A importância da imunofenotipagem na Leucemia Mielóide Aguda
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- Marina Lameira Borges
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1 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 1 de 11! " # $%'&(*) +,-.0/ 10&2/ 34-.4(5.6'.708%90-.2/1 1: ; <>=@?5A*BDC EGF HJILKNMHOQP'RI S TUTVTXWZY [*\0] ^_Wa`bc dfe4gfhjilknmpoqmsrixiutwv4hjm xuy z { 5 l l l _ U š V œ _ž5ÿ J nªª «} ~ j X ƒ ˆ ŠjŒ Ž Rev. Assoc. Med. Bras. v.46 n.1 São Paulo jan./mar š _ š±² U³ Vµ_ U ¹uº»l¼U½ ¼¾_ ÀGÁUÂXà ÄÀGà ÅUÆ'ÇÈ ÉNÊ Artigo de Revisão A importância da imunofenotipagem na Leucemia Mielóide Aguda S.L.R. Martins, R.P. Falcão Disciplina de Hematologia do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,SP. UNITERMOS: Leucemia mielóide aguda. Classificação FAB. Imunofenotipagem. Leucemia bifenotípica. KEY WORDS: Acute myeloid leukemia. FAB classification. Imunophenotyping. Biphenotypic leukemia. INTRODUÇÃO A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença clonal do tecido hematopoético que se caracteriza pela proliferação anormal de células progenitoras da linhagem mielóide, ocasionando produção insuficiente de células sanguíneas maduras normais. Deste modo a infiltração da medula é frequentemente acompanhada de neutropenia, anemia e plaquetopenia.
2 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 2 de 11 O mecanismo que leva a célula progenitora da linhagem mielóide a perder o controle da proliferação celular, ocasionando a expansão do clone leucêmico, permanece incerto. No entanto, ativação de proto-oncogenes 1-4 e mutações em genes supressores 5-6 que regulam o ciclo celular parecem estar envolvidos na patogênese das leucemias. A LMA representa cerca de 15-20% das leucemias agudas da infância e 80% de adultos. Na maioria dos casos não há evidência da influência de fatores genéticos, assim como não há diferenças de incidência entre as raças americana, africana e caucasiana 7, ao contrário da leucemia linfóide aguda 8. O pleomorfismo da LMA, assim como uma possível diferença de comportamento biológico, motivou o estabelecimento de uma classificação. Em 1975, pela primeira vez, o grupo cooperativo Franco-Americano-Britânico (FAB) propôs a classificação em seis diferentes subtipos, baseado estritamente em aspectos morfológicos e citoquímicos 9. Em 1985 esta classificação foi revisada, cinco originando a atual, onde foram acrescentados dois novos subtipos (Tabela 1). Se a classificação FAB baseia-se fundamentalmente em critérios morfológicos e citoquímicos, qual seria a importância do estudo imunofenotípico? Além da imunofenotipagem ser uma metodologia ágil, o que a torna atrativa para ser incorporada na prática médica de rotina, o estudo das características imunofenotípicas das LMAs possui também interesse de investigação clínica 12. Entre estes podemos destacar: determinar a sensibilidade diagnóstica do imunofenótipo e sua relação com os subtipos FAB; examinar a relação entre expressão de antígenos, subtipos FAB, anormalidades cromossômicas e características clínicas 13 ;
3 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 3 de 11 avaliar o significado prognóstico dos diferentes achados imunofenotípicos e comparar com outros fatores prognósticos, especialmente a morfologia e a citogenética ; detectar a doença residual mínima 17. Ademais, a classificação imunofenotípica tem importância diagnóstica e prognóstica em alguns subtipos FAB. Assim, ela é essencial para o diagnóstico das LMA-M0 e LMA-M7, sendo auxiliar no diagnóstico das LMA-M3, LMA-M2v, LMA-M4Eo e LMA-M5. IMPORTÂNCIA DIAGNÓSTICA DA IMUNOFENOTIPAGEM O uso sistemático da imunofenotipagem nas leucemias agudas resultou o reconhecimento de alguns subtipos, cuja identificação não era possível apenas pelos critérios morfológicos e citoquímicos 9. Assim, foram definidos dois novos subtipos de leucemias mielóides agudas, que são: 1) LMA-M0 Definição: A LMA-M0 é caracterizada pela infiltração da medula óssea por células blásticas, as quais possuem reação citoquímica para mieloperoxidase (MPO) negativa 18 e marcação imunológica para antígenos da linhagem mielóide. Morfologia: Os blastos são pequenos, com cromatina frouxa e nucléolo evidente, apresentando citoplasma agranular, sem bastonete de Auer. Morfologicamente assemelhamse aos blastos linfóides L2 da classificacão FAB, e também apresentam reação citoquímica para MPO negativa. Imunofenotipagem: O estudo imunofenotípico revela uma população blástica com relação entre tamanho/grânulo (FSC/SSC) baixa 19, com positividade para pelo menos um dos antígenos de linhagem mielóide CD33, CD13 e/ou CD11b. A determinação da MPO por método imunológico 20, microscopia eletrônica ou quimioluminescência 21 é positiva.os antígenos de linhagem linfóide geralmente são negativos. Relevância clínica: Como a abordagem terapêutica das leucemias mielóides diferem das linfóides, é importante a realização da imunofenotipagem para diferenciar a LMA-M0 da LLA-L2, e a conseqüente orientação correta do tratamento. 2) LMA-M7 Definição: Este é outro subtipo de LMA para o qual a imunofenotipagem passou a ter papel fundamental. A LMA-M7 é definida pela presença de >30% de megacarioblastos entre as células nucleadas na medula óssea 22. Morfologia: Os blastos são de tamanhos variáveis, com citoplasma geralmente agranular, podendo apresentar protusões. A medula óssea freqüentemente apresenta aumento das fibras de reticulina, e comumente o aspirado de medula óssea é de difícil obtenção. Em alguns casos, a realização de biópsia de medula óssea é necessária para o diagnóstico. Imunofenotipagem: Os marcadores de linhagem mielóide CD13 e CD33 freqüentemente estão presentes, e o diagnóstico de LMA-M7 é definido pela positividade para os antígenos
4 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 4 de 11 de linhagem megacariocítica CD41 (complexo glicoprotéico llb/llla), CD42 (glicoproteína lb) e/ou CD61 (glicoproteína llla) 22. Alguns casos podem ser HLA-DR negativo. Para o estudo imunofenotípico da LMA-M7 deve-se ter o cuidado de coletar o material aspirado de medula óssea em frasco contendo EDTA para minimizar a agregação de plaquetas à superfície dos blastos, que pode ocasionar resultado falso positivo para os antígenos da série plaquetária 23. Relevância clínica: A LMA-M7, pelos critérios morfológicos e citoquímicos, pode ser confundida com as leucemias linfóides agudas e também com a LMA-M0, sendo importante o estudo imunofenotípico para diferenciá-las. A LMA-M7 tem maior incidência em crianças com síndrome de Down 24, que compõem um subgrupo com boa resposta terapêutica, ao contrário dos pacientes sem a trissomia do cromossomo 21, os quais possuem pior prognóstico. IMPORTÂNCIA PROGNÓSTICA DA IMUNOFENOTIPAGEM Para a caracterização dos demais subtipos FAB de LMA o papel da imunofenotipagem é menos importante, porém corrobora com os achados morfológicos 25 e citoquímicos 26 para determinação do diagnóstico e fatores prognósticos. Com a melhora do tratamento da LMA, e conseqüente maior tempo de seguimento clínico houve reconhecimento de alguns subtipos de LMA com melhor resposta terapêutica e maior tempo de sobrevida 27. Estes subtipos de LMA possuem características citogenéticas e imunofenotípicas especiais, importantes na prática clínica Os achados imunofenotípicos e a correlação com a alteração cromossômica para cada subtipo (Tabela 2) serão descritos a seguir: 1) LMA-M2v Definição: A LMA-M2 é um subtipo FAB definido pela presença de pelo menos 30% (na proposta de classificação da Organização Mundial de Saúde- 1999, o valor limítrofe é 20%) de blastos na medula óssea, associados a mais de 10% de maturação da série granulocítica 10. A LMA-M2v apresenta achado morfológico, imunológico, citogenético e clínico característicos.
5 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 5 de 11 Morfologia: Caracteriza-se por apresentar blastos grandes com abundante citoplasma basofílico, freqüentemente contendo numerosos grânulos azurofílicos. Em alguns casos os blastos podem apresentar grânulos grandes (pseudo-chediak-higashi) 25. Os bastonetes de Auer são freqüentes. Promielócitos, mielócitos e granulócitos maduros com variados graus de displasia são vistos na medula óssea 31. Estas células podem mostrar segmentação nuclear anormal e/ou disgranulopoese 32. Os precursores e o sinofílicos freqüentemente estão aumentados, mas não exibem anormalidades citológicas, citoquímicas ou citogenéticas 33, ao contrário da LMA-M4Eo, onde os eosinófilos apresentam proliferação clonal. Os eritroblastos e megacariócitos são morfologicamente normais. A reação citoquímica para MPO é positiva em pelo menos 3% dos blastos. Imunofenotipagem: Na LMA-M2v os blastos são positivos para os antígenos de linhagem mielóide CD13, CD33, CD65w e anti-mpo. No entanto, o achado imunofenotípico característico é a presença dos antígenos de linhagem linfóide (CD19) ou linhagem NK (CD56) associados aos antígenos CD33 e CD Análise Citogenética: Os casos de LMA-M2v que expressam os antígenos CD19 e CD56 têm forte correlação com a translocação t(8;21) Relevância clínica: A LMA-M2 t(8;21) tem maior taxa de remissão completa e possui melhor prognóstico em pacientes adultos; em crianças os estudos ainda são inconclusivos. 2) LMA-M3 Definição: Este subtipo é composto por células que há longo tempo eram identificadas como "promielócitos", e que na classificação FAB têm a conotação de blastos "tipo M3" 10. Como estas células não têm a aparência dos promielócitos normais, devem ser consideradas como blastos. Do ponto de vista morfológico, são facilmente distinguíveis dos promielócitos detectados na recuperação medular após aplasia induzida por drogas. Morfologia: Os blastos apresentam núcleo excêntrico e citoplasma com abundante granulação, alguns com numerosos bastonetes de Auer ("faggot cell"). Em alguns casos, os grânulos citoplasmáticos são tão numerosos e grandes que tornam difícil distinguir o núcleo do citoplasma 39. Na forma variante hipogranular da LMA-M3 os blastos têm núcleo volumoso e convoluto. O citoplasma é basofílico com granulação escassa Esta variante é diagnosticada quando as formas hipogranulares constituem >50% dos blastos. Em ambos os casos a reação citoquímica para mieloperoxidase é positiva forte. Imunofenotipagem: O estudo imunofenotípico revela relação FSC/SSC alta 19. Os blastos apresentam grande auto-fluorescência, e positividade para os marcadores de linhagem mielóide CD13 e CD Caracteristicamente, os antígenos CD34, HLA-DR e CD14 são negativos 25. Análise Citogenética: O achado imunofenotípico descrito acima tem correlação com a translocação t(15;17) Naqueles casos em que o estudo imunofenotípico não é o habitual (CD13 +, CD34- e HLA-DR-) deve-se pesquisar a t(11;17) 46. Relevância clínica: Os pacientes apresentam quadro clínico e alterações laboratoriais compatíveis com coagulação intravascular disseminada (CIVD). Com a terapia clássica para LMA os pacientes freqüentemente evoluem a óbito devido a diáteses hemorrágicas. No entanto, após o advento do tratamento com o ácido trans-retinóico (ATRA) a LMA-M3
6 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 6 de 11 passou a apresentar boa resposta clínica e melhor controle da CIVD, tornando-se o subtipo FAB com melhor prognóstico clínico. Em alguns casos, a expressão forte do antígeno CD13 está associada a maior incidência da síndrome do ATRA e pior evolução clínica 47. Caso haja expressão anômala do antígeno CD56 é imperativo a realização de estudo citogenético, pois pode não estar presente a translocação t (15;17), tendo, portanto, pior ou nenhuma resposta terapêutica ao ATRA. A expressão do antígeno CD56 associado ao CD13, na ausência de CD34 e HLA-DR, está associada a uma nova entidade, a "Leucemia Mielóide-Natural Killer", não referida na classificação FAB. Este subtipo apresenta achado morfológico semelhante a LMA-M3 variante, sendo mais comum em pacientes idosos, estando associada a não-resposta ao ATRA e pior prognóstico 46. 3) LMA-M4 Eo Definição: A LMA-M4Eo é definida pela presença de componente monocítico entre 20% e 80% das células blásticas na medula óssea podendo apresentar mais que monócitos/mm 3 no sangue periférico, associado a um aumento do componente eosinofílico anormal Morfologia: Alguns blastos podem ocasionalmente conter bastonete de Auer como na LMA- M4, no entanto, os achados morfológicos típicos são a presença de eosinofilia em variados estágios de maturação. Os grânulos eosinofílicos são maiores que os normalmente observados em precursores eosinófilos normais, têm coloração roxo-violeta, e, em algumas células, são tão densos que podem obscurecer o núcleo. Os eosinófilos maduros ocasionalmente podem apresentar hiposegmentação nuclear (pseudo Pelger-Huet). A série neutrofílica na medula óssea é escassa 48. Os blastos apresentam usualmente reação MPO positiva. A reação de cloroacetato-esterase, que normalmente é negativa na série eosinofílica da LMA-M2v, é caracteristicamente positiva nos eosinófilos anormais 25. Imunofenotipagem: LMA-M4Eo apresenta marcação positiva para os antígenos de linhagem mielóide CD13 e CD33, assim como para os antígenos de linhagem monocítica CD14, CD15 e CD11b. Caracteristicamente, há expressão anômala do antígeno de linhagem linfóide CD2 50. Análise citogenética: Os casos de LMA-M4Eo que expressam o antígeno CD2 tem correlação com a inversão do cromossomo Relevância clínica: Em comparação com outros tipos de LMA os pacientes são mais jovens, apresentam leucocitose e organomegalia, respondem favoravelmente a indução quimioterápica e têm melhor prognóstico. 4) LMA-M5 Definição: A LMA-M5 é definida quando 80% ou mais das células não eritróides da medula óssea são compostas por monoblastos, promonócitos ou monócitos 9. O subtipo LMA-M5a apresenta >80% de monoblastos, enquanto o subtipo LMA-M5b tem <80% de monoblastos 10. Morfologia: Os monoblastos são células grandes com citoplasma abundante e basofilia acentuada. Finos grânulos azurofílicos e vacúolos podem estar presentes. Freqüentemente o núcleo é redondo com cromatina frouxa e presença de um ou mais nucléolos proeminentes. A
7 Revista da Associação Médica Brasileira - <b>a importância da imunofenotipagem... Página 7 de 11 presença de bastonete de Auer é incomum. Os promonócitos têm núcleo convoluto e irregular. O citoplasma é menos basofílico e algumas vezes tem grânulos e vacúolos mais evidentes. A reação citoquímica para MPO geralmente é negativa. A reação de esterase é positiva forte, e pode ser inibida pelo fluoreto de sódio, ao contrário das células mielóides não monocíticas 26. Imunofenotipagem: O achado imunofenotípico característico da LMA-M5 é a presença de população blástica com relação FSC/SSC maior que nas LMAs M0 e M1 19. Os antígenos de linhagem mielóide CD33 são positivos e os CD13, negativos. Os antígenos CD14 e CD15 são positivos. É comum a expressão fraca do antígeno CD4. O marcador CD34 geralmente é negativo. Os antígenos de cadeia leve k e l freqüentemente são positivos devido a ligação inespecífica, sendo importante realizar o bloqueio destes sítios com soro AB ou soro de coelho. Alteração citogenética: A LMA-M5 CD33 + e CD4 + associados aos CD13- e CD34- correlaciona-se freqüentemente com a t(9;11) 52. Relevância clínica: Pacientes com leucemia monocítica têm maior prevalência de tumor extra-medular, com infiltração em gengiva, pele, tubo digestivo e sistema nervoso central. A presença de hepato-esplenomegalia e hiperleucocitose é mais freqüente em comparação aos outros subtipos FAB. LEUCEMIAS AGUDAS BIFENOTÍPICAS A imunofenotipagem tornou-se importante também para o reconhecimento das leucemias bifenotípicas mielóide-linfóide, as quais diferem das leucemias mielóides com marcadores linfóides anômalos As leucemias bifenotípicas caracterizam-se por apresentar antígenos de superfície, citoplasmáticos ou nucleares tanto das linhagens linfóides como das mielóides, com critérios diagnósticos definidos Como mostra a Tabela 3, o diagnóstico de leucemia bifenotípico é alcançado quando se tem dois ou mais pontos para duas linhagens específicas. Este grupo de leucemias deve ser tratado como LMA. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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