Diagnóstico laboratorial em oncohematologia LEUCEMIAS AGUDAS

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1 Diagnóstico laboratorial em oncohematologia LEUCEMIAS AGUDAS

2 Dra. Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica

3 Leucemias Agudas Leucemias agudas são um grupo heterogêneo de neoplasias originadas das células progenitoras, com ligação às linhagens celulares hematopoéticas. Instalação abrupta, proliferação descontrolada de células com parada de maturação (blastos) e infiltrando tecidos.

4 Leucemias Agudas Diagnóstico Morfológico LLA 25% ou mais de linfoblastos na medula óssea. Leucemia aleucêmica. Linfoma linfoblástico. LMA 20% ou mais de mieloblastos em sangue periférico e ou medula óssea. OMS/2001

5 Leucemias Linfoblásticas Agudas 75% < 15 anos 30% neoplasias da infância LLA- B: 85% LLA- T: 10 a 15% S. L. D. em 5 anos com tratamento clínico: 75% a 83% Ativação aberrante de proto-oncogenes: MYC, TAL1, LYL1, LMO2 e HOX11 Geração das fusões gênicas das quinases ativas: BCR- ABL ou fatores de transcrição: TEL-AML1, E2A-PBX1 e MLL

6 FREQUENCIA ESTIMADA DE GENOTIPOS ESPECÍFICOS DE LLA EM CRIANÇAS E ADULTOS Crianças Linhagem B Linhagem T Adultos Linhagem B Linhagem T Pui C et al. N Engl J Med 2004;350:

7 Sobrevida Livre de Doença conforme Genotipo Marcos de Lima Board Review HIAE /Junho 2007

8 Marcos de Lima Board Review Junho 2007

9 Leucemias Agudas Morfologia corantes pancromáticos ou derivados de Romanowsky (70 a 80%) Coloração citoquímicas (80 a 85%) Imunofenotipagem com marcadores monoclonais (acima de 90%) Automação por Citometria de Fluxo Expressões proteicas decorrentes de alterações gênicas (100%) Bowman GP et al The contribution of cytochemistry and immunophenotyping to the reproducibility of the FAB classification in acute leukemia.blood 1986;68:

10 CLASSIFICAÇÕES Franco-Américo-Britânica (FAB) critérios morfológicos e citoquímicos LMA : M1 a M6 LLA : L1, L2 e L início dos CRITÉRIOS IMUNOFENOTÍPICOS LMA : inclusão da M7 LLA : subtipos B e T 1988 classificação MIC CRITÉRIOS CITOGENÉTICOS 1991 aprimoramento das subclassificações LMA : inclusão da M0 LLA: classificação dos subtipos B e T Organização Mundial da Saúde (OMS) critérios morfológicos, citoquímicos, imunofenotípicos e citogenéticos para avaliar o prognóstico e definir tratamento

11 LLA - B: Linfoblastos tipo L1, L2 e L3 pela classificação FAB.

12 VBM, 3a LLA-L3

13 DESR, 6a LLA pré-b CALLA(+) VBM, 3a LLA-L3

14 EJDM, 51a LLA pré-b CALLA (-)

15 TAL, 49a LLA B precursora DESR, 6a LLA PRÉ-B CALLA(+)

16 TAL, 49a LLA B precursora

17 ASF, 28a LMA M0 P.O. 32a LMA M0

18 IMUNOFENOTIPAGEM CITOMETRIA DE FLUXO Leucemias Agudas - Linhagem celular - Clonalidade - Maturação celular - Monitorização terapêutica - Doença residual mínima

19 Linhagem celular Painel Primário ANTICORPOS MPO / CD13 / CD33 CD79a / CD19 / CD22c CD3c / CD7 / CD2 / CD5 LINHAGEM Mielóide Linfóide B Linfóide T Antígenos de Imaturidade ou Ativação: TdT, CD34, HLA-DR Pode identificar a maioria das leucemias agudas Diferencia as LMA M0, LMA M3v,LMA M7 x LLA

20 Leucemias Agudas!"#$% $ &'()* +,$ +- +,'(#. + -.

21 Célula Progenitora! "# Célula Pró-T - $ ( 0 "# $ %& ' '' (& "# $ %) ( '! 1 ( %& '' '! 1 %! (& "# $ %& %) ') * +, '' (& *, ( 0. 1! ') * +,. '', ( '! (, * ' ' 1.. 3* '! ( $αβ $αβ %& (& # /. -. # / '1!,

22 Maturação celular Leucemia Linfoblástica Aguda - B CD19, CD79a, CD22c MIC EGIL OMS LLA pró-b (pré-pré B) BI LLA-B precursora /0/1 LLA B comum LLA pré B BII - CD10 BIII - IgMc LLA pré-b LLA B madura BIV - Igm LLA B madura LLA ex.mielóide

23 LLA-B PRECURSORA / EXPRESSÃO ABERRANTE LINHAGEM MIELÓIDE CD13 e CD33 CD45xSS CD33xCD45 CD13xCD45 CD79axCD45 HLA-DRxCD45 CD34xCD45 CD19xCD45 CD10xCD45 IgMcxCD19xCD45

24 LLA pré B CALLA(+) Expressões antigênicas intracitoplasmáticas CD79a: 92,8% (+) IgMc: 60,8% (+/++)

25 LLA pré B CALLA(+) CD19/IgMc: 62,3% CD19/CD10: 85,9%

26 LLA pré B CALLA(+) CD34/HLA-DR: 85,6% HLA-DR: 90,8% (+)

27 LLA B MADURA LINFOMA DE BURKITT CD45xSS TdTxCD19 CD34xCD45 CD20xCD45 CD22xCD45 KAPPA(sup)xCD19 CD19xCD45 HLA-DRxCD45 CD10xCD45 IgM (sup)xcd19

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29 Maturação celular CLASSIFICAÇÃO IMUNOLÓGICA DAS LLA - T Pré-T T-precoce Cortical T madura * CD3 (citop) CD7 * CD2 * * CD7 CD2 * *CD7 CD2 * *CD7 *CD4 TdT TdT TdT TdT CD5 * *CD8 * * CD4* * CD1 ou * CD5 CD8* *CD3 CD3 (citop) CD3 (citop) TCR Gamma-Delta TCR Alpha/Beta,*36+*

30 Maturação celular Leucemia Linfoblástica Aguda - T '( MIC EGIL LLA pró T TI - CD 7 LLA pré T TII - Cortical precoce CD2,CD5 LLA T cortical TIII - Cortical tardia CD1a LLA T madura TIV - Medular CD3m LLA ex. mielóide OMS Leucemia Linfoblástica T precursora / LL

31 LLA-T cortical tardia / LLA Tímica FSC x SSC 96% de blastos em MO CD3c: 94,3% (+)

32 LLA-T cortical tardia / LLA Tímica CD7-99,1%(+) CD2-99,2%(+)

33 LLA-T cortical tardia / LLA Tímica CD3c: 94,3% (+) CD3s: 13,6% (-)

34 LLA-T cortical tardia / LLA Tímica CD4/CD8: 95,7% / 97,7% CD1A/CD5: 56,9% / 96,9%

35 Leucemias Mielóides Agudas + :; + <: + : 3-

36 Célula Progenitora!" # $ Pluripotente, 78 +6,, %%( " # $ 78 6, 78 +, 78, = , % %, : "# $ %1 (% % %' # $,, % 9% ' % 9 %1, %1 % %%, %%0 %1 6 ;. % ' 9% 0 9', % 6. 9 %1 % %% 9! %%0 %1 % %%0 %. %%0! % %%0 <%%1

37 CLASSIFICAÇÃO IMUNOLÓGICA DA LMA * CD33 M0 CD33 * * CD13 (citop) * Anti MPO (citop) * CD13 (citop) * Anti MPO (citop) * Glicoforina A * CD71 * CD41 * CD61 * CD42 M6 M7

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40 Classificação da OMS 7 ;>?,#A!B'%CA;''B;''C3#,%6: 1%'D,#/A%9CA %;''CA%9B%9CA %B;''C37β3,E"%% %)%'D,#A%1B%(CA;''B;%'C3,$#$α 1!D,#.%%;'3, 19D,#..F...,G /.,#3,..,#3,...;.,#3,..0...**,#I J...,#= GI,#. GI,# GI =.0. H -/ H -/ H -/ H -/ 1D %)D )1D %1'1D 9D 19D 1D $ $ $

41 Vanderson Rocha Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

42 Vanderson Rocha Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

43 3!-!+!(B (( "#>C:

44 LMA M1/ sem Maturação Doença Residual Mínima

45 LMA M1 / sem Maturação Doença Residual Mínima

46 LMA M1 / sem Maturação Linhagem Mielóide

47 LMA M1 / sem Maturação Linhagem Mielóide

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49 LMA M2 CD45xSS HLA-DRxSS MPO(c)xCD45 FSxSS CD34xSS CD33xSS CD13xSS CD117xSS CD4xSS

50 3!-!< =E EBD= F>G-

51 LMA M3 CD45xSS CD2xCD45 HLA-DRxCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45 CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

52 LMA M4 Mieloblastos> 20% e monoblastos e promonócitos >20%

53 3!-!!( HD- GH

54 C.O.S. Medula Óssea - LMA-M5a 14/06/2006 /<5 SSxCD45 / J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 /<5 SSxCD45 /5

55 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 /5 / /<< J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 /5 / /<<

56 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 /1 3-+/I J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 /1 3-+/I

57 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 /< / J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 /< /

58 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 / /< J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 / /<

59 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 /5 / J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 /5 /1

60 C.O.S. Medula óssea - LMA-M5a 14/06/2006 / 5 / J.A.B. Sangue Periférico - LMA-M5b 16/06/2006 / 5 /5

61 /$+,$-,--,$+, $2$5+,$-+:;7<=7,--++ :787<=7,$2,-.,3 JD- K6< L- 565

62 Leucemias Agudas "#L "#&O, $-. M5:N, K+$ K.( +, +K.(

63 3-3K K.( (+&O,3 SCORE B T MIELÓIDE 2 CD79a c CD22 c IgM c CD3m / c TCR MPO 1 CD19, CD20 CD10 CD2, CD5, CD8, CD10 CD117 CD33 CD13 CD65 0,5 TdT CD24 TdT, CD7 CD1a CD14 CD15 CD64 GC(

64 Imunofenotipagem de Doenças Oncohematológicas nov/91 a julho/07 Nº total de casos analisados: 6 234

65 6234 pacientes analisados de novembro de 1991 a julho de 2007 LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%) Leucemias Mielóides ides Agudas 1084 (17,4%) Leucemias Linfoblásticas Agudas 854 (13,7%) Leucemias Bifenotípicas 16 ( 0,2%) Síndrome Mielodisplásica sica 79 (1,3%)

66 /= <5 H0P$01

67 OBRIGADA PELA ATENÇÃO! Nydia Strachman Bacal Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório rio Clínico HIAE Ana Claudia Miranda Brito Alexandra M.P. Cavalcante João Carlos de C. Guerra Sonia Tsukasa Nozawa Ruth Hissae Kanayama

68 Objective 1: AmpliChip Leukemia MILE: Clinical Objectives Clinical accuracy of the microarray test as compared to standard leukemia laboratory methods ( gold standard ) n = 4000 patients Gold standard Diagnostic Information Microarray-based gene expression profile Morphology Cytogenetics Immunophenotyping Cytochemistry FISH PCR Robin Foá Atibaia 03/2007

69 AmpliChip Leukemia The MILE multi-center premarketing study Microarray Innovations in LEukemia A retrospective and prospective study to compare laboratory standard leukemia tests with a new microarray-based gene expression test Robin Foá Atibaia 03/2007

70 AmpliChip Leukemia Key hematological centers participating in Phase-I The MILE study will be conducted in collaboration with the European Leukemia Network plus US participants European Leukemia Network (WP13) Principal Investigator: T. Haferlach Site 1 Montpellier / France Site 2 Munich / Germany Site 3 Berlin / Germany Site 4 Rome / Italy Site 5 Padua / Italy Site 6 Salamanca / Spain Site 7 Cardiff / UK US Sites Memphis, La Jolla Robin Foá Atibaia 03/2007

71 Classification performance of 17 - class algorithm: MDS not included in data set Class Name N Sensitivity Specificity C1 mature B-ALL with t(8;14) C2 Pro-B-ALL with t(11q23)/mll C3 c-all/pre-b-all with t(9;22) C4 T-ALL C5 ALL with t(12;21) C6 ALL with t(1;19) C7 ALL with hyperdiploid karyotype C8 c-all/pre-b-all without t(9;22) C9 AML with t(8;21) C10 AML with t(15;17) C11 AML with inv(16)/t(16;16) C12 AML with t(11q23)/mll C13 AML with normal karyotype + other abnormalities C14 AML complex aberrant karyotype C15 CLL C16 CML C18 None of the above Accuracy by cross-validation: 95.65% - based on 30fold CV - HG-U133 Plus 2.0-2,647 samples for training Robin Foá Atibaia 03/2007

72 AmpliChip Leukemia Test MILES Stage I data presented at ASH conference 2006 [852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping with AML. Session Type: Oral Session Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek Date/Time: Tuesday, December 12, :45 AM Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM) Robin Foá Atibaia 03/2007

73 Illumina