Figura 1. Estrutura de lipídeos. Fonte: Fahy, E e col. (2005) A comprehensive classification system for lipids, J. Lipid Res., 46,

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1 LABORATÓRIO 2: ANÁLISE DE LIPÍDEOS I. Fundamentos Lipídeos em amostras biológicas Os lipídeos constituem uma classe heterogênea de moléculas que tem em comum o fato de serem pouco solúveis em água. A estrutura das principais classes de lipídeos encontrados em organismos vivos está mostrada na Figura 1. Figura 1. Estrutura de lipídeos. Fonte: Fahy, E e col. (2005) A comprehensive classification system for lipids, J. Lipid Res., 46, Estes podem ser classificados de acordo com a polaridade em lipídeos simples ou neutros e lipídeos complexos ou polares. Os lipídeos simples ou neutros incluem os ácidos graxos, colesterol, ésteres de colesterol e triacilgliceróis. Os lipídeos polares incluem os glicerofosfolipídeos, os esfingolipídeos e os glicolipídeos. 1

2 Extração de Lipídeos Os lipídeos por definição constituem uma classe de compostos que se caracterizam pela alta solubilidade em solventes orgânicos. A baixa solubilidade dos lipídeos em água torna possível a sua separação das proteínas, carboidratos, ácidos nucleios e da água nos tecidos. Existem diversos procedimentos para extração de lipídeos, porém todos têm em comum a utilização de solventes orgânicos. Os procedimentos mais utilizados incluem as metodologias de extração em que se empregam misturas de solventes orgânicos apolares e polares. As misturas de solventes orgânicos mais utilizados para esta finalidade são: clorofórmio: metanol (Métodos de Folch e Bligh & Dyer) ou hexano:isopropanol (Método de Dole) ou hexano:éter. Atualmente, ambos os métodos são bastante utilizados. No entanto, uma desvantagem das metodologia em que se utiliza o clorofórmio é o fato dele ser mais denso e a fase orgânica estar localizada na parte inferior do tubo (Figura 2a). Isto torna a recuperação da fase orgânica propensa a contaminações provenientes da fase aquosa o que pode comprometer a qualidade da análise. Deste modo, metodologias de extração utilizando solventes orgânicos menos densos do que água, como o hexano é mais vantajoso (Figura 2b). Porém a eficiência de extração de alguns lipídeos é menor utilizando-se este solvente. A extração dos lipídeos de amostras biológicas normalmente é realizada seguindo-se os seguintes passos: a) preparo da amostra, no caso de tecidos animais, faz-se uma homogeneização do material biológico em solução aquosa tamponada; b) homogeneização da amostra na presença de um solvente orgânico miscível com a água, por exemplo, metanol ou etanol; c) separação das fases líquida (orgânica e aquosa) e sólida, utilizando um solvente orgânico imiscível com a água, por exemplo, clorofórmio ou hexano; d) separação de contaminantes não lipídicos; e) remoção do solvente. Resíduo insolúvel Aq. Org. Hexano Org. Aq. Clorofórmio Resíduo insolúvel (a) (b) Figura 2. Esquema ilustrativo da extração de lipídeos utilizando mistura de solventes orgânicos mais densos (a) e menos densos (b) do que a água. Abreviatura: Aq., aquoso e Org., orgânico. 2

3 II. Objetivos Extrair lipídeos a partir de amostras biológicas (gema de ovo, manteiga our margarina e homogenato de fígado) e analisar as diferentes classes de lipídeos presentes na amostra através da cromatografia em camada delgada (TLC, thin layer chromatography). III. Procedimento Experimental 1. Extração de lipídeos A.1 Gema de Ovo a. Pesar 1 g da gema em um tubo de ensaio. b. Acrescentar 1 ml de etanol e vortexar até obter uma solução homogênea c. Adicionar 3 ml de hexano e 2 ml de isopropanol d. Vortexar vigorosamente por aproximadamente 1 minuto. e. Deixar o tubo na bancada até que haja a formação nítida de duas fases f. Transferir a fase superior orgânica para outro tubo A.2 Manteiga ou margarina a. Pesar 0,5 g de manteiga ou margarina em um tubo de ensaio. b. Extrair os lipídeos seguindo o procedimento descrito acima (a partir do item b até o e) c. Transferir a fase superior orgânica para outro tubo A.3 Fígado a. Pipetar 1 ml de homogenato de fígado em um tubo de ensaio b. Extrair os lipídeos seguindo o procedimento descrito acima (a partir do item b até o e) c. Transferir a fase superior orgânica para outro tubo 3

4 2. Separação dos lipídeos por cromatografia em camada delgada (TLC) a. Preparar um total de 2 placas de acordo com as dimensões especificadas na Figura 3. Dimensões da placa 8 x 10 cm. b. Fazer as seguintes marcações na placa com um LÁPIS tomando o cuidado para não remover a camada branca de sílica que recobre o alumínio: -linha onde serão aplicadas as amostras -linha indicadora do final da corrida do solvente -pontos onde serão aplicadas as amostras: deixar um espaço de 1 cm entre os pontos e identificar como mostrado na Figura 3. c. Aplicar 5 µl dos padrões e 15 µl das amostras com o auxílio de uma pipeta (P20). Importante! Aplicar a amostra encostando a ponta da ponteira sob a placa. Cuidado para a amostra não se espalhar! 1 cm A. Lipídeos complexos ou polares B. Lipídeos simples ou neutros 0,5 cm 1 cm FC FE A1 A2 A3 Col AG TG A1 A2 A3 1,5 cm Figura 3. Esquema ilustrativo da placa de cromatografia em camada delgada. Abreviaturas: FC, fosfatidilcolina; FE, fosfatidiletanolamina; Col, colesterol; AG, ácidos graxos; TG, triglicérides; A1, amostra 1; A2, amostra; A3, amostra 3. d. Colocar 2 placas em cada béquer contendo a mistura de solventes. Utilizar: -Solvente A, Clorofórmio:Isopropanol:Acetato de Etila:Metanol:H2O (50:50:50:21:18, v/v/v/v/v), para a separação dos lipídeos complexos ou polares e - Solvente B, Hexano: Éter etílico:ácido Acético (70:30:1, v/v/v) para a separação dos lipídeos simples ou neutros. e. Vedar o béquer com um parafilme. f. Aguardar o solvente subir a placa por capilaridade até atingir a linha indicadora do final da corrida (Figura 4). 4

5 Figura 4. Esquema ilustrativo da eluição de uma placa de TLC. g. Retirar a placa do béquer e secar na capela por 1 a 2 min. h. Revelar a placa com ácido sulfúrico 50 %. i. Observar o aparecimento das bandas. j. Registrar o resultado utilizando câmeras digitais. k. Na revelação com iodo, circular com um lápis as bandas observadas, pois o iodo desaparece gradativamente. l. Calcular o Rf (fator de retenção) de cada uma das bandas observadas e comparar com os padrões (Figura 5). 5.4cm 6cm R f = Distância Percorrida Distância Total S1 S2 P Figura 5. Esquema ilustrativo do cálculo do Rf. Ex. R f = 5.4 cm = cm 5

6 IV. Reagentes e Materiais Utilizados 1. Padrões para TLC FC, Fosfatidilcolina de gema de ovo (Sigma): 5 mg/ml FE, Fosfatidiletanolamina de cérebro bovino (Sigma): 5 mg/ml Col, Colesterol (Sigma): 10 mg/ml TG, Triglicérides: óleo de soja 5 mg/ml AG, Ácido graxo: ácido oléico (Synth) 2,5 mg/ml 2. Placas de TLC de Sílica (Cromatofolhas de alumínio, Silicagel 60, Merck) 3. Solventes orgânicos para extração Etanol, Isopropanol, Hexano 4. Mistura de solventes orgânicos para a eluição da placa de TLC Solvente A para lipídeos polares - Clorofórmio:Isopropanol:Acetato de Etila:Metanol:H2O (50:50:50:21:18, v/v/v) Solvente B para lipídeos neutros Hexano: Éter etílico:ácido Acético (70:30:1, v/v/v) 5. Vidrarias: tubos de ensaio, pipetas Pasteur, cubas para TLC. 6. Cristais de iodo para a revelação da placa. 7. Ácido sulfúrico 50 % 8. Spray e placa de aquecimento Roteiro de Estudo e questões para o Relatório 1. Desenhe a estrutura dos lipídeos identificados na aula prática. 2. Quais são os lipídeos encontrados em cada uma das amostras? 3. Tanto o triacilglicerol como o fosfolipídeo contem ácidos graxos esterificados em sua estrutura. Aponte as principais diferenças em termos de estrutura e de função destes dois lipídeos? Os triacilgliceróis poderiam formar micelas ou bicamadas? Por que? OBSERVAÇÃO: O Relatório deverá ser elaborado pelo GRUPO e entregue, de preferência digitado em computador até o dia 11 de abril (não serão aceitos relatório entregues após esta data!). 6