Ulberth, 2002; Van Bruggen et al., 1998) (Tabela 10). Entre os óleos vegetais comestíveis, o azeite de oliva é o único que apresenta faixas estabelecidas em norma Codex para os teores de ácidos graxos trans, de acordo com a categoria do azeite. Na categoria azeite de oliva os limites são: 18:1t < 0,20% e 18:2t +18:3t < 0,30% (p/p de ésteres metílicos); já para o azeite de oliva virgem, que não sofre processo industrial de refino, os limites segundo a norma Codex são: C18:1t < 0,05% e C18:2 +C18:3t < 0,05% (p/p de ésteres metílicos) (Codex Alimentarius 1981, revisão 2003) Ácidos graxos da gordura de animais ruminantes A gordura de animais ruminantes contém AGT, porém com características diferentes da GVPH. Quando comparado a GVPH, o número de isômeros é inferior e as sobreposições ocorrem em menor extensão (principalmente 18:1). Dentre as gorduras de animais ruminantes, a dos produtos lácteos são as mais complexas. Podem conter dezenas de ácidos graxos, isto é, saturados de 4 a 24 átomos de carbono, monoinsaturados, polinsaturados, ramificados e diversos isômeros trans, principalmente do 18:1 além dos isômeros conjugados do ácido linoléico (CLA). Face às evidências benéficas à saúde destes últimos componentes e à variedade de matrizes alimentares disponíveis, tem sido necessário o desenvolvimento de métodos adequados à quantificação dos ácidos graxos conjuntamente. Kramer, Blackadar, Zhou (2002), realizaram um estudo bastante minucioso, comparando o desempenho de duas colunas cromatográficas, uma de alta polaridade (FE cianopropilsiloxano) e longa (CP Sil 88, 100 m) e outra mais curta com polaridade inferior (Supelcowax 10 de 60 m, FE polietilenoglicol) para separação de ácidos de baixo peso molecular, isômeros cis/trans, inclusive CLA, em gordura de leite de vaca. Neste estudo ficou bastante 76

77 evidente que colunas longas, de no mínimo 100 m, e de alta polaridade, como CP Sil 88 ou SP 2560, são as mais eficientes para a separação de uma ampla gama de ácidos graxos que estão presentes na gordura do leite, inclusive os isômeros cis/trans. As condições cromatográficas empregadas são as descritas na Tabela 11. Aqueles autores mostraram que a resolução dos isômeros 18:1 pode ser melhorada se forem injetadas diferentes quantidades de amostras. É enfatizado que dependendo do fabricante da coluna cromatográfica, tempo de uso e programação de temperatura, podem ocorrer problemas de resolução entre os EMAG 18:3, 20:1, 21:0, 20:2 e CLA (9c11t), (10t12c) ou (11c13t) (Cruz-Hernandez et al., 2004). Em trabalho recente, Destaillats et al. (2007) compararam diferentes técnicas para a determinação de AGT, especialmente o total dos isômeros trans 18:1 e o trans vacênico (18:1 11t), em gordura de animais ruminantes. Aqueles pesquisadores, por intermédio da otimização da análise direta por CG/DIC, em coluna de 100 m CP Sil 88, obtiveram resultados similares as outras técnicas que empregam fracionamento prévio dos isômeros tais como CCD e CLAE com íons de prata e posterior análise por CG/DIC. Golay et al. (2006), validaram uma metodologia para a determinação de ácidos graxos em produtos lácteos, inclusive trans, na qual não é necessária a extração prévia da gordura e a transesterificação dos lipídios é feita diretamente. As condições da análise cromatográfica também foram otimizadas, para evitar o fracionamento previamente dos isômeros cis/trans por CCD. Os detalhes das condições de análise e desempenho do método encontram-se na Tabela Determinação de GT e AG cis/trans visando a informação nutricional na rotulagem dos alimentos Uma vez que as legislações sobre rotulagem nutricional não especificam a metodologia analítica para a determinação de ácidos graxos trans, vários grupos de pesquisa têm se empenhado em estabelecer procedimentos rápidos e confiáveis, aplicáveis a um grande número de amostras, isto é, óleos refinados, produtos lácteos e produtos alimentícios que contenham gordura hidrogenada. 77

78 Este é um grande desafio analítico, uma vez que a natureza e nível de concentração dos isômeros presentes são bastante variados. Ali et al. (1997) demonstraram a aplicabilidade do método AOAC para a análise de AG, inclusive trans, empregando coluna cromatográfica SP 2560 de 100 m. Um grupo de pesquisadores do FDA (Food and Drug Administration), dos Estados Unidos, da Divisão de Rotulagem Nutricional, modificou o método oficial AOAC originalmente desenvolvido para análise de ácidos graxos em produtos derivados de cereais. O método foi empregado na quantificação dos AG, incluindo os trans, em materiais certificados (fórmulas infantis) (Satchithanandam, Fritsche, Rader, 2001 e 2002), e em uma grande variedade de produtos (Satchithanandam et al., 2004). De Vries et al. (1999) propuseram alterações no método AOAC , as quais prevêem a utilização de colunas cromatográficas mais longas (SP 2560, 100 m), e de um número maior de padrões cromatográficos de EMAG para a separação e identificação dos componentes, além da utilização da técnica de CG/DM para confirmar a identidade de ácidos graxos. Neste trabalho sugeriu-se a introdução de tabelas com valores de retenção relativa dos AG e recomenda-se que a coluna empregada seja capaz de resolver os picos adjacentes 20:1/18:3 e 22:1/20:3/20:4, com valores de resolução mínima de 1,0. Estas recomendações foram introduzidas no método AOAC na revisão publicada em No caso de disputas comerciais entre países, a Comissão do Codex Alimentarius tem proposto o endosso dos métodos AOAC para a determinação dos AGS e do AOCS Ce 1h-05 para AGP e AGT, para fins de rotulagem Nutricional (Codex Alimentarius, 2007). Diversas combinações de condições analíticas para determinação dos ácidos graxos por CG têm sido propostas, isto é, tamanhos de colunas, programações de temperatura, métodos de extração, quantificação de GT e AG e preparação EMAG. As Tabelas 10 e 11 apresentam as condições analíticas dos métodos oficiais e de trabalhos que propõem a implementação destes métodos ou novas metodologias para agilizar as análises de rotina de GT e AG para fins de rotulagem nutricional. 78

79 Tabela 10. Condições analíticas de metodologias oficiais para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG. Método Condições Matriz AOCS Ce 1f 96 (revisado 2001) ou ISO 15304(E) (2002) Óleos vegetais refinados ou hidrogenados Preparação de ésteres metílicos AOCS Ce 2-66 (1966) (BF 3 /MeOH) ou IUPAC 2.301(1987) Analito AGT, AGS, AGM, AGP Coluna capilar de sílica fundida SP m X 0,25 mm, 0,20 µm SP m X 0,25 mm, 0,20 µm CP Sil ou 100 m X 0,25 mm, 0,20 µm CP Sil m X 0,25 mm, 0,20 µm CP Sil m X 0,25 mm, 0,20 µm BPX ou 120 m X 0,22 mm, 0,25 µm Temperatura programada da coluna Isotérmica 192 C 120 C a 240 C (4 C/min) Isotérmica 175 C Isotérmica 150 C Isotérmica 175 C Isotérmica 198 C Gás de arraste/fluxo He H 2 He He H 2 H 2 Pressão na coluna Kpa Velocidade linear cm/s Temperatura do injetor e temperatura do detector 250 C Razão de divisão da amostra 1:100 Quantificação PI TAG 13:0 Fatores de correção DIC Teóricos com relação ao 16:0 79

80 Tabela 10. (cont.) Condições analíticas de metodologias oficiais para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG Referência Condições AOAC (1996) e AOAC (revisado em 2001) AOCS Ce 1h-05 (2005) Proposta Determinar GT, AG em alimentos por CG/DIC Atender legislação dos USA de informação nutricional Determinar GT, AGS, AGM, AGP, inclusive AGT, em alimentos por CG/DIC Atender legislação dos USA de informação nutricional Matriz Método extração de gordura : produtos a base de cereais : alimentos em geral HA maioria dos alimentos; HB produtos lácteos e HM queijos; GT por CG/DIC Óleos brutos, refinados, parciais ou totalmente hidrogenados; óleos e gorduras de origem vegetal ou animal, exceto gordura de animais ruminantes, óleos de peixe e produtos lácteos Preparação de ésteres metílicos 7% BF 3 metanol AOCS Ce 2-66, 1997 ISO 5509(E), 1978 Analito GT, AGS, AGM, AGP AGT, AGS, AGM, AGP Coluna capilar / Temperatura programada da coluna Quantificação/identicaç ão SP m X 0,25 mm, 0,20 µm Programação: 100 C (4 min) 3 c/min 240 C (15 min) SP m X 0,25 mm, 0,20 µm (revisão de 2001) Gás de arraste/fluxo He (0,75 ml/min); Velocidade linear:18 cm/s; Temp. injetor: 225 C Temp. det:285 C; Razão de di visão da amostra: 1:200 PI TAG 13:0 (rotulagem nutricional) PI TAG 11:0 (rotulagem nutricional) TRR ou CG/DM ou IV (revisão 2001) SP 2560 ou CP Sil 88 (100m) H 2 (1mLl/min); pressão na coluna 170 Kpa (25psi) Temp. coluna:isotérmica 180 C Temp. injetor e detector: 250 C; Razão de divisão d a amostra: 1:100 PI TAG 21:0 Fatores de correção DIC Parâmetros de desempenho Experimental com relação ao 11:0 Teórico com relação ao 21:0 Resultados estudos colaborativos: CVr até 11% para GT (teor > 1%) CVr AGS até 25% (< 0,3%) CVr AGM até 18% (< 0,3%) CV r e CV R para teores menores que 0,1% AGT (p/p ésteres metílicos >30%) 80

81 Tabela 11. Condições analíticas de metodologias para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG. Referência Condições House et al., 1994 Proposta Matriz Avaliar método extração de GT e AG por HA, na presença de antioxidante a partir dos AG por CG/DIC (atender legislação rotulagem USA). Comparação GT e AG por método gravimétrico e por CG/DIC Cereais, produtos lácteos, pescados, produtos panificação e óleo de soja não hidrogenado como referência Método extração de gordura Métodos hidrolíticos semelhante AOAC GT grav. com éter etílico (AOAC ) Preparação de ésteres metílicos 7% BF 3 /MeOH Analito GT, AGS,AGM,AGP,AGT Coluna capilar/ Temperatura programada da coluna Quantificação/identificação Fatores de correção DIC Parâmetros de desempenho DB Wax 30 m X 0,25 mm, 0,25 µm SP m X 0,25 mm, 0,20 µm 1-DB WAX: 120 C (5 min) 4 C/min/ 240 C (30 min). Te mpo análise: 42min 2 -SP C (3 min) 4 C/min / 240 C (30 min). Te mpo análise: 62min 3- SP2340: 80 C (3 min) 4 C/min /240 C (30 min). Tem po análise: 70min Gás de arraste: H 2 Divisão da amostra: 1:20 PI TAG 19:0 Experimental com relação EMAG 19:0 CVr < 5% para GT por CG p/ os 10 alimentos Recuperação quantitativa do óleo de soja (referência) na presença de antioxidante pirogalol. GT por grav. > GT por CG/DIC 81

82 Tabela 11 (cont.). Condições analíticas de metodologias para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG. Referência Condições Ali et al., 1997 Koning et al., 2001 Avaliar método de extração de GT e AG (inclusive Proposta trans) por HA gravimétrica e por CG/DIC (Atender Empregar sistema automatizado para a legislação USA) determinação de AG, AGT, Matriz 43 produtos alimentícios: molhos, biscoitos, margarinas, fórmulas infantis, maionese, óleos e gorduras, produtos cárneos, cereais matinais Óleos e Gorduras Método extração de gordura Gravimétrico (AOAC ) e a partir AG por CG/DIC Preparação de ésteres metílicos BF 3 14% em metanol Comparação NaOCH 3 /MeOH X BF 3 14% /MeOH Analito GT, AG, AGT AG inclusive AGT - Coluna capilar/condições cromatográficas Temperatura programada da coluna CG/DIC SP m X 0,25 mmx 0,20 µm 175 C (14 min) 5 C/min até 185 C (50 min) Gás de arraste/fluxo: H 2/ /0,7mL/min Pressão na coluna: 200 Kpa Temp. do injetor e detector: 225ºC CG/DIC CP-Sil m 176 C (35 min) Gás de arraste: H 2; Pressão na coluna :150 Kpa Quantificação PI TAG 13:0 Parâmetros de desempenho Faixa de trabalho linear CG/DIC GT: 0,9 96,7% AGS: 0,2 16,8% AGI: 0,5-89,3% AGT: C16:1t: 0,25 1,50 mg/g C18:1t 0,87 268,32 mg/g C18:2: 0,23 7,92 mg/g. GT por grav 20 a 30 % > GT por CG GT CG % CVr < 5% 82 Rapidez e mínima manipulação da amostra. Boa repetitividade. %CVr até 1,5% para componentes majoritários e 11% para aqueles com resposta um pouco acima do nível de ruído

83 Tabela 11 (cont.). Condições analíticas de metodologias para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG. Referência Condições Satchithanandam, Fritsche e Rader (2001) Huang, Wang e Crenshaw (2006) De Vries et al. (1999) Proposta Matriz Método extração de gordura Preparação de ésteres metílicos Determinar GT, AG, AGT, a partir dos AG por CG propondo modificações no método AOAC Fórmulas infantis, inclusive amostra de referência certificada NIST 1846 AOAC Avaliar metodologia baseada no método AOAC empregando CG/DM para quantificação de AGT GVPH AOAC modificado 14% BF 3 /MeOH NaOCH 3 /MeOH 0,5N. Apresentar modificações para o método AOAC ; ampliar a identificação e quantificação AG inclusive os trans Alimentos em geral AOAC modificado BF 3 14% /MeOH Analito GT, AGS, AGM, AGP, AGT AGT GT, AG, AGT Técnica/ coluna capilar programação cromatográfica CG/DIC CP Sil m X 0,25 mm, 0,20 µm Prog. 120 C (5 min) 4 C/min -240 C (30 min) Gás de arraste/fluxo: H 2 (1mL/min) Vel. linear: 28, 5 cm/s; Temp. do injetor e detector: 250 C Razão de div. da amostra: 1:20 CG/DM eletroionização 70 ev Coluna: AT Silar m X 0,25 mm, 0,20 µm. Razão de div. da amostra: 1:50 1- Isotérmica: 180 C C(10 min) 5 C/min / 200 C (2 min) C (10 min) 2,7 C/min/ 200 C (3 min); Gás de arraste/fluxo: He CG/DIC SP m 100 C (4 min) 3 C/min/ 240 C (15 min) gás de arraste: He Velocidade linear: 20cm/s Temp. injetor e detector:285 C Razão de div. da amostra: 1:139 Identificação Padrões EMAG e TRR Estrutura química /DM Estrutura química/ DM e TRR Quantificação PI TAG 13:0 PI TAG 17:0 PI TAG 11:0 Fator de correção DIC Experimental com relação 13:0 (996-01) Experimental com relação 17:0 Parâmetros de desempenho CV% < 5% para a maioria AG com mais de 1% (amostra certificada NIST). Valor de GT por CG/DIC (26,27 ± 0,25 %) compatível com o de referência (27,1 ± 0,59%) Resolução de 10 EMAG trans Recuperação do PI 99%. Coeficiente correlação das curvas de calibração 0,9998. CVr recuperação 1,5% 83

84 Tabela 11 (cont.). Condições analíticas de metodologias para determinação de ácidos graxos cis/ trans em alimentos por CG. Kramer Blackadar e Zhou Kramer Blackadar e Zhou (2002) (2002) Golay et al. (2006) Método 1 Método 2 Referência Condições Proposta Comparar determinação AG (inclusive de baixo peso molecular), AGT e CLA empregando colunas capilares de diferentes comprimentos por CG/DIC Validar método para determinar AG, inclusive trans, empregando derivação direta sem extração de gordura Matriz Leite de vaca Produtos lácteos em pó Preparação de ésteres metílicos Metilação: direta/naoch 3 Metilação: direta NaOCH 3 /MetOH 5% Analito AGS, AGT e CLA AG, AGT, de baixo PM e CLA Coluna capilar de sílica fundida/ programação cromatográfica CP SIL m X 0,25 mm, 0,25 µm 45ºC(4min)13ºC/min/ 175ºC (27 min); 4ºC/min/ 215ºC (35 min) Supelcowax m X 0,25 mm, 0,25 µm 65ºC (1 min) 13ºC/min/ 195ºC (50 min) 15ºC/min/ 240 C (50 min) CG/DIC CP SIL m X 0,25 mm, 0,25 µm 60 C (5 min) 15 C/min/ 165 C (1 min) 2 C/min/ 225 C (17 min) Gás de arraste/fluxo H 2 H 2 H 2 Pressão na coluna 175 KPa 175 Kpa 200Kpa Velocidade linear 34,0 cm/s 19,8 cm/s Temperatura do injetor e Temperatura do detector 250ºC 250ºC Razão de divisão 1:15 1:25 Injeção a frio na coluna on colunm 300 C Quantificação PI TAG 13:0 e EMAG 11:0 Fatores de correção DIC Experimental com relação EMAG 13:0 Parâmetros de desempenho Melhores resoluções com coluna de 100 m, (isômeros CLA e trans C18:1, C18:2 e C18:3) Boa resolução AGS de cadeia curta e completa separação do par crítico 18:3 n-3 e 20:1 n-11 ou n-9 Recuperação PI EMAG 11:0 e TAG 13:0: %. LD: 0,03g/100g de AG LQ: 0,1g/100g de AG Faixa de trabalho: 0,10 a 80,0 g/100g de AG 84

85 II. OBJETIVOS Considerando a necessidade do aprimoramento constante das ações de controle sanitário nas áreas de alimentos e proteção à saúde do consumidor e também o direito dos consumidores terem informações exatas sobre as características e a composição nutricional dos alimentos que adquirem, este trabalho teve como objetivos: Comparar os procedimentos analíticos que estão sendo adotados nos laboratórios bromatológicos brasileiros, com relação aos métodos recomendados por organismos internacionais para a análise de lipídios ou GT, AGS, AGP e AGT em diferentes matrizes alimentares. Verificar se existem diferenças significativas entre os procedimentos e se os resultados atendem a tolerância de ± 20% de variabilidade com relação ao valor declarado, preconizado na legislação em vigor. Avaliar os diferentes procedimentos analíticos visando, além do desempenho do método, o custo, rapidez e a diminuição do volume de solventes tóxicos empregados. Fornecer subsídios técnicos para os laboratórios brasileiros padronizarem as metodologias de determinação de GT, AGS, AGP e AGT, para adequação da rotulagem nutricional com maior confiabilidade técnico-analítica. 85

86 III. MATERIAL 1. Amostras Neste estudo foram utilizados materiais de referência de óleos, gorduras e alimentos e uma amostra comercial de biscoito de chocolate, elaborada com GVPH. Na Tabela 12 constam o tipo, fornecedor e outras informações sobre os materiais de referência estudados. Tabela 12. Materiais de referência: produto, fornecedor e componentes de referência. Produto Óleo vegetal (mistura 90% de azeite de oliva virgem + 5 % de óleo de colza refinado + 5% de óleo de soja refinado) Gordura vegetal parcialmente hidrogenada (GVPH) Fornecedor 1 COI amostra 28/05 2 FAPAS - rodada 27/04 Componentes com valores de referência AG (% p/p ésteres metílicos): 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 22:0 18:1t, 18:2t + 18:3t AGT: 18:1 trans 18:2 trans Ácidos graxos trans totais Ovo em pó Leite em pó Fórmula infantil Queijo em pó 3 AOCS série 2004/2005 rotulagem nutricional 3 AOCS série 2004/2005 rotulagem nutricional 3 AOCS série 2005/2006 rotulagem nutricional 3 AOCS série 2004/2005 rotulagem nutricional AG (% p/p ésteres metílicos). GT, AGS, AGP e AGT em g/100g de amostra AG (% p/p ésteres metílicos) GT, AGS, AGP e AGT em g/100g de amostra AG (% p/p ésteres metílicos). GT, AGS, AGP e AGT em g/100g de amostra AG (% p/p ésteres metílicos) GT, AGS, AGP e AGT em g/100g de amostra Sobremesa de baunilha 3 AOCS série 2004/2005 rotulagem nutricional 86 AG (% p/p ésteres metílicos) GT, AGS, AGP e AGT em g/100g de amostra 1 COI: Conselho Oleícola Internacional Espanha. 2 FAPAS: Food Analysis Performance Assessment Scheme Central Science Laboratory Reino Unido. 3 AOCS: American Oil Chemist Society Estados Unidos.

87 2. Solventes, reagentes e padrões Os solventes e reagentes utilizados para as etapas de extração de gordura e preparação dos EMAG foram de grau analítico: metanol, clorofórmio, éter de petróleo, éter etílico, etanol a 95%, ácido clorídrico, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, sulfato de sódio e hidróxido de sódio. Foram também utilizados os seguintes solventes grau cromatográfico: n-hexano e metanol. Para a determinação da gordura total e da composição de ácidos graxos pelo método AOAC (1996) ou (2001), foram utilizados dois padrões cromatográficos de triacilgliceróis (TAG): 11:0 e 13:0, marca Sigma (T5534 e T3882) com pureza aproximada de 98% e 99%, respectivamente. Preparação: pesar, com exatidão, cerca de 250 mg do padrão em balão volumétrico calibrado de 100 ml. Dissolver e completar o volume com n- hexano. Transferir a solução para um frasco âmbar e armazenar em geladeira. Para a determinação dos ácidos graxos, da gordura extraída do alimento, utilizaram-se dois padrões internos de EMAG: 11:0 (undecanóico) e 13:0 (tridecanóico), ambos da marca Sigma (U0250 e T0627) e com pureza aproximada de 99%. Preparação: pesar, com exatidão, cerca de 250mg do padrão para balão volumétrico calibrado de 50 ml, dissolver e completar o volume com n-hexano. Transferir para um frasco âmbar e armazenar em geladeira ou em freezer. Padrões individuais e misturas com teores certificados de EMAG foram utilizados para identificar os componentes das amostras e determinar os fatores de correção de resposta do detector de ionização de chama (DIC). Os padrões empregados foram os seguintes: mistura de 37 EMAG, variando de 4:0 a 24:0, marca Supelco (18919), com quantidades certificadas de cada componente (Tabela 13); mistura de EMAG isômeros cis-trans do ácido linoléico (18:2), marca Sigma (L8404), com a quantidades especificadas na Tabela 14; mistura de EMAG isômeros cis-trans do ácido linolênico (18:3), marca Sigma (L6031), com quantidades descritas na Tabela 15; e padrões de EMAG individuais, marca Sigma, com aproximadamente 99% de pureza: elaídico (18:1 9t); vacênico (18:1 11c); trans vacênico (18:1 11t); (18:1 7c); (18:1 12c); CLA (18:2 9c,11t e 18:2 10t,12c); palmitoelaídico (16:1 9t), palmitico 87

88 (16:0); linolelaídico (18:2 9t,12t); EPA (20:5 5c,8c,11c,14c,17c); AA (20:4 5c,8c,11c,14c); DHA (20:6 4c,7c,10c,13c,16c,19c). Preparação das soluções de mistura de padrões de EMAG de 4:0 a 24:0 e das misturas de padrões de ésteres metílicos isômeros cis/trans do ácido linoléico e linolênico: o conteúdo da ampola (contendo 100 mg da mistura de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos) foi transferido para balão volumétrico calibrado de 25,0 ml com n-hexano. O volume do balão foi completado com o solvente; a solução foi dividida em flaconetes de 1,5 ml e armazenada em freezer. Preparação das soluções padrão de EMAG individuais: o conteúdo de cada ampola (25 a 100 mg) foi transferido, cuidadosamente, para balão volumétrico calibrado de 25,0 ou 50,0 ml com n-hexano. Com pipeta volumétrica, foi adicionado 1,0 ml da solução padrão de EMAG 13:0 e completado o volume do balão com n-hexano. 88

89 Tabela 13. Mistura de 37 padrões de EMAG variando de 4:0 a 24:0, com quantidades certificadas de cada ácido graxo, conforme descrito abaixo: Componente EMAG % Massa 1 butírico (4:0) 4 2 capróico (6:0) 4 3 caprílico (8:0) 4 4 cáprico (10:0) 4 5 undecanóico (11:0) 2 6 láurico (12:0) 4 7 tridecanóico (13:0) 2 8 mirístico (14:0) 4 9 miristoléico (14:1 9c) 2 10 pentadecanóico (15:0) 2 11 cis 10 pentadecenóico (15:1) 2 12 palmitíco (16:0) 6 13 palmitoléico (16:1 9c) 2 14 heptadecanóico (17:0) 2 15 cis 10 heptadecenóico (17:1) 2 16 esteárico (18:0) 4 17 elaídico (18:1 9t) 2 18 oléico (18:1 9c) 4 19 linolelaídico (18:2 9t,12t) 2 20 linoléico (18:2 9c, 12c) 2 21 araquídico (20:0) 4 22 gama-linolênico (18:3 6c,9c,12c) 2 23 cis 11 eicosaenóico (20:1) 2 24 linolênico (18:3 9c,12c,15c) 2 25 henecosanóico (21:0) 2 26 cis 11,14 eicosadienóico (20:2) 2 27 behêmico (22:0) 4 28 cis 8,11,14 eicosatrienóico (20:3) 2 29 erúcico (22:1 13 c) 2 30 cis 11,14,17 eicosatrienóico (20:3) 2 31 araquidônico (20:4 5c,8c,11c,14c) 2 32 tricosanóico (23:0) 2 33 cis 13,16 docosadienóico (22:2) 2 34 lignocérico (24:0) 4 35 cis 5,8,11,14,17 eicosapentaenóico (20:5) 2 36 nervônico (24:1 15 c) 2 37 cis 4,7,10,13,16,19 docosahexaenóico (22:6) 2 89

90 Tabela 14. Mistura de ésteres metílicos de isômeros cis(c)/trans(t) do ácido linoléico (18:2), com quantidades aproximadas de cada isômero. Componente EMAG % Massa 1 (18:2 9t,12t) 50 2 (18:2 9c,12t) 20 3 (18:2 9t,12c) 20 4 (18:2 9c,12c) 10 Tabela 15. Mistura de ésteres metílicos de isômeros cis (c)/trans (t) do ácido linolênico (18:3), com quantidades aproximadas de cada isômero. Componente EMAG % Massa 1 (18:3 9t,12t,15t) 30 2 (18:3 9t,12t,15c) 15 3 (18:3 9t,12c,15t) 15 4 (18:3 9c,12c,15t) 15 5 (18:3 9c,12t,15t) 7 6 (18:3 9c,12t,15c) 7 7 (18:3 9t,12c,15c) 7 8 (18:3 9c,12c,15c) 3 3. Vidraria, equipamentos e acessórios Vidraria: Extrator de Soxhlet. Pipetas volumétricas calibradas de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 ml. Pipetas graduadas de 5 ml. Balões volumétricos calibrados de 10,0; 25,0; 50,0; e 100,0 ml. Tubos de centrífuga, com tampas de rosca e anel de vedação de material resistente a solventes, ácidos e bases, de 20, 50 e 100 ml. Pérolas de vidro. Erlenmeyers de 500 ml com juntas esmerilhadas 24/40. Funil de vidro. Provetas de 10, 25, 50 e 100 ml. Flaconetes de 1,5 ml com tampa Septos teflon/silicone 90

91 Equipamentos e acessórios: Balança analítica - capacidade de pesagem ± 0,0001g, Bosh, modelo SAE 200. Cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, marca Shimadzu, modelo CG 17A. Coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária de ciano propilsiloxana de 100 m de comprimento, espessura do filme de 0,20 µm e diâmetro interno de 0,25 cm. Marca Supelco, SP Centrífuga de bancada digital para tubos de 50 e 100 ml com rotação de até 3000 rpm, marca Nova Técnica, modelo NT 812. Pipetador automático (50 µl a 200 µl e 200 µl a 1000 µl). Agitador de tubo tipo vortex, marca Phoenix, modelo AP 56. Banho Maria com controle de temperatura entre C, marca Nova Técnica. Concentrador de amostras, marca Tecnal, modelo TE 0194-E3. Extrator de Sebelin, marca Eletrolab. Rotavapor, marca Tecnal, modelo TE 120. Chapa aquecedora, marca Tecnal. Estufa com capacidade de manter 100 ± 2ºC, marca Fanem. IV. MÉTODOS 1. Análise por CG/DIC 1.1. Otimização das condições cromatográficas. Previamente aos procedimentos de extração de gordura e preparação dos EMAG, as condições cromatográficas foram otimizadas com padrões de misturas de ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG). As amostras foram analisadas em cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama. Três programações cromatográficas foram testadas (Tabela 16) para análise em coluna capilar de sílica fundida de 100 m, SP 2560 (Supelco) com fase estacionária 100% biscianopropil polisiloxano (0,25 mm diâmetro interno e 0,20 µm espessura do filme). 91

92 Tabela 16. Condições cromatográficas para análise de EMAG em coluna capilar de sílica fundida de 100m SP 2560 por CG/DIC. Condições Temperatura programada da coluna Método 1 Kramer, Blackadar e Zhou (2002) Método 2 45ºC (4 min) 192ºC (40 min) Método 3 AOCS Ce 1h-05 (2005) 180 C (60 min) Rampa de temperatura 13ºC/min até 175ºC; 4ºC/min até 215ºC (35 min) 15ºC/min até 215ºC (20 min) 15ºC/min até 215ºC (20 min) Tempo total da análise 86,0 min (58,5 min eluição 24:0) 61,5 min (46 min eluição 24:0) 82 min (62,5 min eluição 24:0) Gás de arraste H 2 H 2 H 2 Pressão na coluna 175 KPa 130 KPa 175 KPa Velocidade linear 34,0 cm/s 19,8 cm/s 26,0 cm/s Fluxo 1,90 ml/min 0,66 ml/min 1,0 ml/min Temperatura do injetor e temperatura do detector Razão de divisão da amostra 250ºC 220ºC 250 C 1:15 1:25 1:100 Foram determinados o número de pratos teóricos (n) e a resolução (R) a partir do software do equipamento (Class GC 10, Shimadzu). O desempenho dos métodos também foi avaliado pela análise de duas amostras, sendo uma de óleo vegetal e outra de gordura vegetal parcialmente hidrogenada, com valores de referência para alguns ácidos graxos (Tabela 12). Estas amostras também foram empregadas para a avaliação de dois procedimentos de preparação dos ésteres metílicos Determinação dos fatores de correção de resposta no DIC Para otimizar as condições cromatográficas foram calculados fatores experimentais e teóricos (K Agi ) de correção de resposta do detector de ionização de chama (DIC). Os fatores de correção de resposta do DIC experimentais foram obtidos pela análise das soluções dos ésteres metílicos de ácidos graxos individuais e 92

93 das soluções padrão de mistura dos ésteres metílicos de 4:0 a 24:0, isto é, com quantidades certificadas de 37 componentes. Os cálculos destes fatores são descritos a seguir: Cálculo experimental: Injetar, em triplicata, 1 µl da solução padrão de mistura de EMAG de 4:0 a 24:0. Identificar cada pico e determinar os fatores de correção (K'i) individuais com relação EMAG tridecanóico (13:0), utilizando a seguinte equação: onde: K ' Agi = M M Agi C 13. A. A C 13 Agi M Agi = % EMAG i na mistura de padrões A C13 = média das áreas do pico do EMAG13:0 (ou 16:0) M C13 = % do EMAG 13:0 na mistura de padrões A Agi = média das áreas do EMAG i na mistura de padrões Cálculo teórico: M = ( nagi 1) Ac Agi K Agi. K Agi = fator de resposta para o ácido graxo i. massa molecular do EMAG i. M Agi = n Agi = número de átomos de carbono do éster metílico do ácido graxo i. A c = massa atômica do carbono (12,01). Pesos atômicos utilizados no cálculo: Carbono =12,01; Hidrogênio = 1,0079; Oxigênio =15,994. Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relação ao EMAG 16:0: K K ' Agi = K Agi C 16 K Agi = fator relativo de correção, para o ácido graxo i. K C13 = fator de resposta do DIC para o 16:0. K Agi = fator de resposta do DIC para o ácido graxo i. 93

94 1.3. Identificação dos componentes Os componentes foram identificados pela co-injeção de padrões e comparações com os tempos de retenção absoluto e relativo ao EMAG 13:0 (TRR 13:0 ), o qual foi calculado pela divisão do tempo de retenção de cada componente pelo tempo de retenção do pico do EMAG 13:0. 2. Preparação dos ésteres metílicos de ácidos graxos As amostras de óleos e gorduras de referência ou os lipídios extraídos dos alimentos foram submetidos a reações de transesterificação ou hidrólise e esterificação. Foram comparados os procedimentos IUPAC com modificações (IUPAC, 1987) e o método Hartman e Lago (1973) modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (1993). O Fluxograma 1 apresenta as etapas dos procedimentos de preparação dos ésteres metediços. 94

95 Fluxograma 1 Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos Método IUPAC modificado Pesar cerca de 100 mg do óleo ou gordura em tubo de centrífuga com tampa de 20 ml Adicionar 3 ml de n-hexano + 0,2 ml de solução metanólica de KOH 2N Agitar em vortex por 30 s Adicionar 3 ml de solução saturada de NaCl separar as fases Utilizar cerca de 1 µl da fase orgânica superior no CG Método Hartman e Lago (1973) modificado por Maia e Rodrigues- Amaya (1993) Pesar entre 30 e 100 mg do óleo ou gordura em tubo de centrífuga com tampa de 50 ml Adicionar 3 ml de n-hexano ou de 1,0 a 5,0 ml da solução de padrão interno (EMAG 13:0/ 11:0) e 4mL de NaOH 0,5N metanólico Agitar em vortex por 30 s Colocar o tubo em banho-maria a 60-70ºC (3 a 5 min) Resfriar rapidamente Adicionar 5 ml de solução esterificante (10 g NH 4 Cl em 300 ml de metanol e 15 ml de H 2 SO 4 ) Repetir a agitação, aquecimento e resfriamento Adicionar 4 ml de solução de NaCl saturada + 3 ml de n-hexano Agitar em vortex por 30 segundos separar as fases Utilizar cerca de 1 µl da fase orgânica superior no CG 95

96 Conforme é mostrado no Fluxograma 1, a tomada de amostra máxima descrita no método de Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues- Amaya (1993) é de 100 mg. No presente trabalho, para garantir uma reação completa de esterificação, no caso de amostras de alimentos em que se obteve de 100 a 200 mg de lipídios extraídos pelo método AOAC modificado, foram adequadas as proporções dos reagentes do método. Dobrou-se a quantidade de NaOH 0,5N (8 ml) e de solução esterificante (10 ml). A escolha da programação cromatográfica, para prosseguimento das análises nas gorduras das amostras de alimentos, foi definida pelos resultados de desempenho da coluna na separação dos padrões de EMAG e na quantificação dos AG das amostras de referência de óleos e gorduras. 3. Extração e quantificação dos lipídios dos alimentos O teor de gordura total dos alimentos foi determinado por diferentes métodos gravimétricos e também pelo método AOAC (2001) (ou , 1996), a partir da composição de ácidos graxos obtida por CG/DIC. A Tabela 17 identifica os métodos empregados para cada tipo de amostra e os procedimentos detalhados encontram-se nos Fluxogramas de 2 a

97 Tabela 17. Métodos para a determinação de GT nas amostras de alimentos. Amostras Ovo em pó (referência AOCS) Leite em pó (referência AOCS) Fórmula infantil em pó (referência AOCS) Queijo em pó (referência AOCS) Pudim de baunilha (referência AOCS) Biscoito de chocolate (amostra comercial) HA (AOAC , 1925) HA (AOAC , 1973) HA (AOAC , 1973) HA (AOAC , 1973) HA (AOAC , 1973) HA (AOAC , 1973) Métodos de extração de gordura total Gravimétrico Bligh e Dyer (1959) Bligh e Dyer (1959) Bligh e Dyer (1959) Bligh e Dyer (1959) Folch, Lees, Stanley (1957) Bligh e Dyer (1957) Soxhlet (éter etílico) (IAL, 2005) Roese Gottlieb (AOAC , 1973 ) Roese Gottlieb (AOAC , 1973) HM (AOAC , 1933) Soxhlet (éter etílico) (IAL, 2005) Cálculo a partir dos AG CG/DIC AOAC /01 HA* AOAC /06 HB* AOAC /06 HB* AOAC /06 HM * AOAC /06 HA* AOAC /06 HA* AOAC /06 HA* AOAC /06 HB* HA: hidrólise ácida; HB: hidrólise básica; HM: hidrólise mista. * Procedimentos baseados nos métodos: AOAC (2001), AOAC (1996) e descrito por Sachithamandam, Fritsche, Rader (2001). 97

98 Fluxograma 2 Procedimento para determinação de lipídios totais em ovo em pó Hidrólise Ácida (AOAC , 1925) Pesar cerca de 1,0 g da amostra em tubo de centrífuga de 100 ml com tampa Adicionar 10 ml de HCl (4+1) Aquecer por 30 min após ebulição em banho Agitar o tubo a cada 5 min Resfriar o tubo com água Transferir o conteúdo do tubo para funil de separação de 250 ml com 25 ml de éter etílico Adicionar 25 ml de éter de petróleo (PE< 60 ºC) Extrair agitando o funil de separação por 1 min Deixar separar as fases por 5 min Coletar a fase etérea em outro funil de separação de 250 ml Extrair mais duas vezes com 15 ml de uma mistura de éter etílico:éter de petróleo 1:1 Juntar as frações etéreas no funil de separação de 250 ml Filtrar a fração etérea em papel de filtro Recolher em béquer de 150 ml tarado Evaporar o solvente em sistema de evaporação com N 2 Secar em estufa a 105 ºC por 60 min Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor de lipídios totais 98

99 Fluxograma 3 Procedimento para determinação de lipídios totais Hidrólise Ácida (IAL, 2005; AOAC , 1973) Pesar cerca de 5,0 g da amostra em erlenmeyer de 500 ml Adicionar 100 ml água destilada Adicionar 60mL de HCL 12 N (concentrado)+ pérolas de vidro Aquecer por 30 min após ebulição em refluxo Filtrar a solução morna em papel de filtro duplo Lavar a amostra com água destilada fria até ph entre 6-7 Secar a amostra no papel de filtro em estufa a 100 C Dar forma de cartucho ao papel de filtro Extrair no extrator de Soxhlet por 6 horas com éter de petróleo Evaporar o solvente do balão previamente tarado (rotavapor) Secar em estufa a 105 C 60 min Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor dos lipídios totais 99

100 Fluxograma 4 Procedimento para determinação de lipídios totais Bligh e Dyer (1959) modificado (Kirk, Sawer e Egan (1996)) Pesar cerca de 1,0 g da amostra em frasco de centrífuga de 100 ml Adicionar 8 ml água destilada Adicionar 20mL de metanol + 10 ml de clorofórmio Agitar 2 min (vortex) Adicionar 10 ml de clorofórmio Adicionar 10 ml de solução de Na 2 SO 4 1,5% Agitar 5 min (vortex) Centrifugar a mistura por 10 min 2000 a 2500 rpm Transferir a mistura para funil de separação de 250 ml Retirar a camada inferior de clorofórmio Filtrar em papel de filtro grosso passando por Na 2 SO 4 anidro (3 g) para béquer de 50 ml previamente tarado Evaporar o clorofórmio (60 C) Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Secar em estufa a 105 C (60 min) Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor dos lipídios totais 100

101 Fluxograma 5 Procedimento para determinação de lipídios totais em leite Método AOAC (1973) / Roese Gottlieb-Hidrólise básica ou (1992) ou (1932) Pesar cerca de 2,0 g da amostra em tubo de centrífuga de 100 ml Adicionar 10 ml de água destilada morna (30 C) Adicionar 2 ml NH 4 OH. Agitar Adicionar 10 ml de álcool 95%. Agitar Adicionar 25 ml de éter etílico Agitar vigorosamente (1min). Esfriar Adicionar 25 ml de éter de petróleo (PE C) Agitar vigorosamente (1min) Agitar em centrífuga por 5 minutos com rotação de 600 rpm Transferir a amostra para funil de separação de 250 ml Deixar em repouso por 30 min para separar as fases Transferir a fração etérea para frasco tarado Adicionar ao resíduo mais duas frações de extração com 5 ml de éter etílico + 5 ml de éter de petróleo Transferir a fração etérea para o frasco tarado Adicionar ao resíduo mais 5 ml de etanol e agitar Repetir a extração com 15 ml de éter etílico + 15 ml de éter de petróleo Agitar Repetir a extração com 15 ml de éter etílico + 15 ml de éter de petróleo, sem álcool Juntar as frações extraídas Separar os solventes por destilação (rotavapor) Secar em estufa a 105 C (60 min) Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor dos lipídios totais 101

102 Fluxograma 6 Procedimento para determinação de lipídios totais Método de Folch, Lees e Stanley (1957) Modificado Pesar cerca de 3,0 g da amostra homogeneizada em tubo de centrífuga de 100 ml Adicionar 60 ml de clorofórmio: metanol (2:1) Agitar em vortex por 3 min. Filtrar para funil de separação de 250 ml, usando papel de filtro comum Re-extrair o resíduo com 30 ml de clorofórmio:metanol (2:1) Agitar em vortex por 2 min Filtrar novamente para o funil de separação Lavar o tubo de centrífuga com clorofórmio (10 ml) e passar para o funil de separação Adicionar ao funil 22 ml de KCl 0,74% Agitar o funil por 1 min Deixar separar as fases Filtrar a fase inferior para béquer tarado de 100 ml, passando por Na 2 SO 4 anidro (1g). Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Colocar em estufa a 105 ºC por 30 min Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor dos lipídios totais 102

103 Fluxograma 7 Procedimento para determinação de lipídios totais em queijo AOAC , 1933/ Hidrólise mista Pesar cerca de 1,0 g da amostra em tubo de centrífuga de 100 ml com tampa Adicionar 9 ml de água destilada Adicionar 1 ml de solução NH 4 OH 58% (p/p) Agitar no vortex (30 s) Colocar os tubos em banho aquecido por 10 min Neutralizar com HCL Agitar no vortex 10 min Adicionar 10 ml de HCl 12 N (concentrado) Colocar os tubos em banho fervente por 20 min Esfriar e agitar em vortex por 10 min Adicionar 10 ml de etanol 95% Agitar em vortex Transferir o conteúdo dos tubos para funil de separação de 250 ml com 2 porções de 15 ml de éter etílico Extrair agitando o funil de separação por 1 min Adicionar 30 ml de éter de petróleo e agitar mais 1 min Deixar separar as fases por 5 min Coletar a fase etérea em outro funil de separação de 250 ml Extrair o resíduo mais duas vezes com 30 ml de uma mistura de éter etílico/éter de petróleo 1:1 Juntar as frações éteres no funil de separação de 250 ml Filtrar a fração etérea em lã de vidro desengordurada Recolher em béquer de 150 ml tarado Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Colocar em estufa a 105 ºC por 30 min Esfriar em dessecador Pesar (até peso constante) e determinar o teor dos lipídios totais 103

104 O teor de gordura total dos alimentos foi determinado também a partir da composição de ácidos graxos obtidos por CG/DIC pelo método AOAC (2001) (ou , 1996), modificado por Sachithamandam, Fritsche, Rader (2001). Estes pesquisadores substituíram, no método oficial, o frasco de Mojonnier por tubo de centrífuga e modificaram etapas de extração da fração lipídica com solvente orgânico, por partição, em funil de separação para o método que emprega hidrólise ácida. No presente trabalho, introduziu-se outras modificações no método proposto por Sachithamandam, Fritsche e Rader (2001), as quais estão descritas no Fluxograma 8. Um triacilglicerol (13:0) foi utilizado como padrão interno, antes da hidrólise. Nesta mesma etapa foi adicionado outro padrão interno de TAG 11:0, para avaliar a recuperação do método e o desempenho do procedimento de metilação. O método de metilação empregado foi o de Hartman e Lago (1973) modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (1993), substituindo, assim, a esterificação com solução metanólica de BF 3. Não foi adicionado ácido pirogálico como antioxidante. O padrão interno do TAG 13:0 foi dissolvido em n-hexano e não em clorofórmio como descrito no método original da AOAC. Para produtos lácteos e queijos, acrescentou-se modificações no método AOAC , as quais podem ser verificadas nos Fluxogramas 9 e 10. Durante a execução da etapa de extração dos lipídios para os alimentos, em geral, foram feitas pequenas alterações nos métodos. Nos procedimentos de Bligh e Dyer (1959) ou Folch, Stanley e Lee (1957) a extração foi realizada em funil de separação (após centrifugação) e toda a fração orgânica (clorofórmio) foi concentrada para a determinação dos lipídios. No caso dos métodos de extração de gordura em produtos lácteos (leite e queijo), onde no método oficial emprega-se frasco de Mojonnier, este foi substituido por tubo de centrífuga e funil de separação. O método AOAC (1973), originalmente desenvolvido para determinação de GT em produtos derivados de cacau, tem sido adaptado e empregado em laboratórios brasileiros para a determinação de lipídios ou GT em uma ampla gama de produtos alimentícios (fluxograma 3). A principal diferença do método adaptado é o tempo de aquecimento da amostra em 104

105 ebulição, isto é, de 30 minutos equanto no procedimento original são 15 minutos. A extração por Soxhlet seguiu o descrito nas Normas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2005). A extração foi realizada em refluxo por 6 horas empregando éter etílico. Para garantir a qualidade analítica foram realizados os procedimentos descritos a seguir: Foram analisados os brancos com os reagentes, em duplicata, para todos os métodos, e o valor obtido corrigido no valor total de lipídios; A tomada inicial de amostra foi menor que a descrita pelos métodos originais no caso das amostras com teores elevados de lipídios; As amostras de alimentos de referência foram homogeneizadas antes das extrações e a amostra de biscoito obtida do comércio foi triturada e bem homogeneizada para extração da gordura e dos ácidos graxos; Foram feitas análises dos AG por CG/DIC sem adição de padrão interno (branco) para verificar a presença de interferentes nas amostras. A área dos interferentes no tempo de eluição dos padrões foi corrigida com relação à área do PI do EMAG 11:0 e/ou 13:0. 105

106 Fluxograma 8 Procedimento para determinação de GT e AG Método AOAC (rev. 2001) modificado por Sachithamandam, Fritsche e Rader (2001) Alimentos excluindo produtos lácteos e queijos Pesar quantidade da amostra que contenha de 100 mg a 200 mg de gordura em duplicata em tubo de centrífuga de 100 ml com tampa Adicionar a um dos tubos 2,0 ml da solução do PI TAG 13:0 e 2,0mL da solução do TAG 11:0 (5 mg/ml em n-hexano). No outro tubo adicionar 2,0 ml de hexano Preparar solução de HCl 8,3 N (25 ml de HCl + 11 ml de H 2O) Adicionar 2 ml de etoh 95% + 10mL de HCl 8,3N Agitar no vortex Colocar os tubos em banho aquecido por 40 min à temperatura entre 70 e 80 C Retirar do banho e adicionar 10 ml de etanol 95% Agitar em vortex Resfriar em banho de água a temperatura ambiente Transferir o conteúdo dos tubos para funil de separação de 250 ml com 2 porções de 15 ml de éter etílico Extrair agitando o funil de separação por 1 min Adicionar 30 ml de éter de petróleo e agitar mais 1 min Deixar separar as fases por 5 min Coletar a fase etérea em outro funil de separação de 250 ml Extrair o resíduo mais duas vezes com 30 ml de uma mistura de éter etílico/éter de petróleo (1:1) Juntar as frações etéreas no funil de separação de 250 ml Filtrar a fração etérea em papel de filtro Recolher em béquer de 150 ml tarado Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Pesar o béquer com o óleo Transferir a gordura com n-hexano para tubo de centrífuga de 50 ml Metilar segundo Hartman e Lago (1973) 106

107 Fluxograma 9 Procedimento para determinação de GT e AG Método AOAC (rev. 2001) modificado - produtos lácteos Pesar quantidade da amostra que contenha de 100 mg a 200 mg de gordura em duplicata em tubo de centrífuga de 100 ml com tampa Adicionar a um dos tubos 2,0 ml da solução de padrão interno do TAG C13:0 e 2,0 ml da solução do TAG 11:0 (5 mg/ml em n-hexano). No outro tubo adicionar 2,0 ml n-hexano Adicionar 2 ml de água destilada Agitar 30 segundos em vortex Adicionar 2 ml de EtOH 95% Adicionar 2 ml de solução NH 4OH 58 (%p/p) Agitar no vortex Colocar os tubos em banho aquecido por 10 min à temperatura entre 70 e 80 C Agitar no vortex 5 min Retirar do banho e adicionar 10 ml de etanol 95% Agitar em vortex Resfriar em banho de água a temperatura ambiente Transferir o conteúdo dos tubos para funil de separação de 250 ml com 2 porções de 15 ml de éter etílico Extrair agitando o funil de separação por 1 min Adicionar 30 ml de éter de petróleo e agitar mais 1 min Deixar separar as fases por 5 min Coletar a fase etérea em outro funil de separação de 250 ml Extrair o resíduo mais duas vezes com 30 ml de uma mistura de (1:1) éter etílico/éter de petróleo Juntar as frações éteres no funil de separação de 250 ml Filtrar a fração etérea em papel de filtro Recolher em béquer de 150 ml tarado Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Pesar o béquer com o óleo Transferir a gordura com n-hexano para tubo de centrífuga de 50 ml Metilar segundo Hartman e Lago (1973) 107

108 Fluxograma 10 Procedimento para determinação de GT e AG Método AOAC (rev. 2001) modificado - queijos Pesar quantidade da amostra que contenha de 100 mg a 200 mg de gordura em duplicata em tubo de centrífuga de 100 ml com tampa Adicionar a um dos tubos 2,0 ml da solução de padrão interno do TAG C13:0 e 2,0 ml da solução do PI de TAG C11:0 (5 mg/ml em n-hexano). No outro tubo adicionar 2,0 ml n- hexano Adicionar 4 ml de água destilada Agitar 30 segundos em vortex Adição de 2 ml de EtOH 95% Adicionar 2 ml de solução NH 4OH 58% p/p Agitar no vortex (30 s) Colocar os tubos em banho aquecido por 10 min à temperatura entre 70 e 80 C Agitar no vortex 10 min Retirar do banho e adicionar 10 ml de HCl 12 N (concentrado) Colocar os tubos em banho fervente por 20 min. Esfriar e agitar em vortex por 10 min Adicionar 10 ml de etanol 95% Agitar em vortex Resfriar em banho de água a temperatura ambiente Transferir o conteúdo dos tubos para funil de separação de 250 ml com 2 porções de 15 ml de éter etílico Extrair agitando o funil de separação por 1 min Adicionar 30 ml de éter de petróleo e agitar mais 1 min. Deixar separar as fases por 5 min Coletar a fase etérea em outro funil de separação de 250 ml Extrair o resíduo mais duas vezes com 30 ml de uma mistura de (1:1) éter etílico éter de petróleo Juntar as frações éteres no funil de separação de 250 ml Filtrar a fração etéreas em papel de filtro Recolher em béquer de 150 ml tarado Secar solvente em concentrador de amostras com N 2 Pesar o béquer com o óleo Transferir a gordura com n-hexano para tubo de centrífuga de 50 ml Metilar segundo Hartman e Lago (1973) 108

109 4. Quantificação dos ácidos graxos por CG/DIC As amostras de óleos e gorduras de referência foram submetidas aos dois métodos de preparação de EMAG (Fluxograma 1), enquanto as gorduras extraídas dos alimentos foram metiladas pelo método de Hartman e Lago (1973) modificado. Cerca de 1 µl da solução metilada foi injetada, com microseringa de 10 µl, em cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, nas condições descritas na Tabela 16. Os EMAG das gorduras dos alimentos foram analisadas pela programação cromatográfica otimizada do Método 1. Foram empregadas três formas diferentes de cálculos para determinar a concentração dos ácidos graxos nas amostras de alimentos e expressar o resultado em g/100 g da amostra Cálculo com PI de EMAG (13:0), após extração dos lipídios A uma porção precisa de 100 mg de lipídios extraídos das amostras, pelos métodos gravimétricos, foram adicionados os padrões internos dos EMAG undecanóico e tridecanóico (11:0 e 13:0) segundo o Fluxograma 1. A quantificação foi feita baseada nas relações da área de cada ácido graxo com a área do padrão interno, utilizando os fatores de correção de resposta do detector de ionização de chama (experimental ou teórico) e de conversão de ésteres metílicos de ácidos graxos para ácido graxo (Tabela18). Para o cálculo dos AG dos alimentos analisados, utilizaram-se os fatores de correção do DIC experimental em relação ao 13:0. Os valores das somas dos ácidos graxos saturados, mono e polinsaturados foram multiplicados pelo teor de lipídios da amostra para expressar o resultado em gramas de ácidos graxos por cem gramas do alimento. A concentração de cada ácido graxo foi determinada utilizando a Equação 1 abaixo: 109

110 conc Agi = M PI. A Agi. K' Agi m. A. f PI Agi. L.100 Equação 1 onde: M PI = massa do padrão interno (13:0) adicionada à amostra; A Agi = área do EMAG no cromatograma da amostra; K Agi = fator de correção de resposta de cada EMAG no DIC com relação ao 13:0; f Agi = fator de conversão de EMAG para AG (Tabela 18); L = teor de lipídios em gramas por cem gramas de amostra; m = massa da amostra em g; A PI = área do padrão interno EMAG (13:0) no cromatograma da amostra. Nota: Para picos sem fator de correção, foi usado o fator de correção do DIC do ácido graxo mais próximo calibrado Cálculo por normalização de área e fatores de conversão teóricos Nessa determinação, as porcentagens em massa para cada AG foram multiplicadas pelo teor de lipídios e por fatores de conversões teóricos (Equação 2), que contabilizam a transformação de ésteres metílicos de ácidos graxos em ácidos graxos e a contribuição dos ácidos graxos provindos de triacilgliceróis e de fosfolipídios para os diferentes tipos de alimentos (Mc Cance e Widdowson s, 2002). conc ' AGi (% AAGi ) ( K'.% A ) K AGi =. AGi AGi. L FCT Equação 2 Onde, conc Agi = concentração do AG i (g/100g de amostra); %A Agi = porcentagem de área do EMAG (normalização); K Agi = fator de correção de resposta do DIC de cada EMAG com relação ao 13:0 ou 16:0; FCT= fator de conversão de gordura para ácidos graxos (Tabela 9); L= teor de lipídios em gramas por cem gramas de amostra. Para o cálculo dos AGS, AGM, AGP e AGT dos alimentos analisados, utilizaram-se os fatores de correção do DIC experimental em relação ao 13:0. 110

111 No caso dos AG individuais das amostras de óleos, gorduras e alimentos de referência o cálculo da concentração foi feito por normalização de área. As porcentagens de área foram multiplicadas pelos fatores de correção teóricos para o DIC relativos ao 16:0, conforme descrito no método AOCS Ce 1f-96 (2001). Os valores foram expressos em porcentagem de massa dos ésteres metílicos e comparados com os dados de referência Cálculo com PI de TAG 13:0 (método AOAC ou ) Esse tipo de cálculo foi utilizado para a gordura extraída pelo método da AOAC (1996, revisado em 2001) ou (1996). A gordura total foi calculada a partir dos AG determinados por CG/DIC e expressa como a soma dos TAG equivalentes. A determinação dos TAG ocorre a partir da condensação de três moléculas de ácidos graxos com uma de glicerol; dessa relação surgiu a fórmula matemática mostrada na Equação 3, a qual determina a massa de cada EMAG (M EMAgi ). Entretanto, para o cálculo da gordura total é necessária a massa de cada componente como seu correspondente triacilglicerol (M Tgi ), apresentado na Equação 4. Já os teores de gorduras saturadas, trans, monoinsaturadas e polinsaturadas, devem ser expressos na forma de ácido graxo (M AGi ), que podem ser obtidos a partir da Equação 5. Para essas transformações foram utilizados os fatores f Agi e f Tgi, apresentados na Tabela 18. A M = EMAgi Agi. m tc.1,0059. K' 13 A AgC 13 Agi Equação 3 Onde, M EMAgi = massa de cada componente de EMAG; A Agi = área do pico de cada componente; m tc13:0.= massa do padrão interno de TAG 13:0; 1,0059 = fator de conversão do PI de TAG (13:0) em EMAG correspondente; K Agi = fator de resposta experimental do DIC, em relação ao EMAG 13:0; A AgC13:0 = área do pico do PI 13:0. 111

112 M = M. f Tgi EMAgi Tgi Equação 4 M = M. f Agi EMAgi Agi Equação 5 Onde, M Tgi = massa de cada componente expressa como TAG correspondente ; f Tgi = fator de conversão de EMAG em TAG (Tabela 18) ; M Agi = massa de cada componente expressa como AG correspondente; f Agi = fator de conversão de EMAG em AG, Tabela 18. Em todos os métodos de cálculos os resultados finais de gorduras saturadas, trans, monoinsaturados e polinsaturadas são expressos em gramas por cem gramas de amostra. Os ácidos graxos trans incluem os isômeros 16:1 trans, 18:1 trans, 18:2 trans (inclusive CLA 18:2 9c11t) e 18:3 trans. 5. Recuperação dos métodos com padrão interno A porcentagem de recuperação dos métodos de quantificação, com padrões internos (TAG 13:0 e EMAG 13:0), foi avaliada pela adição de um segundo padrão interno às amostras (EMAG 11:0 ou TAG 11:0). Foi monitorada a área do padrão adicionado (nos brancos e amostras) e calculada a recuperação do TAG 11:0 ou do EMAG 11:0. A porcentagem de recuperação é expressa pela razão entre o valor experimental pelo teórico multiplicada por cem e é obtida pela fórmula: Onde: m % Recuperação = C11. RC11. F. 100 A. C m 13 C11 m C13 = massa do padrão interno (mg) A C11 = área do pico do EMAG 11:0. R C11 = fator de resposta do EMAG 11:0 relativo ao EMAG 13:0 F = Fator de conversão de EMAG 11:0 para AG ou TAG (Tabela 18, Anexo 1) A C13 = área do pico do EMAG 13:0. m C11 = massa do EMAG ou TAG 11:0. Um ensaio adicional de recuperação foi realizado, empregando diferentes quantidades de gordura de leite, isto é: 50, 100, 150 e 200 mg, para avaliar o C13. A 112

113 desempenho do método de esterificação. Foram feitas três repetições para cada nível de concentração da amostra. Tabela 18. Fatores de conversão de EMAG para AG (f agi ) e TAG equivalente (f Tgi ). Ácido graxo Fatores de conversão EMAG AG f agi EMAG -TAG f Tgi 4:0 6:0 0,8627 0,8923 0,9868 0,9897 8:0 0,9114 0, :0 0,9247 0, :0 0,9300 0, :0 0,9346 0, :0 0,9386 0, :0 0,9421 0, :1 0,9417 0, :0 0,9453 0, :1 0,9449 0, :0 0,9481 0, :1 0,9477 0, :0 0,9507 0, :1 0,9503 0, :0 0,9530 0, :1 cis 0,9527 0, :1 trans 0,9527 0, : 2 cis 0,9524 0, :2 trans 0,9524 0, :3 cis 0,9520 0, :3 trans 0,9520 0, :4 0,9517 0, :0 0,9570 0, :1 0,9568 0, :2 0,9565 0, :3 n3 0,9562 0, :3 n6 0,9562 0, :4 0,9560 0, :5 0,9557 0, :0 0,9588 0, :0 0,9604 0, :1 0,9602 0, :2 0,9600 0, :6 0,9590 0, :0 0,9620 0, :0 0,9633 0, :1 0,9632 0,

114 6. Estudo estatístico As amostras foram analisadas com 5 repetições, visando a aplicação dos testes estatísticos. Foram calculados as médias, os desvios padrão e as porcentagens dos coeficientes de variação para GT e cada AG ou grupo de AG (AGS, AGP, AGT), a fim de avaliar a precisão dos métodos. Foram aplicados teste-t, ANOVA e teste de Tukey para verificar diferenças entre os procedimentos de determinação da GT, de metilação e de cálculo para quantificação dos AG (significância de 5%). A exatidão dos métodos foi avaliada por comparações dos valores de referência de GT e dos AG ou grupos de AG e os obtidos experimentalmente utilizando o índice z. Onde: Z = ( X X ) lab X lab = valor obtido pelo laboratório. X = valor designado (melhor estimativa do valor verdadeiro). σ = valor alvo para o desvio padrão (variável dependendo do material de referência e definido de acordo com a precisão requerida). σ Foram construídos gráficos para evidenciar as faixas de variação dos analitos e calculou-se o índice z (z-scores). A partir das repetições feitas para GT e os grupos de AGS, AGP, AGT foi criado um intervalo de confiança (95%). Plotou-se a média e os limites, superior e inferior, definidos anteriormente para GT, AGS, AGP e AGT. O valor de z=0 corresponde, nos gráficos, ao valor de referência (valor designado: consenso de ensaios de proficiência ou consenso de laboratórios especialistas). Valores entre -2<z<2 indicam desempenho satisfatório; 2<z<3, desempenho questionável e z> 3 ou z< -3, desempenho não satisfatório (Ayres et al., 2003; Tompson e Wood, 1993). 114

115 V. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise de desempenho dos métodos foi feita considerando os valores médios de referência dos diversos analitos, isto é: AG individuais, GT, AGS, AGP e AGT e os intervalos de variação aceitáveis, estabelecidos na avaliação estatística dos ensaios interlaboratoriais. Desta forma, para um melhor entendimento, algumas definições constam no ANEXO II. 1. Otimização das condições cromatográficas A escolha da programação cromatográfica foi definida pelos resultados da avaliação de desempenho da coluna na separação dos padrões de EMAG e de quantificação dos ácidos graxos nas amostras de referência de óleos e gorduras. A programação selecionada foi empregada na análise das amostras de alimentos Avaliação dos resultados da análise dos padrões de EMAG Foram considerados como parâmetros de desempenho da coluna o número de pratos teóricos e a resolução, para cada programação, obtidos na análise da mistura de 37 padrões de EMAG de 4 a 24 átomos de carbono e de isômeros cis/trans do 18:2 e 18:3. Foi utilizado como critério para selecionar as condições cromatográficas, uma resolução dos ésteres metílicos superior a 1,0, no caso da mistura com 37 componentes, sendo este o critério também indicado no método AOAC , revisado em Os parâmetros de desempenho obtidos na injeção da mistura certificada contendo 37 padrões de EMAG, para as programações cromatográficas dos métodos 1, 2 e 3, constam nas Tabelas 19, 20 e 21, respectivamente, e para as misturas de padrões de isômeros cis e trans dos ácidos graxos 18:2 e 18:3, constam nas Tabelas 22 e 23. As Figuras de 5 a 9 apresentam os cromatogramas obtidos das misturas anteriores citadas e analisadas pelos métodos 1, 2 e 3. Os melhores resultados foram observados empregando as programações dos métodos 1 e 3. Nestes métodos houve eluição dos 37 componentes declarados no certificado de composição da mistura de padrões. 115

116 A programação cromatográfica do método 1, aqui avaliada, foi baseada no trabalho de Kramer, Blackadar e Zhou (2002), no qual empregou-se coluna cromatográfica de 100 m com FE estacionária de ciano propil siloxana (CP Sil 88 de 100 m), similar a utilizada neste estudo, para separação de ácidos graxos de baixo peso molecular, isômeros cis/trans, inclusive CLA, em gordura de leite de vaca. No presente trabalho, pela programação do método 1, obtevese valores de número de pratos teóricos e resolução superiores a e 1,5, respectivamente, na separação dos 37 padrões de EMAG. Para o par crítico 18:3 (9c12c15c)/20:1(11c) e o trio adjacente 22:1, 20:3 e 20:4 a resolução foi superior a 1,0 (Figura 5 e Tabela 19). A programação cromatográfica do método 2, foi considerada para comparação neste estudo, pois foi demonstrado que na análise de ácidos graxos de GVPH e de animais ruminantes em coluna SP 2560, empregando temperaturas ao redor 190 C, ocorre a separação do grup o de isômeros 18:1 13t, 14t + 6-8c do isômero majoritário 18:1 9c (Ratnayake, 2004). Pela programação do método 2, no presente trabalho, obteve-se eluição de 34 componentes dos 37 apresentados no certificado da mistura de padrões, tendo ocorrido co-eluição de componentes, isto é 14:0 e 14:1; 15:0 e 15:1 e 24:0 e 20:5. A resolução e o número de pratos teóricos foram menores que as obtidas pelas programações dos métodos 1 e 3 (Figura 6 e Tabela 20). Quanto a eluição dos isômeros cis/trans 18:2 e 18:3, os métodos cromatográficos promoveram a resolução dos primeiros isômeros, entretanto, nenhuma das programações propiciou a resolução completa para os isômeros cis/trans do 18:3 (Figuras 8 e 9; Tabelas 22 e 23). Observou-se, pela programação do método 2, co-eluição parcial de um dos isômeros cis/trans 18:3 (9t,12c,15c) com o 20:1. Os tempos de retenção destes dois AG foram muito próximos quando analisados separadamente, como pode ser observado nas Tabelas 20 e 23. A programação do método 2 pode ser empregada na análise de óleos e gorduras vegetais, os quais não contêm AG 14:1; 15:1 e 20:5, sendo que estes ácidos são encontrados normalmente em óleos de origem animal (Carpenter, Ngeh-Ngwainbi, Lee, 1993). Comparando o tempo de eluição do ácido graxo 24:0, o qual é o último componente normalmente eluído numa análise de ácidos graxos de óleos vegetais, verificou-se que pela programação do método 116

117 2, o tempo gasto é inferior ao obtido na análise pelas outras duas programações, isto é, para o método 2 a eluição ocorre em 45,5 min, enquanto pelo método 1 em 57,6 min e pelo método 3 em 62,2 min (Tabelas 19, 20, 21). Apesar da programação do método 2 permitir uma análise mais rápida do que a realizada nas condições cromatográficas dos métodos 1 e 3, a quantificação dos AGT nos óleos vegetais fica comprometida. As condições cromatográficas do método 3 são as estabelecidas no método oficial AOCS Ce1h 05 (2005). Este método foi desenvolvido por um grupo de especialistas de indústrias e laboratórios do Estados Unidos com o apoio do Food and Drug Administration (FDA) e do Ministério da Saúde do Canadá. Está no campo de aplicação do método, a determinação de ácidos graxos cis/trans em amostras de GVPH e em óleos vegetais refinados, não sendo indicado para a determinação daqueles ácidos graxos em outras gorduras como a de animais ruminantes. O padrão interno empregado para a quantificação dos AG no método oficial é um TAG 21:0, cujo EMAG elui na região dos isômeros CLA do 18:2, podendo interferir na quantificação dos mesmos. Verificou-se que, por intermédio da programação cromatográfica do método 3, a resolução dos picos adjacentes 22:1, 20:3 e 20:4 foi inferior a 1,0 (Tabela 21). Estes ácidos graxos são encontrados normalmente em gordura de origem animal. Empregando o método 3 observou-se valores menores de resolução e de número de pratos teóricos na análise dos componentes quando comparados ao método 1 mas superiores ao método 2 (Tabelas 19, 20, 21). A Tabela 24 apresenta diversos parâmetros obtidos na análise pelo método 1 da mistura dos 37 padrões de EMAG. Por esta programação, verificou-se a possibilidade de resolução de outros EMAG, inclusive na forma trans, como ácido trans vacênico 18:1 (11t); ácido octadecenóico 18:1 (7c); 18:1 (11c) e ácido linoléico conjugado 18:2 (9c,11t) e 18:2(10t,12c) (Tabela 25). Observa-se na Tabela 19 que o componente 22, que é o ácido gama-linolênico, e na Tabela 23 o componente 5 (18:3 (9c,12t,15c)) (método 1), eluem em tempos de retenção muito próximos. Entretanto, estes componetes estão presentes, normalmente, em quantidades muito pequenas nas gorduras ou óleos vegetais refinados. A programação do método 1 permite a análise da gordura de um número mais amplo de matrizes, principalmente gordura de produtos lácteos ricas em ácidos graxos de baixo peso molecular. 117

118 Figura 5. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo o método 1 de programação cromatográfica. 118

119 Figura 6. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo método 2 de programação cromatográfica. Figura 7. Cromatograma obtido pela análise por CG-DIC da mistura de 37 padrões certificados de EMAG pelo método 3 de programação cromatográfica. 119

120 Figura 8. Cromatogramas obtidos pela análise por CG-DIC da mistura de padrões de EMAG isômeros cis/trans 18:2. Programações cromatográficas: A) Método1. B) Método 2. C) Método 3. Figura 9. Cromatogramas obtidos pela análise por CG-DIC da mistura de padrões de EMAG isômeros cis/trans 18:3. Programações cromatográficas: A) Método 1. B) Método 2. C) Método

121 Tabela 19. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões EMAG empregando as condições cromatográficas do método 1. Nº do pico Tempo de retenção AG Nº de pratos teóricos Resolução 01 10,196 4: ,578 6: ,322 8: ,560 10: ,625 11: ,735 12: ,953 13: ,359 14: ,837 14:1 (9c) ,035 15: ,855 15:1 (10c) ,114 16: ,999 16:1 (7c) ,714 17: ,086 17: ,071 18: ,857 18:1 (9t) ,662 18:1 (9c) ,220 18:2 (9t,12t) ,363 18:2 (9c,12c) ,839 20: ,000 18:3 (6c,9c,12c) ,543 20: ,749 18:3 (9c,12c,15c) ,253 21: ,172 20:2 (11c,14c) ,820 22: ,442 20:3 (8c,11c,14c) ,655 22:1 (13c) ,777 20:3 (11c,14c,17c) ,178 20:4 (5c,8c,11c,14c) ,078 23: ,840 22:2 (13c,16c) ,230 20:5(5c,8c,11c,14c,17c) ,617 24: ,733 24: ,300 22:6(4c,7c,10c,13c,16c,19c)

122 Tabela 20. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões EMAG empregando as condições cromatográficas do método 2. N Tempo de N pratos AG pico retenção teóricos Resolução 01 10,544 4: ,732 6: , ,030 8: , ,518 10: , ,867 11: , ,314 12: , ,885 13: , ,615 14:0 + 14:1 (9c) , ,557 15:0 + 15:1 (10c) , ,745 16: , ,027 16:1 (9c) , ,268 17: , ,873 17: , ,225 18: , ,415 18:1 (9t) , ,993 18:1 (9c) , ,468 18:2 (9t,12t) , ,001 18:2 (9c,12c) , ,947 20: , ,727 18:3 (6c,9c,12c) , ,608 20: , ,361 18:3 (9c,12c,15c) , ,062 21: , ,337 20:2 (11c,14c) , ,405 22: , ,514 20:3 (8c,11c,14c) , ,431 22:1 (13c) , ,128 20:3 (11c,14c,17c) , ,161 20:4 (5c,8c,11c,14c) , ,957 23: , ,436 22:2 (13c,16c) , ,509 20:5(5c,8c,11c,14c,17c) ,86 24: ,439 24: , ,023 2:6(4c,7c,10c,13c,16c,19c) ,15 122

123 Tabela 21. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100 m, para separação da mistura de 37 padrões EMAG empregando as condições cromatográficas do método 3. Nº do pico Tempo de retenção AG Nº de pratos teóricos Resolução 01 8,052 4: ,240 6: , ,552 8: , ,082 10: , ,475 11: , ,986 12: , ,654 13: , ,527 14: , ,597 14:1 (9c) , ,668 15: , ,043 15:1 (10c) , ,165 16: , ,639 16:1 (9c) , ,123 17: , ,990 17: , ,697 18: , ,099 18:1 (9t) , ,758 18:1 (9c) , ,679 18:2 (9t,12t) , ,454 18:2 (9c,12c) , ,536 20: ,789 18:3 (6c,9c,12c) ,708 20: , ,920 18:3 (9c,12c,15c) , ,407 21: , ,724 20:2 (11c,14c) , ,219 22: , ,949 20:3 (8c,11c,14c) , ,560 22:1 (13c) , ,103 20:3 (11c,14c,17c) , ,512 20:4 (5c,8c,11c,14c) , ,517 23: , ,847 22:2 (13c,16c) , ,749 20:5(5c,8c,11c,14c,17c) , ,210 24: , ,486 24: , ,267 22:6(4c,7c,10c,13c,16c,19c) ,93 123

124 Tabela 22. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100m, para o padrão de mistura de isômeros cis/trans de EMAG 18:2, empregando as condições cromatográficas dos métodos 1,2 e 3. Nº do pico Tempo de retenção Pratos teóricos Resolução Ácido Graxo Método 1 Método 2 Método 3 Método 1 Método 2 Método 3 Método 1 Método 2 Método ,252 22,344 22,83 C 18:2 (9t,12t) ,275 23,102 23,695 C 18:2 (9c,12t) ,57 4,97 1, ,734 23,369 24,049 C 18:2 (9t,12c) ,59 1,78 0, ,343 23,862 24,574 C 18:2 (9c,12c) ,4 3,12 3,13 Tabela 23. Resultados do desempenho da coluna SP 2560 de 100m, para o padrão de mistura de isômeros cis/trans de EMAG 18:3, empregando as condições cromatográficas dos Métodos 1,2 e 3. N º do pico T em po de retenção P ratos teóricos R e solução M étodo M étodo M étodo A G M étodo M étodo M étodo M étodo M étodo ,716 25,087 26,268 18:3 ( 9t,12t, 1 5t) ,746 26,080 27,385 18:3 (9t,1 2t, 15c) ,36 1, ,810 26,487 27,450 18:3 (9t,1 2c, 15t) ,07 0, ,065 26,630 27,990 18:3 ctt + cct(9,1 2,1 5) ,25 0,28 1, ,279 27,380 28,985 18:3 (9c,1 2t, 15c) ,18 1,40 4, ,236 27,518 29,192 C 1 8:3 ( 9t,1 2c, 15c) ,15 0,57 1,01 M étodo ,689 27,948 29,839 C 1 8:3 (9 c,12c, 15c) ,15 1,64 1,34 124

125 Tabela 24. Parâmetros cromatográficos obtidos na análise de padrões de EMAG graxos, empregando a programação cromatográfica do método 1. Componente AG Tempo de retenção 125 Tempo de retenção relativo ao 13:0 Fator resposta DIC teórico relativo ao 16:0 Fator resposta DIC experimental relativo ao 13:0 Média (n=3) 1 4:0 10,196 1,51 1,746 13,5 2 6:0 13,578 0,618 1,284 1,304 5,11 3 8:0 16,322 0,747 1,17 1,12 3, :0 18,56 0,845 1,102 1,098 1, :0 19,625 0,893 1,077 1,032 2, : ,944 1,057 1,017 1, : , : ,064 1,024 0,992 2, :1 (9c) ,131 1,016 1,046 1, : ,14 1,011 1,007 4, :1 (10c) ,223 1,003 1,025 4, : , ,02 1, :1 (9c) ,32 0,993 1,061 1, : ,353 0,990 1,111 4, : ,461 0,983 1,058 4, : ,506 0,981 0,981 2, :1 (9t) ,587 0,974 0,976 2, :1 (9c) ,624 0,974 0,986 3, :2 (9t,12t) ,74 0,968 0,973 2, :2 (9c,12c) ,838 0,968 1,121 3, : ,951 0,966 1,063 3, :3 (6c,9c,12c) ,004 0,961 1,180 6, : ,074 0,96 1,130 3, :3 (9c,12c,15c) ,083 0,961 1,180 1, : ,152 0,959 1,070 5, :2 (11c,14c) ,239 0,955 1,070 5, : ,314 0,954 1,040 3, :3 (8c,11c,14c) ,343 0,948 1,130 2, :1 (13c) ,398 0,948 1,135 4, :3 (11c,14c,17c) ,404 0,948 1,069 3, :4 (5c,8c,11c,14c) ,422 0,942 1,104 4, : ,463 0,948 1,073 3, :2 (13c,16c) ,543 0,943 1,146 3, :5(5c,8c,11c,14c,17c) ,606 0,942 1,076 4, : ,624 0,943 1,054 4, : ,729 0,938 1,102 5, :6 (4c,7c,10c,13c,16c,19c) CV (%) ,111 0,921 1,021 1,08

126 Tabela 25. Parâmetros cromatográficos obtidos na análise de padrões individuais de EMAG, empregando a programação cromatográfica do método 1*. AG Tempo de retenção Tempo de retenção relativo ao 13:0 Fator resposta DIC teórico relativo ao 16:0 Fator resposta DIC experimental em relação ao 13:0 16:1 (7t) 28,414 1,294 0,993 1,061 18:1 (11 t) 35,174 1,602 0,974 0,949 18:1 (7c)* 35,471 1,613 0,974 0,976 18:1 (11c) 36,163 1,647 0,974 0,976 18:1 (12c)* 36,453 1,657 0,974 0,976 18:2 (9c,12t)* 39,275 1,789 0,968 1,121 18:2 (9t,12c)* 39,734 1,810 0,968 1,121 18:3 (9t,12t,15c)* 43,746 1,993 0,961 1,180 18:3 ( 9t,12c,15t)* 43,810 1,996 0,961 1,180 18:3 (6c,9c,12c) 44,001 2,004 0,961 1,180 18:3 ctt + cct ( 9,12,15)* 44,279 2,017 0,961 1,180 18:3 ( 9c,12t,15c)* 44,065 2,007 0,961 1,180 18:3 ( 9t,12c,15c)* 45,236 2,061 0,961 1,180 18:3 (9c,12c,15c) 45,749 2,084 0,961 1,180 18:2 9c, 11t (CLA)* 46,585 2,122 0,968 1,121 18:2 10t, 12c (CLA)* 47,215 2,151 0,968 1,121 *Foram empregados os mesmos fatores de resposta do DIC dos isômeros do ácido graxo calibrado na configuração cis Avaliação dos resultados da análise de amostras de referência de óleos e gorduras. Por intermédio das análises das amostras de referência de óleo (COI 28/05) e GVPH (FAPAS 27/04) foram avaliados os dois métodos de preparação dos EMAG e as três programações cromatográficas. Os valores do índice z foram calculados, para os AG de referência, a partir dos parâmetros obtidos dos respectivos ensaios interlaboratoriais, sendo que os valores designados e alvos do desvio padrão, ou intervalo de variação aceitável (ANEXO II), encontram-se na Tabela

127 Tabela 26. Valores designados e alvos do desvio padrão para alguns ácidos graxos das amostras de referência de óleo vegetal (COI 28/05) e GVPH (FAPAS 27/04). Amostra AG COI28/05 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 22:0 18:1trans 18:2 + 18:3 trans FAPAS 27/04 18:1trans 18:2trans Total trans X (valor designado) 10,06 0,77 3,51 75,70 7,63 1,39 0,40 0,29 0,13 0,0175 0,2235 7,89 0,670 8,91 σ valor alvo do desvio padrão 0,12* 0,07* 0,15* 0,84* 0,22* 0,15* 0,04* 0,04* 0,04* 0,018* 0,035* 0,395 ** 0,221*** 0,446** n = número de laboratórios * Valores correspondentes a 3 S R do estudo interlaboratorial. ** Valores correspondentes a 5 % X (AOAC , 1984). *** Valores correspondentes a 33% X (Buchgraber e Ulberth, 2002). n As Tabelas de apresentam média, desvios padrão e as porcentagens do coeficiente de variação da repetitividade (CV r %) para os teores de ácidos graxos, obtidos para as amostras de referência, além do valor de p do estudo de comparação dos métodos de metilação. Valores de p < 0,05 indicaram diferença significativa entre os métodos de preparação dos ésteres metílicos. As tabelas apresentam também os valores de referência dos ácidos graxos e faixas de variação aceitáveis, as quais foram estabelecidas a partir dos resultados estatísticos do estudo interlaboratorial. Os resultados obtidos para os AG de referência mostraram que as três programações cromatográficas forneceram resultados satisfatórios, dentro das faixas aceitáveis para os componentes. Entretanto, os melhores resultados foram obtidos empregando as programações cromatográficas dos métodos 1 e em seguida do método 3. As Figuras de 10 a 13 mostram que os valores obtidos experimentalmente situaram-se, na maioria dos casos, na faixa de ± 2 do índice z, principalmente quando foi empregada a programação do método 1, indicando desempenho satisfatório na determinação dos ácidos graxos pelos métodos cromatográficos propostos e de preparação de ésteres metílicos. 127

128 Quando empregou-se a programação do método 2, na análise da amostra de óleo vegetal (COI 28/05), verificou-se que a soma dos AGT situou-se no limite inferior de aceitação dos valores de referência (z=-2). Tais resultados ocorreram devido a sobreposição parcial de um dos isômeros cis/trans do EMAG 18:3 (9t,12c,15c) com o 20:1, afetando a soma dos AGT. Nota-se na Tabela 28 e Figura 11 que os valores obtidos para o AG 20:1 foram mais altos do que pelos outros dois métodos (Figuras 10 e 12). A programação do método 2 não é adequada para a quantificação dos AGT dos óleos vegetais refinados pois o conteúdo dos isômeros cis/trans do 18:3, cuja presença é importante na avaliação da qualidade do produto, foi subestimado. Um resultado obtido empregando esta programação pode fornecer uma avaliação equivocada do produto e comprometer até mesmo transações comerciais. As Figuras de 14 a 16 apresentam os cromatogramas dos EMAG obtidos para as amostras de referência de óleos e gorduras pelas diferentes programações cromatográficas. Para a escolha do método cromatográfico, também foi avaliada a separação dos isômeros cis/trans do 18:1 na GVPH de referência (FAPAS 27) empregando os três métodos cromatográficos (Figura 16). Os métodos 1 e 3 apresentaram boa resolução dos diversos isômeros do 18:1. Entretanto, não foi obtida resolução até a linha de base entre o grupo de isômeros 18:1 13t,14t + 6-8c e o isômero majoritário 18:1 9c, para as três programações. Esta região é uma das mais complexas para separação e otimização da análise dos isômeros cis/trans em GVPH e gorduras de animais ruminantes (Ratnayake, Hansen, Kennedy, 2006). A identificação foi feita com padrões de EMAG disponíveis e por comparação com cromatogramas obtidos nas mesmas condições em trabalhos da literatura (Kramer, Blackadar, Zhou, 2002; Ratnayake, Hansen, Kennedy, 2006). Com relação à análise da amostra de GVPH, empregando a programação do método 2, as concentrações dos isômeros trans 18:1 foram mais altas aproximando-se do limite superior de variação aceitável do estudo interlaboratórial (z=2) (Tabela 31 e Figura 13). Estes valores foram obtidos, provalmente, em decorrência de uma separação mais bem definida do grupo de isômeros 18:1 (13t,14t + 6-8c) do majoritário 18:1 9c, a qual ocorre em 128

129 temperaturas ao redor de 190 C na coluna SP 2560 (Fi gura 16B) (Ratnayake, 2004). Destaillats at al. (2007) têm demonstrado que a análise direta por CG/DIC, em coluna similar a utilizada no presente trabalho, isto é CP Sil 88 de 100 m, pode ser otimizada para a determinação do teor total de isômeros trans 18:1, especialmente o trans vacênico, em gordura de animais ruminantes, fornecendo resultados similares ao das técnicas com separação prévia dos isômeros por CCD ou CLAE com íon prata. Com relação aos métodos de preparação dos EMAG, observou-se que para os métodos IUPAC (1987) e Hartman e Lago (1973) modificados, as %CV r foram comparáveis (menor que 5%), para a maioria dos ácidos graxos com concentração acima de 1%. Para os ácidos graxos com menos de 1% de concentração os valores de %CVr foram inferiores a 10%, com exceção feita aos ácidos graxos trans e para alguns ácidos graxos com menos de 1%, os quais apresentaram %CV superiores a 20% (Tabelas 27 e 32). A etapa de preparação dos EMAG pode ser um dos fatores de variação nos valores obtidos para composição de ácidos graxos na gordura dos alimentos. Os procedimentos oficiais recomendados pela AOAC e AOCS empregam como catalisador BF 3, que é tóxico, instável e pode formar produtos secundários, além da reação ocorrer com aquecimento (Christie, 1993). Um procedimento amplamente adotado no Brasil emprega a metodologia de Hartman e Lago (1973) modificado por Maia e Rodrigues (1993), e não utiliza catalisador tóxico ocorrendo a reação em condições mais amenas de temperatura, além de ser um procedimento misto que emprega meio básico e ácido, para o qual não há restrições quanto as matrizes de gordura (Christie, 1999; Kramer et al., 1997). Neste processo ocorre a formação rápida de cloreto de hidrogênio metanólico pela adição de cloreto de amônia e ácido sulfúrico ao metanol (Hartman e Lago, 1973). Verificou-se que o método IUPAC que emprega KOH metanólico como reagente (IUPAC,1987; ISO 5508, 1990), no caso da análise dos AGP da amostra de óleo vegetal COI 28/05, forneceu teores mais elevados destes ácidos graxos, principalmente do 18:2, e mais próximos da média de referência quando comparados ao valores obtidos empregando a metilação segundo Hartman e Lago (1973) (Tabelas 27, 28 e 29 e Figuras 10, 11 e 12). Em alguns 129

130 casos houve diferença significativa entre os valores obtidos (p<0,05) (Tabelas 27, 28). Os resultados indicam que o procedimento a frio do método IUPAC colaborou para preservar aqueles AGP. Entretanto, este método apresenta restrições para sua aplicação na análise da gordura dos alimentos, pois não esterifica ácidos graxos livres, pode levar a formação destes ácidos graxos por hidrólise e não pode ser empregado em amostras com teor de acidez elevado (Christie, 1993; Christopherson e Glass, 1969; Kramer et al., 1997). Por outro lado, para amostras de óleos vegetais refinados, que contêm essencialmente triacilgliceróis e são praticamente isentas de ácidos graxos livres, fosfolipídios e outros lipídios polares, a transesterificação alcalina tem sido recomendada devido a simplicidade e rapidez (Christoferson e Glass, 1969; Ratnayake, 2004). Considerando os resultados satisfatórios obtidos pelos dois procedimentos de preparação de ésteres metilicos, optamos pelo método de Hartman e Lago modificado para dar continuidade ao estudo nas amostras de alimentos. As condições cromatográficas foram otimizadas considerando a programação do método 1. Tais condições foram escolhidas para o prosseguimento das análises de ácidos graxos na gordura dos alimentos, pois além do estudo estatístico indicar resultados satisfatórios com as amostras de referência de óleos e gorduras, a programação permitiu a resolução de todos os 37 componentes da mistura padrão dos ésteres metílicos e também proporcionou bons resultados para separação dos padrões de misturas cis e trans dos ácidos graxos 18:2 e 18:3. Cabe ressaltar, entretanto, que o tempo de uso da coluna cromatográfica ou a utilização de colunas com FE similares ou da mesma especificação, mas de lotes diferentes, além da variada concentração dos AG na gordura dos alimentos, pode resultar em desempenho diversificado na separação de componetes, como por exemplo dos isômeros 18:3 n-3 ou n-6 e 20:1. Portanto, a utilização de materiais com valores de referência dos analitos, de forma rotineira nos laboratórios, é de fundamental importância para os ajustes que devem ser implementados na programação cromatográfica, para a determinação dos AG nos diferentes tipos de alimentos. Considerando a programação cromatográfica do método 1, a resposta do detector de ionização de chama foi otimizada pelo cálculo de fatores experimentais de correção de resposta. Estes foram obtidos pela análise das 130

131 soluções de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos individuais e da solução de mistura de padrões de EMAG 4:0 a 24:0. Além dos fatores experimentais, foram calculados fatores teóricos de correção de resposta do DIC (Tabelas 24 e 25). Para a determinação dos AG nas amostras de alimentos, a correção foi feita com fatores experimentais com relação ao EMAG 13:0 conforme descrito no método AOAC (2001). 131

132 Tabela 27. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 1 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metilicos. H&L (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 10,17 0,74 3,45 75,9 7,37 1,35 0,383 0,26 0,122 0,011 0,226 S r 0,17 0,02 0,03 0,20 0,07 0,02 0,009 0,01 0,007 0,004 0,010 CVr (%) 1,63 2,18 0,89 0,26 0,95 1,18 2,34 2,40 5,74 34,31 4,62 p 0,073 0,321 0,242 0,169 0,014 0,423 0,865 0,569 0,808 0,492 0,378 IUPAC (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 9,94 0,73 3,38 76,14 7,48 1,36 0,38 0,26 0,12 0,012 0,232 S r 0,19 0,02 0,03 0,24 0,07 0,03 0,02 0,02 0,01 0,003 0,008 CVr (%) 1,92 2,92 0,97 0,31 0,88 1,98 4,32 6,28 8,47 21,93 3,51 Valor de Referência 10,06 0,77 3,51 75,7 7,63 1,39 0,4 0,29 0,13 0,0175 0,2235 intervalo de variação aceitável 3S R 0,54 0,07 0,15 0,84 0,22 0,15 0,04 0,04 0,04 0,018 0,035 p < 0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão da repetitividade. n: número de repetições. CVr:coeficiente de variação da repetitividade (%). S R : desvio padrão da reprodutibilidade. σ = 3S R. 132

133 Tabela 28. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 2 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos. H&L (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 9,87 0,71 3,39 76,48 7,35 1,19 0,382 0,332 0,12 0,015 0,153 S r 0,12 0,01 0,02 0,15 0,02 0,02 0,005 0,017 0,01 0,005 0,014 CVr (%) 1,21 1,78 0,53 0,20 0,29 1,67 1,24 5,12 8,40 28,00 8,98 p 0,038 0,033 0,959 0,001 0,0004 0,0001 0,163 0,701 0,163 0,713 0,003 IUPAC (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 10,25 0,76 3,38 75,88 7,47 1,28 0,36 0,33 0,108 0,016 0,189 S r 0,19 0,02 0,05 0,19 0,03 0,02 0,02 0,02 0,009 0,002 0,012 CVr (%) 1,83 2,52 1,38 0,25 0,45 1,5 6,17 5,22 8,33 10,9 6,35 Valor de Referência 10,06 0,77 3,51 75,7 7,63 1,39 0,4 0,29 0,13 0,0175 0,2235 Intervalo de variação aceitável 3 S R 0,54 0,07 0,15 0,84 0,22 0,15 0,04 0,04 0,04 0,018 0,035 p < 0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão da repetitividade. n: número de repetições. CVr:coeficiente de variação da repetitividade (%). S R : desvio padrão da reprodutibilidade. σ = 3S R. 133

134 Tabela 29. Composição de ácidos graxos obtida da amostra de referência de óleo vegetal COI 28/05 pelo método 3 de programação cromatográfica, valores de referência dos AG e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos. H&L (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 10,01 0,73 3,51 76,0 7,47 1,34 0,391 0,272 0,122 0,020 0,201 S r 0,08 0,01 0,02 0,10 0,07 0,02 0,006 0,009 0,008 0,006 0,008 CVr (%) 0,79 1,21 0,59 0,21 0,87 1,51 1,53 3,31 6,56 30,77 3,76 p 0,002 0,901 0,119 0,148 0,885 0,459 0,125 0,678 0,710 0,238 0,093 IUPAC (n=5) C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 c C 18:2 c C 18:3 c C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 18:1 t C 18:2 t + C 18:3 t Média 9,89 0,73 3,49 76,0 7,49 1,34 0,388 0,272 0,122 0,015 0,215 S r 0,04 0,02 0,02 0,23 0,07 0,02 0,01 0,009 0,007 0,006 0,014 CVr (%) 0,40 2,58 0,58 0,30 0,94 1,25 2,57 3,30 5,73 36,73 6,52 Valor de Referência 10,06 0,77 3,51 75,7 7,63 1,39 0,4 0,29 0,13 0,0175 0,2235 Intervalo de variação aceitável 3 S R 0,54 0,07 0,15 0,84 0,22 0,15 0,04 0,04 0,04 0,018 0,035 p < 0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão da repetitividade. n: número de repetições. CVr:coeficiente de variação da repetitividade (%). S R : desvio padrão da reprodutibilidade. σ = 3S R. 134

135 Tabela 30. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 1 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC 2301 e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues- Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos. IUPAC (n=5) C 18:1 t C 18:2 t C 18:3 t Trans total Média 8,00 0,72 0,19 8,90 S r 0,12 0,10 0,03 0,19 CV r (%) 1,50 13,8 15,79 2,14 p 0,25 0,22 0,07 0,25 H&L (n=5) Média 7,90 0,67 0,22 8,78 S r 0,18 0,02 0,01 0,15 CV r (%) 2,38 3,32 4,54 1,69 Valor de Referência 7,89 0,67-8,91 Intervalo de variação aceitável σ 0,395 0,221 0,446 p < 0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão. CVr: coeficiente de variação da repetitividade (%). σ: valor alvo do desvio-padrão. n: número de repetições. 135

136 Tabela 31. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 2 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya (H&L)]; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos. IUPAC (n=5) C 18:1 t C 18:2 t C 18:3 t Trans total Média 8,64 0,83 0,11 9,48 S r 0,17 0,03 0,03 0,16 CV r (%) 1,97 3,13 23,28 1,63 p 0,21 0,95 0,55 0,28 H&L (n=5) C 18:1 t C 18:2 t C 18:3 t Trans total Média 8,55 0,82 0,10 9,47 S r 0,20 0,08 0,02 0,23 CV r (%) 2,14 10,13 23,16 2,44 Valor de referência 7,89 0,67-8,91 Intervalo de variação aceitável σ 0,395 0,221 0,446 p <0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão. CV r: coeficiente de variação da repetitividade (%). σ: valor alvo do desvio-padrão. n: número de repetições. 136

137 Tabela 32.. Composição dos ácidos graxos da amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 obtida pelo método 3 de programação cromatográfica, valores de referência dos AGT e de p do teste-t para comparação de dois procedimentos de metilação [IUPAC e Hartman e Lago modificado por Maia e Rodrigues-Amaya; valores expressos em % p/p de ésteres metílicos. IUPAC (n=5) C 18:1 t C 18:2 t C 18:3 t Trans total Média 8,45 0,70 0,21 9,28 S r 0,07 0,04 0,01 0,07 CVr (%) 0,83 5,10 4,78 0,74 p 0,93 0,45 0,07 H&L (n=5) Média 8,55 0,69 0,19 9,54 S r 0,20 0,02 0,04 0,25 CVr (%) 2,30 2,70 19,9 2,59 Valor de Referência 7,89 0,67-8,91 Intervalo de variação aceitável σ 0,395 0,221 0,446 p < 0,05 diferença significativa, intervalo de confiança de 95%. S r : desvio padrão. CV r : coeficiente de variação da repetitividade (%). σ: valor alvo do desvio padrão. n: número de repetições. 137

138 A z escore - Coi metilação H&L- Método Z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1T C18:2+C18:3T B z escore - Coi metilação IUPAC- Método z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1T C18:2T+C18:3T Figura 10. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelos métodos de metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método

139 A 3 z score - Coi28-05 metilação H&L - Método z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1t C18:2+C18:3t B z score - Coi metilação IUPAC - Método z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1T C18:2T+C18:3T Figura 11. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelo método metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método

140 A 3 z escore - Coi metilação H&L- Método z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1T C18:2T+C18:3T B 3 z escore - Coi metilação IUPAC - Método z C16:0 C16:1 C18:0 C18:1C C18:2C C18:3C C20:0 C20:1 C22:0 C18:1T C18:2T+C18:3T Figura 12. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos da amostra COI 28/05 analisada pelo método metilação: A) Hartman e Lago (H&L) e B) IUPAC 2.301, empregando a programação cromatográfica do método

141 A z score - FAPAS 27 - Método z IUPAC H&L IUPAC H&L IUPAC H&L C18:1T C18:2T SomaT B 4 z score - FAPAS 27 - Método z IUPAC H&L IUPAC H&L IUPAC H&L C 4 z score - FAPAS 27 - Método 3 z IUPAC H&L IUPAC H&L IUPAC H&L C18:1T C18:2T SomaT 141

142 Figura 13. Representação gráfica do índice z-score com relação aos valores de referência de ácidos graxos trans (18:1, 18:2 e soma dos trans (Soma T)) para a amostra de referência de GVPH FAPAS 27/04 analisada por dois métodos de metilação (Hartman e Lago e IUPAC 2.301) empregando as programações cromatográficas dos métodos: A) Método1; B) Método 2 e C) Método 3. Figura 14. Cromatogramas obtidos pela separação de EMAG por CG-DIC de uma mistura de óleos vegetais, amostra de referência COI 28/05, em coluna capilar de 142