Aplicações Clínicas da Citometria de Fluxo

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2 Aplicações Clínicas da Citometria de Fluxo Imunologia Hematologia Diagnóstico baseado nas células Prognóstico baseado nas células Monitoramento de terapias Analise de lesões e morte celular Anatomia patológica Biologia celular Oncologia

3 Avaliação de populações celulares: normais/ reativas/ em regeneração/ malignas. Classificar as neoplasias hematopoiéticas Monitorar a eficácia do tratamento: Estudo da doença residual mínima

4 Imunofenotipagem (IMF) - Etapas Indicação clínica e Avaliação dos dados clínicos Marcação das amostras: Seleção e combinação de AcMo, Morfologia Análise e interpretação de dados: Caracterização fenotípica das populações celulares: normais e alteradas Identificação da população neoplásica Laudo : diagnóstico ou descritivo

5 Conhecimento da diferenciação imunofenotipica das células hematopoiéticas em medula óssea normal, timo e outros tecidos, e sua freqüência: Permite a seleção adequada de painéis (AcMo) Reconhecimento de padrões anormais de diferenciação, de proliferações, de células em regeneração, de padrões reativos software de analises para CF : melhora a capacidade, eficiência e velocidade de analise dos dados pois informam simultaneamente uma serie de parâmetros numa única células.

6 Selecionar o painel adequado dos marcadores antigênicos Definir as populações a analisadas em % e qualitativamente: Blastos maturação de neutrófilos, monócitos e com menor freqüência: eritroblastos e megacariocitos Definir as alterações fenotípicas a serem consideradas: alterações numéricas, aberrações fenotípicas nos blastos. intensidade de fluorescência expressão assíncrona de marcadores associados à maturação Loken et al, Leuk Res, 2007

7 Interpretação de dados Descrever em % as populações celulares da amostra: normais ou alteradas. Nas neoplasias hematopoiéticas correlacionar com a classificação da OMS Comentar as limitações de interpretação Emitir o laudo.

8 Tipo de amostra Indicação e historia clinica Dados morfológicos Combinações dos diferentes tubos de AcMo baseada na expressão antigênica das células durante a hematopoiese em MO. Objetivo: detectar e diferenciar as linhagens de células hematopoiéticas e seus estádios maturativos

9 Combinação mínima de AcMo com sensibilidade para demonstrar a presença ou ausência de neoplasia hematopoiética. Linfócitos B CD79a citoplasma, CD10, CD19, CD20, CD45, Kappa, Lambda. Linfócitos T/NK Células Mielomonocíticas Células Plasmáticas CD2, CD3citoplasma ou membrana, CD4, CD5, CD7,CD8,CD56 MPO,CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD117, CD34, CD7, CD56 CD19, CD38, CD56, CD117 Wood B., Cytometry, Part B. 2007

10 Combinação de AcMo que permita realizar o diagnóstico, classificação e auxilie no prognóstico Linfócitos B CD9, CD11c, CD15, CD22, ccd22, CD23, CD25, CD13, CD33, CD34, CD38, CD43, CD58, CD79b, CD103, FMC7, Bcl-2, ckappa, clambda, TdT, Zap-70, cigm/membrana Linfócitos T/NK CD1a, ccd3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30, CD34, CD45RA, CD45RO, CD57, ab-tcr, gd-tcr, ctia-1, TdT Células Mielomonocíticas CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, CD61c, CD64, CD71, CD123, CD163, CD235a, CD105. Células Plasmáticas CD10, CD138, CD56, CD117, Wood B., Cytometry, Part B. 2007

11 serie de etapas com múltiplas mudanças e variações na intensidade de expressão de produtos gênicos nas células hematopoiéticas. Cel.Tronco Precursor Linfoide Linfócitos-T Linfócitos-B Células-NK CD Plasmocitoides Precursor Mielóide Células Eritróides Células Megacariocíticas Neutrófilos Monócitos CD Monocíticas Eosinófilos Basófilos Mastócitos

12 Celulas % ± % dp Intervalo 2dp CD34+(CPH) 1,1 ± 0,6 0,3 2,6 CD34+ ou CD117+ 2,2 ± 1,4 0,6 6.0 Eritroides 4,7 ± 2, Neutrófilos 67 ± 6, Células monocitárias 4,3 ± 1, Eosinofilos 2,5 ± 1.3 0,8 5.0 Basófilos 0,4 ± 0.4 < Mastocitos 0,02 ± 0.02 <0.03 Plasmocitos 0,2 ± Linfócitos B maturos 2,9 ± Linfócitos B precursores 0,9 ± Linfócitos T 9,2 ± Células Natural Killer 2,8 ± Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

13 SSC Linhagem % Freqüência Eritroide Megacariocitica <1 Neutrofilica Eosinofilica <1 Basofilica <1 <1-3 Monocitica Mastocitica <1 Dendritica Pl Linfoide B 23 <1-45 Total 81 B CD34-APC CD34 + HPC % CD34 + HPC: ( ) Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

14 Informação Fenotípica Identificação e enumeração das CP CD34+ da MO e seu comprometimento às diferentes linhagens : Imaturas e comprometidas a linhagem neutrofilica e linfoides B Outras CP: monociticas, basofilicas, dendriticas (pdc), mastocíticas e eritróides. Caracterização fenotípica dos diferentes compartimentos das CP CD34+ ( MO normal x MO SMD) : Detecção de bloqueios maturativos em MO displásica Investigação de padrões alterados na expressão de antígenos individuais.

15 SSC SSC SSC SSC MO Normal Granulócitos Monócitos S.Eritróide CP CD34+ MO SMD: Fenótipos Alterados CD45 CD45 CD45 CD45 Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

16 CPH Pluripotente Progenitor Linfoide T Celulas T CPH Linfoide Progenitor Linfoide Progenitor B Linfoide B Celulas B CPH CD34+ Linfóide origina: linfócitos T e B Maturação T- timo Maturação B - MO Células Plasma ticas - presentes na MO,tecido linfático e tecido conectivo Celulas Plasmaticas Timo Medula Ossea Ross 5th Ed Table 10.4

17 Maturação de Linfócitos B MO SP Tecidos Linfoides SP MO Mucosa Baco Perez M., Cytometry, Part B. 2010

18 Maturação de linfócitos T Prótimócito Timócito Precoce Timócito Comum Timócito Maduro CD34,HLA-DR TdT CD3c CD2 CD7 TdT CD3c CD2 CD7 CD5 (CD10) TdT CD3c (TCR-CD3) CD1a CD2,CD7 CD5 CD4 CD8 (TdT) (CD3c) TCR-CD3 CD2 CD7 CD5 CD4 ou CD8 CD4 TCR-CD3 CD2 CD7 CD5 CD8 TCR-CD3 CD2 CD7 CD5 Linfócitos T - Timo Linfócitos T Periféricos

19 Linfócitos B Sangue periférico Normal Piatosa B., Cytometry, Part B. 2010

20 Células B circulantes : Os diferentes fenótipos estão relacionados ao processo maturacional Correlação com o estado imune : alterações no desenvolvimento de células B, auto-imunidades, e linfoproliferação, tais como a linfocitose B monoclonal Perez M., Cytometry, Part B. 2010

21 WHO, 4 th Ed., Fig 8.02, 2008

22 CD45 CD38 CD45 CD38 Fenotipos B Normal x neoplásico MO normal CD34 CD34 Blastos na LLA-B CD34 CD34

23 WHO, 4 th Ed., Fig. 8.04, 2008

24 Blastos de LLA-T

25 Origem das células Linfocito B Linfocito T Relacao Pele < 1 > Timo < 1 > Linfonodo Baco Tonsilas Int Delgado Lamina P Placas de Peyer Cuidado! A freqüência dos linfócitos e influenciada por muitas variáveis: Idade, sexo, stress, Infecções... Westermann J.; J of Mol. Med., 1992

26 Distribuição da população celular (n=15), analisada por CF. Volume LCR: 1.3 ± 0.6 ml ( ml) Quijano S. et al., JCO 2009

27 Densidade antigênica Diferenciação Granulocítica MO normal CD34+ CD117+ HLA-DR+ CD13+forte CD33+forte HLA-DR-/+ CD13+ CD33+forte CD15+ CD11b-/+ CD13+ fraco CD33+ CD15 + CD11b+ CD13+ CD13+forte CD33+f CD33+fraco CD15 + CD15 CD11b+ CD16-/+ CD11b+fo CD16+fo Mieloblasto Promielocito Mielocito Meta-mielocito Bastao Neutrofilo Maturação Neutrofílica

28 Maturação neutrófilos Analise da expressão de CD13, CD11b, CD15, MPO Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

29 Densidade antigênica Diferenciação Granulocítica MO normal Monoblasto Promonócito Monócito Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

30

31 CÉLULAS MONOCÍTICAS Irem-2 MO NORMAL Irem-2 MO SMD: Fenótipos Alterados Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

32 Densidade antigênica Estágio I Estágio II Estágio III Estágio IV Eritrócitos

33 SSC CD64 SSC CD64 MO Normal CD45 CD36 MO SMD: Fenótipos Alterados CD45 CD36 Orfao A., Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

34 A IMF por CF : Método ágil e preciso. Uma boa análise e interpretação exigem: Um conhecimento sólido da técnica e dos padrões normais da expressão antigênica nas diferentes populações. É necessário a padronização e validação da técnica para obter informações precisas. Novos programas de análise, novos fluorocromos e anticorpos monoclonais, abrem novas perspectivas para esta tecnologia.

35 Obrigada!

36 Chng W. et al, Clin and Diag Lab Imm., 2004

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