INFECÇÃO HOSPITALAR POR Staphylococcus aureus RESISTENTES À METICILINA (MRSA) EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE ENSINO: TIPAGEM EPIDEMIOLÓGICA MOLECULAR E

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO INFECÇÃO HOSPITALAR POR Staphylococcus aureus RESISTENTES À METICILINA (MRSA) EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE ENSINO: TIPAGEM EPIDEMIOLÓGICA MOLECULAR E FENOTÍPICA DE AMOSTRAS ISOLADAS EM E 00 MAXELLE MARTINS TEIXEIRA Uberaba-MG Novembro/0

2 i MAXELLE MARTINS TEIXEIRA INFECÇÃO HOSPITALAR POR Staphylococcus aureus RESISTENTES À METICILINA (MRSA) EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE ENSINO: TIPAGEM EPIDEMIOLÓGICA MOLECULAR E FENOTÍPICA DE AMOSTRAS ISOLADAS EM E 00 Tese apresentada ao curso de Pós- Graduação em Patologia, área de concentração Patologia Clínica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor. Orientadora: Profa. Dra. Adriana Gonçalves de Oliveira Co-orientadora: Profa. Dra. Cristina da Cunha Hueb Barata de Oliveira Uberaba-MG Novembro/0

3 ii AGRADECIMENTOS À Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida, sempre me guiando diante de decisões, me mostrando o caminho certo a ser seguido e me confortando frente às dificuldades. Aos meus pais, Eliane e Welson, pelo incentivo e exemplo de vida e profissionalismo. Obrigada por todo amor, carinho e educação que recebo sempre de vocês. Aos meus queridos irmãos, Maxwell e Maxwara, pelo apoio e carinho. À Profa. Dra. Adriana Gonçalves de Oliveira, minha orientadora, pelos conhecimentos transmitidos, apoio, confiança e por me direcionar na execução deste projeto. Á Profa. Dra. Cristina da Cunha Hueb Barata de Oliveira, minha co-orientadora, pela colaboração na execução deste trabalho. Ao Thiago, meu namorado, por caminhar ao meu lado sempre com carinho, entusiasmo e otimismo. Ás amiga do Laboratório da Disciplina de Microbiologia Natália, Fernanda, Larissa, Aline, Renata, Patrícia e Ana Carolina. O destino me proporcionou amizades maravilhosas e importantes para a vida toda. Á minha querida amiga Sônia Caiado que foi um anjinho enviado por Deus para me ajudar durante toda essa jornada. Muito obrigada pelo carinho, conselhos, incentivo e por sua amizade!

4 iii Ao meu amigo Paulo Roberto pelos ensinamentos e amizade. À Dona Miguela, Leila, Sueli e Celso, funcionários da UFTM, pelos conselhos e amizade. Aos alunos de iniciação científica e TCC que passaram pela microbiologia. Ao Marcelo Costa Araújo pela colaboração na execução do trabalho.

5 iv RESUMO Os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) estão entre os principais agentes causadores de infecção hospitalar em todo o mundo. Entretanto, estudos recentes têm demonstrado mudanças nos clones epidêmicos predominantes ao longo do tempo, devido à introdução de novos clones ou evolução de clones existentes. Assim, o objetivo foi estudar a epidemiologia dos MRSA no Hospital de Clinicas da UFTM, por métodos moleculares e fenotípicos, em dois períodos com intervalo de 0 anos ( e 00). Amostras de S. aureus obtidas de pacientes internados foram caracterizadas pelo método de coloração de Gram, produção de catalase, coagulase, DNAse e fermentação do manitol. A resistência à meticilina foi determinada pela detecção do gene meca por PCR e por testes fenotípicos de sensibilidade (disco difusão para cefoxitina e diluição em caldo para oxacilina). O perfil de sensibilidade aos demais antimicrobianos foi determinado pela técnica de disco difusão. A concentração inibitória mínima (CIM) da vancomicina foi determinada por diluição em caldo (micro e macrodiluição) e Etest. Técnicas de genotipagem incluindo eletroforese sob campo pulsado (PFGE), tipagem do cassete cromossômico estafilocóccico mec (SCCmec), restriçãomodificação (RM) e tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST) foram usadas para comparar as características moleculares das amostras de MRSA isoladas nos diferentes períodos estudados. Os resultados mostraram um aumento significativo (P=0,00) na prevalência de MRSA de % (/0) em para % (/) em 00. A maioria das amostras de MRSA (,% em e 0,% em 00) apresentou alto nível de resistência à oxacilina (CIM µg/ml). Todas as amostras de MRSA avaliadas foram sensíveis à vancomicina (CIM μg/ml). Entretanto, observou-se que a macrodiluição e o Etest apresentaram uma ou duas diluições mais altas quando comparados com a microdiluição. Além disso, várias amostras isoladas em ambos os períodos de estudo apresentaram CIM,µg/mL pela macrodiluição e Etest. Todas as amostras de MRSA isoladas em e,% em 00 apresentaram um fenótipo de multirresistência, pertenceram ao CC, apresentaram o SCCmecIII e tinham o padrão de PFGE similar ao da amostra representativa do clone epidêmico brasileiro (BEC). Em 00, detectou-se o aumento na sensibilidade das amostras de MRSA relacionadas ao BEC a cloranfenicol e rifampicina. Além disso, detectou-se a entrada de diversas linhagens de MRSA sensíveis a sulfametoxazol-trimetoprim. Estas amostras foram relacionadas aos clones USA00 (CC-SCCmecIV), USA00 (CC- SCCmecIV), USA00 (CC-SCCmecII) e EMRSA-/Córdoba (CC-SCCmecI). Este é o primeiro relato de amostras geneticamente relacionadas ao clone EMRSA-/Córdoba em nosso país. Assim, embora o BEC multirresistente tenha permanecido como o clone mais comum em nosso hospital, observou-se uma significante mudança na epidemiologia dos MRSA em 00. Portanto, estudos locais sobre a epidemiologia molecular de MRSA são essenciais para traçar a entrada de novos clones e reunir informações sobre a susceptibilidade antimicrobiana e assim orientar as decisões quanto à escolha terapêutica empírica adequada para as infecções causadas por MRSA. Palavras-chave: Staphylococcus aureus resistente à meticilina; Sensibilidade antimicrobiana, Análise molecular

6 v ABSTRACT Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major cause of nosocomial infections worldwide. However, recent studies have demonstrated changes in the predominant epidemic clone over time because of the introduction of new clones or evolution of an existing clone. Therefore, our aim was study the epidemiology of MRSA in the Hospital de Clínicas UFTM by phenotypic and molecular methods in two periods with an interval of 0 years ( and 00). S. aureus isolates recovered from hospitalized patients were identified by methods Gram staining, catalase, free coagulase, DNAse and fermentation of mannitol. Methicillin resistance was determined by PCR amplification of the meca gene and phenotypic tests of sensitivity (cefoxitin disc diffusion and broth dilution for oxacillin). The susceptibility profile was determined by disk diffusion method. The minimal inhibitory concentration (MIC) for vancomycin was determined using broth dilution method (micro- and macro-dilution) and Etest. Genotyping techniques including staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) typing, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and restriction-modification (RM) test were used to compare the molecular characteristics of clinical MRSA isolates recovered in both periods studied. The results show a significant statistically increase (P=0.00) in the prevalence of MRSA,.% (/0) in for.% (/) in 00. Most MRSA isolates (.% in and 0.% in 00) showed a high level of oxacillin resistance (MIC μg/ml). All MRSA isolates were sensitive to vancomycin. However, vancomycin MICs generated by broth macrodilution and Etest methods were one or two fold dilution higher than MICs determined by broth microdilution. In addition, several MRSA isolates showed vancomycin MICs.µg/ml by broth macrodilution and Etest. All the MRSA isolates in and.% in 00 displayed multidrug-resistance phenotype, were allocated in the CC, carried SCCmecIII and had PFGE patterns similar to BEC prototype. In the year of 00, we detected an increased susceptibility of BEC isolates to rifampicin and choramphenicol. In addition, we also detected the entrance of diverse international MRSA lineages susceptible to SXT, almost all belonging to CC. These MRSA isolates were related to the USA00 (CC-SCCmecIV; PFGE-type B), USA00 (CC-SCCmecIV), USA00 (CC-SCCmecII) and EMRSA-/Cordobes (CC-SCCmecI) clones. To our knowledge, this is the first report on the emergence of MRSA isolates genetically related to the EMRSA-/Cordobes clone in our country. Thereby, despite BEC supremacy in our country, there was a significant change in the epidemiology of MRSA in 00. Therefore, local studies of the molecular epidemiology of MRSA are essential to trace the entrance of new clones and bring together information on antimicrobial susceptibility to guide decisions regarding the choice of appropriate empiric therapy for MRSA invasive infections. Keywords: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; antimicrobial susceptibility; molecular analysis

7 vi LISTA DE FIGURAS Figura. Representação ilustrativa da ação dos genes regulatórios do gene meca... Figura. Representação ilustrativa dos tipos de SCCmec... Figura. Representação ilustrativa do mecanismo de resistência do Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária à vancomicina (VISA)... Figura. Representação ilustrativa do mecanismo de resistência dos Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA)... Figura. Teste da catalase... Figura. Teste da coagulase... Figura. Fermentação do manitol... Figura. Teste da DNAse... Figura. Teste de disco difusão para determinação do perfil de sensibilidades aos antimicrobianos... Figura 0. Teste de microdiluição em caldo para determinação da CIM... Figura. Teste de macrodiluição em caldo para determinação da CIM... Figura. Etest usado na determinação da CIM da vancomicina... Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto da amplificação do gene meca (pb)... Figura. Prevalência de amostras de S. aureus resistentes à meticilina(mrsa) isoladas no HC da UFTM em e Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando a tipagem do SCCmec pela multiplex PCR...

8 vii Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando produtos da amplificação dos genes meca e lukf... 0 Figura. Comparação dos métodos de determinação da CIM da vancomicina de acordo com a porcentagem de amostras de MRSA de e 00 com CIM μg/ml e > μg/ml... Figura. Gel de eletroforese em campo pulsado (PFGE) das amostras de (A) MRSA mutirresistentes relacionadas ao clone epidêmico brasileiro (BEC) e (B) MRSA mostrando diferenças de mais de seis bandas do BEC...

9 viii LISTA DE TABELAS Tabela. Tipagem do SCCmec proposto por Boye et al. (00)... Tabela. Tipagem do complexo clonal (CC) proposto por Cockfield et al. (00)... Tabela. Primers utilizados na PCR para tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST) proposto por Enright et al. (000)... Tabela. Perfil de sensibilidade das amostras de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) isoladas de pacientes internados no HC da UFTM em e Tabela. Nível de resistencia à oxacilina das amostras de MRSA isoladas de pacientes internados no HC da UFTM nos anos de e Tabela. Comparação da CIM da vancomicina determinada pela diluição em caldo (micro e macrodiluição) e Etest para as amostras de MRSA isoladas em (n=) e 00 (n=)... Tabela. Características moleculares, CIM para oxacilina e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras de MRSA isoladas de pacientes hospitalizados em e

10 ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATCC: American Type Culture Collection BEC: Brazilian epidemic clone (clone epidêmico brasileiro BHI: Brain Heart Infusion (infusão de cérebro e coração) CA-MRSA: Community-acquired metthicillin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus resistentes à meticilina adquiridos na comunidade) CC: Complexo clonal CCIH: Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC: Centers for Disease Control CEP/UFTM: Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro CIM: Concentração inibitória mínima CIP: Ciprofloxacina CLI: Clindamicina CLO: Cloranfenicol CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute DNA: Ácido desoxirribonucléico ddntp: dideoxinucleotídeos trifosfatado dntp: desoxiribonucleotídeo trifosfatado EDTA: Ácido etileno diamino tetracético EUA: Estados Unidos da América ETA: Toxina esfoliativa A GEN: Gentamicina HC: Hospital de Clínicas

11 x hvisa: Heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (resistência intermediária heterogênea à vancomicina) ICBN: Instituto de Ciências Biológicas e Naturais Kb: Kilobases LIN: Linezolida M: Molar CBM: Concentração bactericida mínima μg: Micrograma g/ml: Micrograma por mililitro MG: Minas Gerais MH: Mueller-Hinton ml: Mililitro (s) i MLS : Resistência induzida a macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B B MLST: Multilocus sequence typing (tipagem por sequenciamento de multilocus) mm: Milimolar MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus resistentes à meticilina) MSCRAMM: Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules N: Normal ng: Nanograma NI/J: Clone Nova Iorque/Japão OXA: Oxacilina Pb: Par de base PBP: Protein Binding Penicilin (Proteína ligadora de penicilina)

12 xi PC: Clone pediátrico PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de polymerase) PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em gel sob campo pulsado) ph: Potencial de hidrogênio iônico PVL: Panton-Valentine leucocidina RIF: Rifampicina RM: Restriction-modification (restrição-modificação) rpm: Rotações por minuto SAME: Serviço de arquivo médico SCCmec: Staphylococcal chromosomal cassette mec (cassete cromossômico estafilocócico mec) SE: Staphylococcal enterotoxins Spa: Staphylococcus aureus protein A SPC: Serviço de Patologia Clínica SPSS: Statistical Package for the Social Sciences ST: Sequence type SXT: Sulfametoxazol-trimetoprim TAE: Tris-acetato-EDTA TE: Tris- EDTA TET: Tetraciclina Tn: Transposon TSST-: Toxic shock syndrome toxin- (Toxina da síndrome do choque tóxico-) U: Unidade UFC/mL: Unidade formadora de colônias por mililitro UFTM: Universidade Federal do Triângulo Mineiro

13 xii UV: Ultravioleta VAN: Vancomicina VISA: Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus com resistência intermediária à vancomicina) VRSA: Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus resistente à vancomicina) VSSA: vancomycin-susceptible Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus sensível à vancomicina)

14 xiii SUMÁRIO AGRADECIMENTOS II RESUMO IV ABSTRACT V LISTA DE FIGURAS VI LISTA DE TABELAS VIII. INTRODUÇÃO. JUSTIFICATIVA. OBJETIVOS 0. Objetivo Geral 0. Objetivos Específicos 0. REVISÃO DE LITERATURA. Staphylococcus aureus.. Patogênese. Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA)

15 xiv. Epidemiologia molecular dos MRSA. Resistência à vancomicina. METODOLOGIA. Amostragem. Confirmação da espécie.. Coloração pelo método do Gram.. Teste da catalase.. Teste da coagulase.. Fermentação do manitol.. Teste da DNAse. Detecção do gene meca.. Extração do DNA.. Reação de amplificação para o gene meca 0.. Análise do produto da PCR 0. Perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Teste de resistência induzida à clindamicina (fenótipo MLS B i ). Determinação da concentração inibitória mínima (CIM).. Microdiluição em caldo.. Macrodiluição em caldo.. Etest. Caracterização Molecular.. Determinação do tipo SCCmec

16 xv.. Reação de amplificação. Detecção do gene da toxina de Panton-Valentine leucocidina (PVL). Eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) 0.. Análise do perfil eletroforético.0 Determinação do complexo clonal (CC).0. Reação de amplificação. Tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST).. Purificação do produto do PCR.. Sequenciamento dos produtos de PCR purificados. Obtenção de dados demográficos e clínicos dos pacientes. Análise dos dados. RESULTADOS. Características clínicas.tipagem do SCCmec e detecção do gene da toxina pvl. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e resistência induzida a clindamicina 0.. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para oxacilina.. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina. PFGE, MLST e determinação do CC. DISCUSSÃO

17 xvi. CONCLUSÕES. REFERÊNCIAS ANEXOS

18 Introdução. INTRODUÇÃO 0 0 Os Staphylococcus aureus são cocos Gram-positivos que podem ser encontrados fazendo parte da microbiota residente ou transitória de seres humanos, principalmente da pele e das mucosas das fossas nasais, orofaringe e intestino. Todavia, esses microrganismos causam uma diversidade de infecções, tanto em indivíduos da comunidade quanto em indivíduos hospitalizados, sendo que o número de infecções hospitalares causadas por S. aureus tem aumentado acentuadamente em vários países do mundo nas últimas décadas. As amostras hospitalares apresentam tendência a ser resistente a maioria das drogas antimicrobianas disponíveis, o que torna difícil o tratamento e agrava os processos infecciosos (MASSAY et al., 00). S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) é o principal agente causador de infecções nosocomiais no mundo todo. Segundo dados do LEADER Surveillance Programs, nos Estados Unidos, a prevalência de MRSA é de,% nos hospitais (PILLAR et al., 00). Também no Brasil o MRSA tem se tornado endêmico nas últimas décadas, sendo que as taxas atuais de prevalência é % (GALES et al., 00). Na Europa, as taxas de infecções por MRSA são bastante variáveis, dependendo do país, podendo chegar próximo de 0% em países como Portugal e Reino Unido (APPELBAUM, 00). Mesmo nos países escandinavos que apresentam as taxas mais baixas, em torno de -%, a frequência começou a aumentar (GRUNDMAN et al., 00). Na realidade, os dados mundiais atuais apontam o MRSA como um patógeno pandêmico. As primeiras amostras de MRSA foram isoladas na Europa em, dois anos após a introdução da meticilina na prática terapêutica. A partir de 0 esses microrganismos

19 Introdução 0 0 tornaram-se um dos principais patógenos de infecções hospitalares em âmbito mundial, sendo considerados endêmicos em muitos hospitais (OLIVEIRA, TOMASZ & De LENCASTRE, 00). A resistência foi adquirida por um elemento genético móvel denominado de cassete cromossômico estafilocóccico mec (SCCmec). Este cassete transporta o gene meca que confere resistência à meticilina e a todos antibióticos β-lactâmicos (ITO et al., 00). Oito principais variantes do SCCmec (tipo I ao VIII) foram caracterizadas até o presente momento (CHAMBERS & DE LEO, 00). Estudos baseados em eletroforese em gel sob campo pulsado (pulsed-field gel electrophoresis-pfge), tipagem por sequenciamento de multilocus (multilocus sequence typing-mlst) e tipagem de SCCmec tem identificado sete principais clones pandêmicos de MRSA associados ao hospital, incluindo o clone ibérico, brasileiro, húngaro, Nova Iorque/Japão, pediátrico, EMRSA-, EMRSA- e Berlim. Análise com MLST, baseado na variação da sequência de sete genes housekeeping, mostrou que estes clones pandemicos de MRSA evoluiram a partir de seis diferentes complexos clonal (CC, CC, CC, CC, CC0, e CC), cada um resultante de um genótipo ancestral distinto (ENRIGHT et al., 00; COCKFIELD et al., 00). Existem claras evidências de que clones bem sussedidos de MSSA tornaram-se MRSA pela introdução do SCCmec em mais de uma ocasião. No entanto, a evolução dos clones de MRSA continua ocorrendo e mudanças na epidemiologia desses patógenos têm sido observada nos últimos anos. Assim, é fundamental o conhecimento da epidemiologia molecular local desse patógeno para que a introdução de novas linhagens seja detectada precocemente, pois essas podem anunciar o início de mudanças de grandes proporções.

20 Justificativa. JUSTIFICATIVA 0 O MRSA se tornou, mundialmente, um dos principais agentes de infecções hospitalares da atualidade. Entretanto, embora normalmente cada localização geográfica tenha apenas um número limitado de clones de MRSA em seus hospitais a distribuição geográfica dos clones de MRSA continua a evoluir. Estudos têm mostrado mudanças nos clones epidêmicos predominantes ao longo do tempo devido a evolução de clones existentes ou a introdução de novos clones mais adaptados e mostrando propriedades patogênicas, incluindo a produção de toxinas e biofilmes. Assim, o aumento na frequência de MRSA como agente causador de infecções e mudanças na epidemiologia dos MRSA torna importante o monitoramento da disseminação e da evolução clonal desse patógeno no nosso hospital, que certamente contribuirão para o estabelecimento das estratégias de controle e tratamento racional contra os clones mais prevalentes.

21 0 Objetivos. OBJETIVOS. Objetivo Geral O presente estudo teve como objetivo geral estudar a epidemiologia dos Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) no Hospital de Clínica (HC) da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), por métodos moleculares e fenotípicos, em dois períodos com intervalo de 0 anos ( e 00). 0. Objetivos Específicos 0 ) Detectar o gene meca, por PCR, nas amostras de S. aureus isoladas de pacientes internados no HC da UFTM, em e 00; ) Avaliar e comparar o nível de resistência à oxacilina e vancomicina por meio de testes fenotípicos em amostras de MRSA nos diferentes períodos; ) Detectar qual o tipo predominante do cassete cromossômico estafilocóccico (SCCmec) dentre as amostras de MRSA isoladas nos diferentes períodos; ) Detectar o gene da toxina de Panton-Valentine leucocidina nas amostras de MRSA adquiridos na comunidade (CA-MRSA); ) Verificar a existência de linhagens predominantes de MRSA por meio da técnica de eletroforese sob campo pulsado (PFGE) e restrição-modificação (restriction modification- RM) nos diferentes períodos;

22 Revisão de Literatura. REVISÃO DE LITERATURA. Staphylococcus aureus 0 O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaceae é composto por mais de 0 espécies diferentes, das quais já foram isoladas de amostras biológicas humanas. Apresentam-se sob a forma de cocos isolados ou agrupados, coram-se em violeta pelo método de coloração de Gram e medem cerca de 0, a,µm. O S. aureus, considerado o principal patógeno desse gênero, é imóvel, não esporulado e anaeróbio facultativo. As colônias em meio sólido são usualmente lisas e convexas, podendo apresentar pigmentação amarelo ou amarelo-alaranjado, que se torna pronunciada após incubação à temperatura ambiente. Além disso, algumas cepas podem provocar β-hemólise em Agar sangue após incubação a ºC em atmosfera ambiente (BANNERMAN et al., 00, p.0)... Patogênese 0 As infecções mais comuns causadas por S. aureus podem ser superficiais (atingindo a pele e tecidos moles) ou profundas (nos ossos e articulações, válvulas cardíacas, pulmões, trato urinário e corrente sanguínea); ou ainda mediadas por toxinas, tais como, intoxicação alimentar, síndrome da pele escaldada e síndrome do choque tóxico (BANNERMAN et al., 00, p.0). Os S. aureus possuem genes localizados no cromossomo ou em elementos móveis que codificam uma variedade de fatores de virulência que medeiam à colonização do hospedeiro, invasão da pele lesada e mucosa, disseminação através do corpo e a evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro (FERRY et al., 00). A virulência é determinada

23 Revisão de Literatura essencialmente por proteínas da parede celular, como a proteína A, que atua na resistência à fagocitose, e proteínas que se ligam às moléculas de adesão e reconhecem à matriz extracelular agrupadas sob a sigla MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules); além de substâncias extracelulares tais como citolisinas (α, β, δ, γ toxinas e leucocidinas), toxinas esfoliativas (ETA, ETB, ETC e ETD), toxina- da síndrome do choque tóxico (TSST-, toxic shock syndrome toxin-) e várias enterotoxinas (SE; do inglês: staphylococcal enterotoxins) como a SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG-SEQ. Essas toxinas são superantígenos, capazes de induzir a liberação maciça de citocinas por macrófagos e células T (FERRY et al., 00; BANNERMAN et al., 00, p.0). 0. Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) 0 Os S. aureus vêm sucessivamente adquirindo resistência aos diversos antimicrobianos de uso corrente, todavia a resistência considerada de maior impacto é aos β-lactâmicos. Em 0, quando a penicilina foi introduzida, apenas a % dos S. aureus eram resistentes a esse antibiótico, no entanto, essa taxa aumentou para %, em 0, devido à aquisição de um plasmídio que codifica uma penicilinase (β-lactamase), enzima que inativa o antibiótico por hidrólise do anel β-lactâmico (BRUMFITT & HAMILTON-MILLER, ). A introdução das primeiras penicilinas semi-sintéticas resistentes às β-lactamases, meticilina e oxacilina, em -0, permitiu uma melhoria da situação, no entanto, já em, na Europa, surgiram as primeiras amostras de S. aureus resistentes a essa nova classe de penicilinas (BRUMFITT & HAMILTON-MILLER, ). Essas amostras foram então denominadas de MRSA, ou seja, S. aureus resistentes à meticilina.

24 Revisão de Literatura 0 0 Nas décadas de 0 e 0, os MRSA eram responsáveis somente por surtos esporádicos, embora algumas vezes graves, de infecções hospitalares (CASEWELL, ; JEPSEN, ). Entretanto, a partir de 0, esses microrganismos, os quais são definidos atualmente por apresentarem valores de concentração inibitória mínima superiores a µg/ml para a oxacilina, tornaram-se um dos principais patógenos de infecções hospitalares em âmbito mundial, sendo considerados endêmicos em muitos hospitais (TOWNSEND et al., ; MULLIGAN et al., ; CHAMBERS & NEU, ; CLSI, 00). A resistência do S. aureus à meticilina ou oxacilina se deve à aquisição dos genes que codificam as transpeptidases e carboxipeptidases, denominadas de penicillin-binding proteins (PBPs). Essas enzimas são responsáveis pela síntese da parede celular bacteriana e constituem alvos de ação dos antibióticos β-lactâmicos. Os estafilococos produzem quatro tipos de PBPs, denominadas PBP a (STAPLETON & TAYLOR, 00). As amostras de MRSA expressam um subtipo de PBP denominada de PBPa ou PBP, codificada pelo gene meca. Essa PBPa possui afinidade reduzida não somente à meticilina ou oxacilina, mas a todos os demais antibióticos β-lactâmicos (KATAYAMA et al., 000). O gene meca é um segmento de DNA exógeno de,kb que está inserido em um elemento genético móvel denominado de cassete cromossômico estafilocóccico mec (SCCmec), o qual se encontra localizado em um sítio específico do cromossomo do S. aureus, próximo ao ponto de origem de replicação do DNA (SONG et al., ; ITO et al., ; KATAYAMA et al., 000). O SCCmec já foi encontrado em espécies de estafilococos coagulase-negativos dos quais se presume que tenha sido transferido para o S. aureus (SUZUKI et al., ; KREISWIRTH et al., ). Até o presente, o SCCmec não foi encontrado em nenhum outro gênero bacteriano.

25 Revisão de Literatura 0 O elemento SCCmec além de carrear o complexo do gene mec, o qual possui o gene meca, seus genes regulatórios (mecr e meci) e sequências de inserção (IS), carreia ainda genes específicos denominados de ccr (cassete cromossômico de recombinação), que consiste de três genes adjacentes (ccra, ccrb e ccrc) e são responsáveis pela mobilidade do elemento e das sequências próximas (KONDO et al., 00). O restante do DNA presente no SCCmec é designado como região Junkyard (ou região J) que significa sucata em inglês. Nesta região se encontram vários genes ou pseudogenes, que aparentemente não são usados pelas células bacterianas, e genes que codificam resistência a vários antibióticos não β-lactâmicos e metais pesados que estejam localizados em plasmídios ou transposons (ITO et al., 00). A transcrição do gene meca é regulada por dois genes distintos, mecr e meci. O gene mecr é responsável por codificar um sensor-transdutor de membrana (MecR) do gene meca que consiste de dois domínios: o extracelular (sensor de penicilina) e o intracelular (atravessador de membrana). O gene meci codifica um forte repressor (MecI) do gene meca. A ligação do indutor (meticilina ou oxacilina) ao sensor de penicilina desencadeia a clivagem do sensor-transdutor resultando na ativação de um uma protease intracelular denominada metaloprotease. Esta protease cliva o repressor MecI permitindo a transcrição do meca (Figura ). Sendo assim, amostras que apresentam mecr e meci intactos podem apresentar sensibilidade à meticilina em testes fenotípicos de suscetibilidade (HIRAMATSU, ; BERGER-BÄCHI & ROHRER, 00) 0

26 Revisão de Literatura 0 0 Figura. Representação ilustrativa da ação dos genes regulatórios do gene meca (Adaptado de Berger-Bächi & Rohrer, 00). A detecção da resistência à oxacilina em cepas de S. aureus tem sido dificultada devido a variabilidade nas técnicas padronizadas usadas. As cepas resistentes são frequentemente heterorresistentes aos antibióticos β-lactâmicos, de modo que duas subpopulações (uma sensível e outra resistente) coexistem numa mesma cultura. Cada célula na população pode carregar a informação genética para resistência, mas somente uma pequena fração (0 a 0 ) pode realmente expressar o fenótipo resistente sob condições de teste in vitro. A população resistente geralmente cresce mais lentamente que a população suscetível e, portanto, pode não ser detectada quando realizado o teste in vitro. O sucesso da detecção das cepas heterorresistentes depende muito da promoção do crescimento das subpopulações resistentes, o que é favorecido por ph neutro, temperaturas mais baixas (0 a ºC), presença de NaCl ( a %), e possivelmente por incubação prolongada (até horas) (SWENSON, 00; BERGER-BÄCHI & ROHRER, 00; STAPLETON & TAYLOR, 00).

27 Revisão de Literatura 0 Cinco diferentes classes do complexo do gene mec têm sido descritas (KATAYAMA et al., 00). Na classe A, os genes mecr e meci se apresentam intactos. Na classe B, o domínio sensor de penicilina do mecr e o gene meci inteiro estão truncados por uma cópia parcial de IS. A classe C apresenta variantes, C e C. Na C, o domínio sensor de penicilina do mecr e o gene meci inteiro estão truncados pela IS e na C, os dois domínios do mecri (atravessador de membrana e sensor de penicilina), juntamente com o meci estão truncados por IS. Na classe D, o gene meci está deletado e o domínio sensor de penicilina do mecr está truncado. Com base na combinação das classes do gene mec (A, B, C e D) com os alótipos do gene ccr (A, B e C e subtipos), oito tipos de SCCmec (I a VIII) foram descritos até a presente data (Figura ). No entanto, os tipos de SCCmec podem ser diferenciados em subtipos dependendo das variações nas regiões J (CHAMBERS & De LEO, 00; MALACHOWA & De LEO, 00). O SCCmec tipo I ( Kb), que carrega mec classe B e ccr tipo A e B; SCCmec tipo II ( Kb), com mec classe A e ccr tipo A e B; SCCmec tipo III ( Kb), com mec classe A e ccr tipo A e B; SCCmec tipo IV (- Kb), com mec classe B e ccr tipo A e B, SCCmec tipo V ( Kb), com mec classe C e ccr tipo C, SCCmec tipo VI ( Kb), com mec classe B e ccr tipo A e B, SCCmec tipo VII (- Kb), com mec classe C ou C e ccr tipo C e C e mais recentemente o SCCmec tipo VIII ( Kb), com mec classe A e ccr tipo A e B.

28 Revisão de Literatura 0 Figura. Representação ilustrativa dos tipos de SCCmec (Fonte: Malachowa & De Leo, 00). 0 Os elementos SCCmec tipo I, II, III, VI e VIII, em geral, estão associados a centros hospitalares. Diferentemente, os tipos IV, V ou VII têm sido amplamente disseminados entre amostras de MRSA da comunidade, denominadas de CA-MRSA (CHAMBERS & De LEO, 00; MURRAY et al., 00). Os SCCmecIV e V contêm o gene meca como único determinante de resistência, sendo a resistência frequentemente limitada aos antibióticos β-lactâmicos, além disso, são relativamente pequenos em tamanho o que confere mobilidade e habilidade de transferência entre as estirpes (DEURENBERG et al., 00; APPELBAUM, 00). Diferentemente, os

29 Revisão de Literatura 0 0 SCCmec tipo II e III transportam genes adicionais que conferem resistência a metais pesados e outras drogas além dos β-lactâmicos. Devido ao seu tamanho maior, a transferência horizontal é mais difícil, quando comparados com os tipos IV e V, e a disseminação desses elementos ocorre principalmente como resultado da pressão seletiva da exposição a antibióticos (DEURENBERG et al., 00; ZETOLA et al., 00). Vários estudos de genotipagem usando diferentes técnicas moleculares têm demonstrado que os MRSA apresentam linhagens divergentes, o que indica que o MRSA surgiu a partir da introdução do SCCmec em linhagens distintas de S. aureus sensíveis a meticilina (MSSA) em várias ocasiões visto que há diferentes tipos estruturais de SCCmec (GRUNDMANN et al., 00). Apesar dessas diferenças, poucos são os clones epidêmicos de MRSA encontrados no ambiente hospitalar, o que reforça a teoria de que sucessivas alterações genômicas levaram a evolução apenas daqueles clones que apresentavam uma melhor combinação de fatores, dentre eles a resistência a antimicrobianos, transmissibilidade e virulência. Por muitos anos as infecções causadas pelo MRSA eram restritas a hospitais, todavia infecções adquiridas na comunidade causadas por CA-MRSA têm sido documentadas de modo crescente em indivíduos saudáveis, principalmente crianças e adultos jovens sem nenhum fator de risco para infecções hospitalares (SAID-SALIM, MATHEMA & KREISWIRTH, 00). As amostras de CA-MRSA não apresentam relação com clones de MRSA adquiridos em hospitais, além disso, apresentam uma maior susceptibilidade aos antimicrobianos, com resistência, em geral, apenas aos β-lactâmicos, enquanto que os MRSA adquiridos no hospital são multirresistentes (RIBEIRO et al., 00). Outra característica que pode ser observada no CA-MRSA é a presença da toxina Panton-Valentine leucocidina (PVL), fator de virulência capaz de destruir leucócitos humanos e infligir grave dano tecidual, estando relacionada com

30 Revisão de Literatura lesões necróticas de pele e grave pneumonia necrotizante, geralmente associada a uma alta letalidade (PALAVECINO, 00). Acredita-se que a aquisição de SCCmec menores e dos gene luksf, que codifica a toxina PVL, foram eventos genéticos que favoreceram a disseminação do MRSA na comunidade (VANDENESCH et al., 00). Recentemente, no entanto, tem sido relatado um aumento no número de casos de infecções hospitalares por esse microrganismo que apesar de não ser multirresistente é considerado mais virulento (RIBEIRO et al., 00).. Epidemiologia molecular dos MRSA 0 0 Uma variedade de métodos tais como PFGE, MLST, tipagem de SCCmec e do gene da proteína A (spa- S. aureus protein A) tem sido usado no estudo da epidemiologia molecular e evolução dos MRSA (DEUREMBERG et al., 00). Todavia, nenhum método é superior a outro, assim uma combinação de dois ou mais métodos tem demonstrado resultados mais satisfatórios (AIRES DE SOUSA & DE LENCASTRE, 00; VINDEL et al., 00). A PFGE é considerado o padrão ouro para tipagem de MRSA por apresentar um alto poder discriminatório e de reprodutibilidade na avaliação de surtos e transmissão do MRSA entre hospitais. Este método é baseado na digestão do DNA cromossomal com a enzima de restrição SmaI seguida por eletroforese em gel de agarose. Alterações na sequência de nucleotídeos são refletidas nos padrões de restrição pela endonuclease do DNA cromossômico quando os fragmentos são separados em gel de agarose. A MLST é uma excelente ferramenta para investigação da evolução clonal do MRSA. Este método é baseado na análise da sequência de fragmentos com aproximadamente 00pb de

31 0 Revisão de Literatura 0 0 sete genes conservados (denominados housekeeping), resultando em um perfil alélico ou sequence type-st (DEUREMBERG et al., 00). O sequenciamento da região polimórfica X do gene da proteína A estafilocócica (spa), tem sido proposto como método alternativo para tipagem de S. aureus. A região polimórfica X consiste de um número variado de repetições de pb, com diversidade atribuída às deleções e duplicações das repetições e, mais raramente, a pontos de mutações. Apesar do sequenciamento da spa possuir vantagens em termos de velocidade de execução, facilidade de uso e interpretação, não apresenta o poder discriminatório e de resolução da PFGE na detecção de subtipos clonais (DEUREMBERG et al., 00). Comparando o perfil alélico obtido pelo MLST verificou-se que a maioria das linhagens pandêmicas de MRSA podem ser agrupadas em complexos clonais (CC) CC, CC, CC, CC, CC0 e CC (ENRIGHT et al., 00; COCKFIELD et al. 00). Amostras de S. aureus são agrupadas em um mesmo CC quando pelo menos dos genes hausekeeping tem sequências idênticas (DEUREMBERG et al., 00). O fato dos métodos baseado em sequenciamento de DNA serem caro, demorado e laborioso, um sistema de PCR denominado restriction-modification (RM) foi desenvolvido por Cockfield et al., (00). O teste RM identifica amostras de MRSA como pertencentes a um dos mais comuns CCs. Este teste baseia-se em três PCRs para as variantes do gene hsds, pertencente a um sistema de RM (restrição-modificação) que detecta e digere DNA estranho e que apresentam sequências únicas encontradas em cada linhagem de MRSA Estudos, realizados em diferentes países, baseados em PFGE, MLST e tipos de SCCmec tem identificados principais clones pandêmicos de MRSA associados ao hospital incluindo o Ibérico (MRSA relacionado ao USA00; ST-SCCmecI; CC), Brasileiro/Húngaro (BEC; ST-SCCmecIII; CC), Nova Iorque/Japão (USA00; ST-

32 Revisão de Literatura SCCmecII; CC), Pediátrico (USA00; ST-SCCmecIV ou VI; CC), EMRSA- (Barnim epidêmico; ST-SCCmecIV; CC), EMRSA- (USA00; ST-SCCmecII; CC0) e Berlin (USA00; ST-SCCmecII/IV; CC) (ENRIGHT, 00; OLIVEIRA, TOMASZ, De LENCASTRE, 00). No Brasil, o clone epidêmico brasileiro (BEC) é o predominante no ambiente hospitalar, tendo sido encontrado também em outros países como Argentina, Uruguai, Paraguai, Chile, Portugal, Itália e República Checa (OLIVEIRA, TOMASZ & LENCASTRE, 00). Com relação ao CA-MRSA, tem sido observado um número muito maior de clones os quais são diferentes dos clones epidêmicos de MRSA hospitalar. 0. Resistência à vancomicina 0 Como as infecções causadas por MRSA multirresistentes têm se tornado cada vez mais frequentes, a vancomicina tornou-se a principal opção terapêutica (CHAMBERS, ). Contudo, o uso constante deste antimicrobiano, também no tratamento de infecções por outros agentes, trouxe como consequência evolutiva o aparecimento de amostras de S. aureus resistentes à vancomicina (VRSA) ou de amostras com resistência intermediária à vancomicina (VISA) (CHANG et al., 00; HIRAMATSU et al., a). Recentemente, novos agentes antimicrobianos como a linezolida, daptomicina e tigeciclina estão sendo usado, podendo auxiliar no combate ao S. aureus multirresistente (SCHITO, 00) A vancomicina foi introduzida na prática terapêutica em, entretanto o primeiro isolado de S. aureus com susceptibilidade reduzida à vancomicina (VISA) foi identificado no Japão em (HIRAMATSU et al., a). Desde então, outros isolados de VISA foram sendo descritos em vários países, inclusive no Brasil (OLIVEIRA et al., 00). A prevalência de VISA no mundo é variável, apresentando taxas que vão de 0% a %, como descrito por

33 Revisão de Literatura 0 0 Liu e Chambers (00). A primeira infecção clínica por VRSA foi descrita em 00 em Michigan nos EUA e, apenas dois meses depois, um segundo VRSA foi isolado na Pennsylvania (CDC, 00; CHANG et al., 00). Posteriormente, mais dois casos de VRSA foram descritos também nos EUA (APPELBAUM, 00). No Brasil, amostras de estafilococos coagulase-negativos resistentes a vancomicina foram isoladas de indivíduos saudáveis (PALLAZO et al., 00). A partir de 00 o CLSI alterou o breakpoint de susceptibilidade à vancomicina de para µg/ml (CLSI, 00) visto que falhas no tratamento com o uso da vancomicina haviam sido anteriormente relatadas em pacientes com infecções causadas por MRSA considerados sensíveis a esse antimicrobiano. Além disso, não obstante a maioria das amostras de MRSA serem sensíveis à vancomicina in vitro, a concentração bactericida mínima (CBM) tem aumentado ao longo de várias décadas (STEVENS, 00). Em estudo realizado por Sakoulas et al. (00), no qual se avaliou eficácia da vancomicina pela relação entre o CIM e a atividade bactericida, observou-se uma melhor resposta clínica em pacientes com infecções causadas por MRSA que apresentavam valores menores de CIM para vancomicina. Os autores concluíram que o risco na falha do tratamento dessas infecções começa a surgir com aumento da CIM para vancomicina, mesmo que esta ainda esteja dentro dos parâmetros de sensibilidade preconizados atualmente pelo CLSI. A vancomicina é um glicopeptídeo que atua sobre a parede celular, reconhecendo e ligando-se à terminação D-alanina-D-alanina do pentapeptídeo inibindo sua incorporação no peptideoglicano crescente das paredes celulares. Os mecanismos de resistência à vancomicina apresentado pelas amostras de VISA e VRSA são distintos (Figuras e ) Nas amostras VISA que apresentam valores de concentração inibitória mínima (CIM) para a vancomicina entre -μg/ml, a diminuição da sensibilidade se dá a partir de alterações

34 Revisão de Literatura 0 na biossíntese do peptidoglicano (CLSI, 0; HIRAMATSU et al., b; LOWY, 00). Estes isolados apresentam síntese adicional de peptidoglicano, resultando em um espessamento da parede celular e uma diminuição das ligações cruzadas das camadas do peptidoglicano, com exposição de maior quantidade de resíduos de D-alanina-D-alanina (HANAKI et al., ). Assim, a vancomicina se liga a estes resíduos impedindo que outras moléculas da droga alcancem e liguem-se nos seus alvos intracelulares (Figura ). Todavia, o mecanismo molecular ainda não é conhecido. Em relação aos VRSA, com CIM µg/ml, a resistência é causada por alteração no peptídeo terminal para D-alanina-D-lactato no lugar de D-ala-D-ala, impedindo que a vancomicina se ligue ao sítio alvo (Figura ) (LOWY, 00). Acredita-se que estas alterações são resultado da transferência, por conjugação, do operon vana de amostras de Enterococcus faecalis resistentes a vancomicina (VRE) para os estafilococos (SHOWSH et al., 00). O operon vana integra o Transposon Tn composto de vanr, vans, vanx, vany e vanh, presentes em um plasmídio de 0 Kb (TENOVER, 00).

35 Revisão de Literatura 0 Figura. Representação ilustrativa do mecanismo de resistência do Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária à vancomicina (VISA) (Adaptada de Lowy, 00). 0 Figura. Representação ilustrativa do mecanismo de resistência dos Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA) (Adaptada de Lowy, 00).

36 Metodologia. METODOLOGIA O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório da Disciplina de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN) da UFTM após obtenção do parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (Anexo ).. Amostragem 0 0 O estudo foi realizado com amostras de S. aureus consecutivamente isoladas no setor de Microbiologia do Serviço de Patologia Clínica (SPC), de pacientes internados no HC/UFTM, durante o período de janeiro a dezembro de e janeiro a dezembro de 00. Apenas uma amostra de S. aureus por paciente foi incluída no estudo. O Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro é um hospital terciário de ensino, possuem leitos distribuídos em várias especialidades médicas e cirúrgicas, bem como 0 leitos de unidades de terapia intensiva. As amostras que foram obtidas em, durante a execução de outro projeto de pesquisa, encontravam-se estocadas à 0 C em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) com 0% de glicerol (OLIVEIRA et al., ). As amostras isoladas em 00 foram estocadas em microtubos contendo caldo BHI com 0% de glicerol, à medida que eram obtidas.. Confirmação da espécie No Laboratório da Disciplina de Microbiologia/ICBN, as amostras de S. aureus foram

37 Metodologia caracterizadas com base em sua morfologia e comportamento tintorial pelo método de coloração de Gram, produção de catalase, coagulase, DNAse e fermentação do manitol como testes mínimos (KONEMAN et al., 00)... Coloração pelo método do Gram 0 A partir de colônias isoladas em Agar BHI foram feitos esfregaços, os quais, após fixados, foram cobertos com solução de cristal violeta por minuto. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente e cobertas com lugol por minutos. Após nova lavagem em água corrente, os esfregaços foram descorados com álcool/acetona, sendo então novamente lavados em água corrente. Posteriormente, os esfregaços foram cobertos com uma solução de fucsina de Gram por 0 segundos. Após secagem, as lâminas foram observadas ao microscópio em aumento de 000x. As amostras caracterizadas como cocos Gram-positivos foram avaliadas pelo teste da catalase... Teste da catalase 0 Uma porção da colônia isolada a partir de um cultivo de - horas a ºC foi transferida para um tubo de ensaio estéril contendo peróxido de hidrogênio a %. A imediata produção de efervescência indica a conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio gasoso, caracterizando o gênero Staphylococcus. As amostras catalase positivas foram analisadas quanto ao teste da coagulase, fermentação do manitol e teste da DNAse.

38 Metodologia POS NEG Figura. Teste da catalase 0.. Teste da coagulase O teste tem a finalidade de demonstrar a produção da enzima coagulase pelos estafilococos e foi realizado emulsionando algumas colônias do microrganismo em um tubo de ensaio estéril contendo 0,mL de caldo BHI adicionado de 0,mL de plasma. Após incubação a C, foi verificada, de hora em hora até horas e posteriormente com horas, presença de um coágulo visível indicando, presuntivamente, que os microrganismos pertenciam à espécie S. aureus. 0 POS NEG Figura. Teste da coagulase

39 Metodologia.. Fermentação do manitol O Agar manitol é um meio seletivo e diferencial que contém alto teor de cloreto de sódio (,%) inibindo o desenvolvimento de outras bactérias Gram-positivas, bem como as Gramnegativas. Uma colônia isolada foi semeada na superfície do meio e a placa incubada por até horas a C. O crescimento de colônias amarelas indicou, de forma presuntiva, a identificação de S. aureus. 0 NEG POS Figura. Fermentação do manitol.. Teste da DNAse 0 O teste da DNAse foi realizado semeando uma colônia bacteriana em placa de Petri contendo Agar DNAse. Após incubação de horas, a C, a revelação do teste foi realizada adicionando-se HCl (0,N) sobre o meio de cultura. O aparecimento de um halo claro ao redor do crescimento bacteriano indicou que o teste era positivo, confirmando a identidade do S. aureus.

40 Metodologia Figura. Teste da DNAse 0. Detecção do gene meca Todas as amostras de S. aureus obtidas em e em 00 foram submetidas à técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) para detecção do gene meca... Extração do DNA 0 A extração do DNA bacteriano foi feita pela técnica de lise térmica. Amostras de S. aureus foram semeadas em Agar BHI e incubadas por h, a ºC. Posteriormente, foi feita uma suspensão bacteriana em microtubo contendo 00μL de tampão TE (Tris mm ph,; EDTA mm ph,0), e esta suspensão centrifugada por minutos a.000xg. O sobrenadante foi removido, o sedimento ressuspenso em 00μL de TE e fervido por 0 minutos. Após fervura, a suspensão foi centrifugada por minuto a.000xg e o sobrenadante transferido para outro microtubo para ser estocado à -0 C ou imediatamente

41 0 Metodologia usado na reação de PCR... Reação de amplificação para o gene meca 0 A PCR foi executada com µl de reação contendo uma mistura equivalente de dntps (00μM, concentração final de cada), 00μM de cada primer MECAP ( - TCCAGATTACAACTTCACCAGG- ) e MECAP ( -CCACTTCATATCTTGTAACG- ),,U de Taq DNA polimerase, 00ng de DNA molde, μl do tampão da enzima e μm de cloreto de magnésio (OLIVEIRA & LENCASTRE, 00). A amplificação da PCR foi feita em um termociclador Gene Amp PCR System 00 (APPLIED BIOSYSTEMS), programado de acordo com as seguintes etapas: desnaturação a ºC por minutos, 0 ciclos a ºC por 0 segundos, anelamento a ºC por 0 segundos, extensão a ºC por minuto, e uma extensão final a ºC por minutos... Análise do produto da PCR 0 O produto da PCR foi aplicado em gel de agarose a,% em tampão TAE X (Trisacetato, 0mM; EDTA mm, ph,0), e a corrida eletroforética foi realizada a 0 V. Após a corrida, o gel foi corado com brometo de etídio e observado em luz ultravioleta (UV). O tamanho do produto amplificado foi de pb.

42 Metodologia. Perfil de sensibilidade a antimicrobianos 0 0 O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de uso corrente no tratamento de infecções estafilocócicas foi realizado pelo teste de disco difusão, conforme preconiza o manual do Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI (00). Os antimicrobianos testados e as suas respectivas concentrações nos discos foram: cefoxitina (0 g), cloranfenicol (0 g), ciprofloxacina ( g), clindamicina ( g), eritromicina ( g), gentamicina (0 g), linezolida (0µg), norfloxacina (0 g), rifampicina ( g), sulfametoxazol-trimetoprim (,/, g), tetraciclina (0 g) (DME, São Paulo, Brasil). Para a realização desta técnica utilizou-se o ágar Mueller-Hinton (Oxoid, Inglaterra) esterilizado em autoclave e distribuído em placas de Petri de 0x0mm de diâmetro a uma espessura de mm. O inóculo bacteriano foi preparado em solução fisiológica estéril a partir de uma cultura com - horas de crescimento e ajustado para que sua turbidez fosse equivalente à solução padrão da escala 0, de Mac Farland, contendo aproximadamente a x 0 UFC/mL. Essa suspensão foi semeada com um swab estéril, de forma homogênea, em toda superfície do meio. Em seguida, os discos com antimicrobianos foram distribuídos com auxílio de uma pinça e o ágar incubado em estufa a C. A leitura foi realizada após horas completas de incubação para vancomicina e oxacilina e a 0 horas para os demais antimicrobianos. Os halos de inibição foram medidos e comparados com a tabela C do CLSI (00) para classificação dos microrganismos em sensíveis, intermediários ou resistentes. A qualidade do meio Mueller-Hinton e dos discos de antimicrobianos foi avaliada testando a cepa padrão de Staphylococcus aureus ATCC (American Type Culture Collection)

43 Metodologia, conforme preconizado pelo CLSI. 0 Figura. Teste de disco difusão para determinação do perfil de sensibilidades aos antimicrobianos. Teste de resistência induzida à clindamicina (fenótipo MLS B i ) 0 O teste foi realizado segundo metodologia descrita por Fiebelkorn et al. (00), para as amostras com perfil fenotípico de resistência à eritromicina e sensibilidade à clindamicina. A partir do crescimento bacteriano em placas de BHI foi obtida uma suspensão em solução salina com turbidez equivalente à solução padrão da escala 0, de McFarland, contendo aproximadamente a x 0 UFC/mL. A suspensão foi semeada com um swab estéril, de forma homogênea, em toda superfície do meio Agar Mueller-Hinton (Oxoid, Inglaterra). Posteriormente, os discos de clindamicina (μg) e eritromicina (μg) foram distribuídos, com auxílio de uma pinça, sobre

44 Metodologia a superfície do meio separados por uma distância de aproximadamente mm, medida de centro a centro dos discos. A leitura do teste foi realizada após horas de incubação a ºC. A eritromicina presente no disco difunde-se pelo Agar induzindo a resistência à clindamicina. A observação de um achatamento no halo de inibição do crescimento adjacente ao disco de eritromicina (formação da Zona D), indicou teste positivo para o fenótipo de resistência induzida (fenótipo i MLS ), e a amostra foi considerada resistente à clindamicina. B. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) 0 A concentração inibitória mínima (CIM) para oxacilina foi determinada pela microdiluição em caldo e para vancomicina pela microdiluição em caldo, macrodiluição em caldo e Etest Os testes foram realizados ao mesmo tempo e utilizando a mesma suspensão bacteriana. As diluições fornecidas pelo Etest foram testadas pelos testes de diluição em caldo. Para controle de qualidade dos testes foi usada a cepa padrão de Staphylococcus aureus ATCC (American Type Culture Collection), conforme preconizado pelo CLSI. 0.. Microdiluição em caldo A microdiluição em caldo foi realizada em placas de microtitulação estéreis, utilizando o caldo Mueller-Hinton ajustado com cátions (Oxoid, Inglaterra) para vancomicina e o caldo

45 Metodologia 0 0 Mueller-Hinton ajustado com cátions suplementado com % de NaCl para oxacilina, conforme descrito pelo CLSI (00). Soluções-estoque 0 vezes concentradas de oxacilina e vancomicina foram preparadas em água destilada e esterilizadas por filtração (filtro Millipore com poro de 0,µm) na concentração de 0µg/mL e 0µg/mL, respectivamente. Posteriormente, uma diluição intermediária das soluções-estoque foram feitas em caldo Mueller-Hinton na proporção de :0. Em placa de microtitulação foram feitas diluições seriadas desta solução intermediária (0µL) em caldo Mueller-Hinton (0µL). Em seguida, foram adicionados, 00µL de uma suspensão bacteriana com turvação correspondente ao tubo n 0, da escala de Mac Farland preparada a partir de uma cultura de - horas, a C e diluida em uma proporção de :00 em caldo Mueller-Hinton. A placa de microtitulação foi incubada em estufa a C e a leitura da CIM feita após horas de incubação. Para cada amostra testada foi utilizado um controle positivo, contendo o caldo e a suspensão bacteriana e um controle negativo contendo apenas o caldo Mueller-Hinton. A CIM foi considerada como a menor concentração de antimicrobiano que inibiu completamente o crescimento do microrganismo, conforme detectado a olho nu. Para a oxacilina, valores de CIM µg/ml indicam sensibilidade e valores µg/ml indicam que o S. aureus é resistente a oxacilina. Para a vancomicina, as amostras com CIM µg/ml são consideradas sensíveis; valores entre e µg/ml indicam resistência intermediária e µg/ml indicam resistência (CLSI, 00).

46 Metodologia µg/ml,0,0,0,0 0, CP CN Figura 0. Teste de microdiluição em caldo para determinação da CIM 0.. Macrodiluição em caldo 0 A macrodiluição em caldo foi realizada em tubos de ensaio utilizando o caldo Mueller-Hinton ajustado com cátions (Oxoid, Inglaterra). Soluções-estoque 0 vezes concentradas de vancomicina foram preparadas em água destilada e esterilizadas por filtração (filtro Millipore com poro de 0,µm) na concentração de 0 µg/ml. Posteriormente, uma diluição intermediária da solução-estoque foi feita em caldo Mueller-Hinton na proporção de :0. Em tubos de ensaio foram feitas diluições seriadas desta solução intermediária (00µL) em caldo Mueller-Hinton (00µL). Em seguida, foram adicionados, 000µL de uma suspensão bacteriana com turvação correspondente ao tubo n 0, da escala de Mac Farland preparada a partir de uma cultura de - horas, a C e diluida em uma proporção de :00 em caldo Mueller-Hinton. Os tubos de ensaio foram incubados em estufa a C e a leitura da CIM feita após horas de incubação.

47 Metodologia Para cada amostra testada foi utilizado um controle positivo, contendo o caldo e a suspensão bacteriana e um controle negativo contendo apenas o caldo Mueller-Hinton. A CIM foi considerada como a menor concentração de antimicrobiano que inibiu completamente o crescimento do microrganismo, conforme detectado a olho nu. As amostras com CIM µg/ml são consideradas sensíveis; valores entre e µg/ml indicam resistência intermediária e µg/ml indicam resistência total (CLSI, 00). 0 0, 0, 0,,0,,0,0,0,0 C+ C- µg/ml Figura. Teste de macrodiluição em caldo para determinação da CIM.. Etest 0 O teste foi realizado com tiras de Etest (AB Biodisk, Suécia) seguindo as recomendações do fabricante. As tiras de Etest foram retiradas do freezer 0 minutos antes de serem usadas para atingirem a temperatura ambiente. O inóculo bacteriano foi preparado em solução fisiológica estéril a partir de uma cultura com - horas de crescimento e ajustado para que sua turbidez fosse equivalente à solução padrão da escala 0, de Mac Farland,

48 Metodologia contendo aproximadamente a x 0 UFC/mL. A suspensão foi semeada com um swab estéril, de forma homogênea, em toda superfície do ágar Mueller-Hinton (Oxoid, Inglaterra). Após aguardar a absorção do excesso de umidade, uma tira de Etest foi aplicada com auxílio de uma pinça e o ágar incubado em estufa a C. A leitura foi realizada após horas completas de incubação O valor da CIM foi lido no ponto onde a elipse de inibição intersecta a tira. Quando obtido valores de CIM compreendidos entre duas diluições, arredondou-se para a diluição acima. 0 Figura. Etest usado na determinação da CIM da vancomicina. Caracterização Molecular 0 A caracterização molecular das amostras de MRSA isoladas no HC da UFTM foi realizada no laboratório de biologia molecular de bactérias do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes (Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ) sob a supervisão e colaboração da Profa. Dra. Agnes Marie Sá Figueiredo.

49 Metodologia.. Determinação do tipo SCCmec A tipagem do SCCmec foi realizada pela técnica de multiplex PCR segundo metodologia descrita por Boye et al. (00) modificada, utilizando-se os primers cujas sequências se encontram na Tabela... Reação de amplificação 0 A extração foi realizada conforme descrito anteriormente no item... O multiplex PCR foi executado em µl de reação contendo tampão da enzima concentrado, mm de MgCl ; 00μM de cada dntp;,µm dos primers β, α, ccrcf e ccrcr (concentração final de cada) e 0,µM, dos primers F, R, RmecA e R (concentração final de cada); U de Taq DNA polimerase e 00ng de DNA molde. A amplificação do PCR foi feita em um termociclador GeneAmp PCR System 00 (PE Applied Biosystems), com os seguintes parâmetros: pré-desnaturação por min. à ºC; 0 ciclos de 0 s à ºC, 0 s à ºC e min. à ºC; pós-extensão por min. a ºC (BOYE et al., 00). A análise do PCR foi realizada conforme descrito no item...

50 Metodologia Tabela. Tipagem do SCCmec proposto por Boye et al. (00). Nome Sequência de oligonucleotídeos ( ) Tamanho (pb) Β α ccrcf ccrcr F R RmecA R ATTGCCTTGATAATAGCCYTCT TAAAGGCATCAATGCACAAACACT CGTCTATTACAAGATGTTAAGGATAAT CCTTTATAGACTGGATTATTCAAAATAT GCCACTCATAACATATGGAA CATCCGAGTGAAACCCAAA TATACCAAACCCGACAACTAC CGGCTACAGTGATAACATCC bp bp bp bp. Detecção do gene da toxina de Panton-Valentine leucocidina (PVL) 0 A extração do DNA foi realizada conforme descrito anteriormente no item... A detecção do gene lukf foi realizada pela técnica de PCR segundo metodologia descrita por Ribeiro et al. (00). O PCR foi executado em µl de reação contendo tampão da enzima concentrado, mm de MgCl; 00μM de cada dntps; 00nM dos primers PVL- ( - ATCCGAGAGACTATTTTGTGC- ) e NPVL- ( -CATCAACCTTTTTCTCACTTAC- ); U de Taq DNA polimerase e 00ng de DNA. A amplificação do PCR foi feita em um termociclador, com os seguintes parâmetros: pré-desnaturação por min. à ºC; 0 ciclos de 0 s à ºC, 0 s à ºC e min. à ºC; pós-extensão por min. à ºC.

51 0 Metodologia A análise do PCR foi realizada conforme descrito no item.... Eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) 0 0 As amostras bacterianas foram submetidas à eletroforese em gel sob campo pulsado (TEIXEIRA et al., ) e os padrões de banda foram interpretados de acordo com os critérios descritos por Tenover et al. (). Os microrganismos foram cultivados em ml de caldo BHI por h a ºC e 00µL desta cultura foi centrifugada a.000 rpm por min. em tubos de micro centrifuga. Posteriormente, as células foram lavadas em 00µL de tampão PIV (TrisHCl 0,0M, NaCl M) previamente autoclavado e novamente centrifugada. As células lavadas foram ressuspensas em 00µL de PIV e a densidade óptica ajustada para obtenção de 0 UFC/mL. A suspensão bacteriana foi misturada com igual volume de agarose de baixo ponto de fusão (Seakem Lê; FMC Bioproducts) a,% em tampão TBE (TrisHCl 0mM, ácido bórico 0mM, EDTA mm), para formação dos blocos. Após solidificação, os blocos de agarose contendo a bactéria foram incubados em tampão EC-lise (TrisHCl mm, NaCl M, EDTA 0,M, deoxicolato 0,%, sarcosil 0,%, mg/ml de RNAse e mg/ml de lisostafina) a ºC por horas. Posteriormente os blocos foram incubados em tampão ESP (EDTA 0,M, sarcosil % e 0,mg/mL de proteinase K) por -h a ºC. Os produtos da digestão das proteínas foram removidos pela lavagem dos blocos de agarose por vezes em tampão TE (TrisHCl 0mM, EDTA mm). Os blocos foram armazenados à ºC até serem submetidos à digestão enzimática. A macrorestrição do DNA genômico foi realizado em tampão de restrição (TrisHCl mm, KCl 0mM, MgCl.HO 0,mM, 0U de SmaI) a 0ºC por horas. Após incubação,

52 Metodologia 0 os fragmentos foram analisados por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose a % em 0,X de tampão TBE (TrisHCl 0mM, ácido bórico 0mM, EDTA mm) em um aparelho CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) com intervalos de pulsos variando de a 0 segundos por horas, voltagem de volts/cm, temperatura de a C, ângulo de 0º e pump de 0. O gel foi corado em uma solução de brometo de etídio a % e os fragmentos visualizados em um transiluminador de luz ultravioleta. Foi utilizado como padrão de peso molecular DNA lambda ladder PFG marker (NEW ENGLAND Biolabs inc., EUA) 0μg, com extensão de bandas 00pb a kb. O registro das bandas separadas pela eletroforese foi feito através de fotografia, utilizando-se filme Polaroid (Polaroid; Sigma). Amostras reprentantativas dos clones internacionais BEC (BMB), USA00, USA00, USA00 foram utilizadas nos experimentos moleculares como amostras de referência.. Análise do perfil eletroforético 0 O PFGE é uma eletroforese modificada, na qual a direção da corrente elétrica sofre frequentes alterações permitindo a separação de grandes moléculas de DNA. Além disso, a enzima de restrição SmaI permite a digestão do DNA cromossômico em um número limitado de fragmentos relativamente grandes (0 00Kb). As amostras que apresentaram o mesmo tamanho e número de bandas foram caracterizadas como pertencentes a um único clone e receberam uma letra capital única. Já as amostras que apresentaram diferenças de uma a seis bandas, foram consideradas subclones de um mesmo clone e foram caracterizadas com a mesma letra capital e números diferentes. Finalmente,

53 Metodologia as amostras apresentando mais de seis bandas de diferenças foram consideradas clones diferentes e receberam letras capitais diferentes (TENOVER et al., )..0 Determinação do complexo clonal (CC) A determinação do complexo clonal foi realizada usando o teste restrição-modificação (RM) segundo metodologia descrita por Cockfield et al. (00), utilizando-se os primers cujas sequências se encontram na Tabela Reação de amplificação 0 A extração foi realizada conforme descrito anteriormente no item... O teste de restrição-modificação (RM) é baseado em três PCR para as variantes do gene hsds que controla a evolução das linhagens de S. aureus. Todas as PCR foram realizadas em µl de reação contendo 0,mM de cada primer, µl do tampão da enzima X concentrado, mm de MgCl ; dntps (00μM, concentração final de cada);,u de Taq DNA polimerase, 00ng DNA molde. A amplificação do PCR foi feita em um termociclador GeneAmp PCR System 00 (PE Applied Biosystems), com os seguintes parâmetros: pré-desnaturação por min. à ºC; ciclos de 0 s à ºC, 0 s à ºC e min. à ºC; pós-extensão por min. a ºC. A análise do PCR foi realizada conforme descrito no item...

54 Metodologia Tabela. Tipagem do complexo clonal (CC) proposto por Cockfield et al. (00) RM Nome Sequência de oligonucleotídeos ( ) Tamanho (pb) RM AF AR0 AGGGTTTGAAGGCGAATGGG CAACAGAATAATTTTTTAGTTC CC0: 0 pb CC: 0 pb AR TCAGAGCTCAACAATGATGC AF AGGGTTTGAAGGCGAATGGG RM AR AR GGAGCATTATCTGGTGTTTTCC GGGTTGCTCCTTGCATCATA CC: pb CC: 0 pb BF CCCAAAGGTGGAAGTGAAAA CC: 0 pb RM BR CCAGTTGCACCATAGTAAGGGTA CC: 0 pb BR TCGTCCGACTTTTGAAGATTG CC: 0 pb. Tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST) 0 Uma mostra previamente tipada por PFGE e SCCmec e não relacionada com as amostras de referência utilizada foram enviadas para o laboratório de biologia molecular de bactérias do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes (Universidade Federal do Rio de Janeiro- UFRJ), para a tipagem por sequenciamento de mutilocus (MLST). O MLST para os S. aureus se baseia no sequenciamento de uma região de cerca de 00pb de sete genes que codificam enzimas conservadas dos S. aureus (housingkeeping genes) e

55 Metodologia 0 posterior comparação dos alelos com um banco de dados composto de várias sequências (Enright et al., 000). O MLTS foi realizado segundo metodologia descrita em utilizando-se os primers cujas sequências se encontram na Tabela. A partir do DNA da amostra, obtido como descrito no item.., foram feitas reações de PCR (item..) em um termociclador GeneAmp PCR System 00 (PE Applied Biosystems), com os seguintes parâmetros: pré-desnaturação por min à ºC; 0 ciclos de 0s à ºC, 0 s à ºC e 0s à ºC; pós-extensão por min a ºC. A análise do PCR foi realizada conforme descrito no item.., utilizando marcador de corrida Low DNA mass ladder. O DNA amplificado foi quantificado... Purificação do produto do PCR A purificação do produto do PCR foi realizada diretamente a partir da reação de PCR, utilizando o kit GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification (Amershan Biosciences/GE Heathcare), de acordo com as recomendações do fabricante. O produto da reação purificado foi estocado a -0 C ou imediatamente sequenciado... Sequenciamento dos produtos de PCR purificados 0 O sequenciamento das duas fitas ( - e - ) foi realizado através da técnica de primer walking utilizando um sequenciador automático. O DNA foi sequenciado utilizando o kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied

56 Metodologia Biosystems). As reações de sequenciamento basearam-se na técnica de sequenciamento por terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos (ddntps). As sequências obtidas foram editadas utilizando o software Chromas Lite versão.0 e posteriormente alinhadas com o lócus ST. Tabela. Primers utilizados na PCR para tipagem por sequenciamento dos multilocus (MLST) proposto por Enright et al.(000). Primer Tamanho (pb) Sequência Produto ARC UP ARC DN TTGATTCACCAGCGCGTATTG TCAGGTATCTGCTTCAATCAGCG Carbamato quinase ARO UP ARO DN ATCGGAAATCCTATTTCACATTC GGTGTTGTATTAATAACGATATC Shikimato desidrogenase GLP UP GLP DN CTAGGAACTGCAATCTTAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC Glicerol quinase GMK UP GMK DN ATCGTTTTATCGGGACCATCTCA TTAACTACAACGTAATCGTA Guanilato quinase PTA UP PTA DN GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA Fosfato acetil transferase TPI UP TPI DN 0 TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC Triosefosfato isomerase YQI UP YQI DN CAGCATACAGGACACCTATTGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC Acetil coenzima A acetiltransferase

57 Metodologia. Obtenção de dados demográficos e clínicos dos pacientes Dados demográficos e clínicos foram obtidos pela análise dos prontuários dos pacientes no serviço de arquivo médico (SAME) do HC/UFTM.. Análise dos dados 0 Foi feita uma análise descritiva dos dados para determinar o perfil de sensibilidade, nível de resistência à oxacilina e vancomicina e a prevalência de MRSA e dos clones em cada período de obtenção das amostras. Os dados foram analisados com o programa Epi Info (CDC, Atlanta, GA) software estatístico (versão..). Os testes qui-quadrado ou exato de Fisher foram usados para comparar a sensibilidade aos antimicrobianos, as taxas de MRSA e a concentração inibitória mínima entre os dois períodos de estudo. As diferenças foram consideradas significativas quando P 0,0.

58 Resultados. RESULTADOS Um total de 0 e amostras consecutivas e não repetidas de S. aureus foram isoladas de pacientes internados no Hospital de Clínicas da UFTM no ano de e 00, respectivamente. Dentre estas amostras, (%) em e (%) em 00 foram classificadas como MRSA de acordo com os resultados dos testes fenotípicos de sensibilidade (disco difusão para cefoxitina 0µg e microdiluição em caldo para oxacilina) e confirmado pela detecção do gene meca (Figura ). A taxa de MRSA no HC da UFTM aumentou significativamente (P=0,00) do ano de para o ano de 00 (Figura ). 0. Características clínicas As amostras de MRSA isoladas no estudo foram provenientes de diferentes espécimes clínicos. Em, (,%) amostras de MRSA foram isoladas de ponta de cateter, (,%) de pele e tecidos moles, (0,%) do trato respiratório inferior, (,%) foram isolados do trato urinário e (,%) do trato respiratório superior. Em contrapartida, as amostras de MRSA isoladas em 00 eram provenientes de pele e tecidos moles (;,%), seguido dos isolados de ponta de cateter (;,%), trato respiratório inferior (;,%), corrente sanguínea (;, %) e trato urinário (n=;,%).

59 Prevalência de S. aureus (%) Resultados 0 pb 0 Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto da amplificação do gene meca (pb). Canaletas de -: amostra de S. aureus isoladas no HC da UFTM, no ano de ; Canaletas a : amostra de S. aureus isoladas no HC da UFTM, no ano de 00; canaleta : Marcador de Peso Molecular (DNA ladder: 00pb). 0 0% 0% 0% % % % * 0% 0% 0% % MSSA MRSA 0% 0% 0% 00 P=0,00 Ano de isolamento Figura. Prevalência de amostras de S. aureus resistentes à meticilina(mrsa) isoladas no HC da UFTM em e 00.

60 Resultados.Tipagem do SCCmec e detecção do gene da toxina pvl A tipagem do SCCmec foi realizada pela multiplex PCR (Figura ). Todas as amostras de MRSA isoladas em apresentavam SCCmecIII. No entanto, dentre as amostras de MRSA obtidas em 00, (,%) apresentavam SCCmecIII e (,%) diferentes tipos de SCCmec, sendo (,%) SCCmecI, (,%) SCCmecIV e (,%) SCCmecII. As amostras que apresentavam o SCCmecIV foram testadas para presença do gene lukf (Figura ), que codifica a toxina pvl, por PCR mas a amplificação do produto não foi observada pb 00 pb 00 pb Tipo de SCCmec SCCmec I - pb SCCmec II - pb SCCmec III - pb SCCmec IV - pb e pb 0 Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando a tipagem do SCCmec pela multiplex PCR. Canaleta : marcador de peso molecular (00pb); canaletas de a : amostra de MRSA isoladas no HC da UFTM apresentando SCCmec I, II, III e IV, respectivamente.

61 0 Resultados 00 pb 00 pb meca lukf 0 Figura. Eletroforese em gel de agarose mostrando produtos da amplificação dos genes meca e lukf. Canaleta : marcador de peso molecular (00pb); canaleta : amostra de S. aureus isoladas no HC da UFTM apresentando produto de amplificação do gene meca (pb); canaleta : controle negativo para o gene meca; canaleta : controle positivo para o gene lukf (0pb); canaleta a : amostra (duplicata) de S. aureus SCCmecIV isoladas no HC da UFTM não apresentando produto de amplificação para o gene lukf. clindamicina. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e resistência induzida à 0 O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras de MRSA isolados em cada período do estudo ( e 00) foi determinado pela técnica de microdiluição em caldo para oxacilina; microdiluição em caldo, macrodiluição em caldo e Etest para vancomicina e disco difusão para os demais antimicrobianos de uso corrente (Tabela ). Nenhuma amostra de MRSA foi resistente à vancomicina e à linezolida. Em ambos os períodos estudados, as

62 Resultados 0 amostras de MRSA foram altamente resistentes a eritromicina, ciprofloxacina, clindamicina, norfloxacina, gentamicina e tetraciclina. Todavia, as amostras de MRSA isoladas em 00 apresentaram um aumento estatisticamente significativo na sensibilidade ao cloranfenicol (,% versus,%; P<0.00), rifampicina (,% versus,%; P=0,00) e sulfametoxazol-trimetoprim (,% versus 0%; P=0,00) quando comparado com as amostras isoladas em. Uma grande proporção das amostras de MRSA sensíveis ao cloranfenicol (, %; de ) e a rifampicina (0,%; de ) apresentavam o SCCmecIII, enquanto que nenhuma amostra de MRSA que apresentou sensibilidade a sulfametoxazol-trimetoprim apresentava o SCCmecIII (Tabela ). No teste de resistência induzida à clindamicina, (,%) amostras de e nenhuma de 00 apresentaram resultado positivo, através da formação do halo D, indicativo i do fenótipo MLS B (resistência induzida a macrolídeos, lincozaminas e streptograminas B).

63 Resultados Tabela. Perfil de sensibilidade das amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isoladas de pacientes internados no HC da UFTM em e 00. Antimicrobianos Nº de amostras sensíveis (%) (n = ) 00 (n = ) Valor de P Cloranfenicol (,) (,) a < 0,00 Ciprofloxacina 0 (0) (,),0 Clindamicina 0 (0) (.) 0, Eritromicina 0 (0) 0 (0) Gentamicina 0 (0) (,) 0, Linezolida (00) (00) Norfloxacina 0 (0) (.) 0, Rifampicina (,) (,) b 0,00 Tetraciclina (,) (0,) 0, Sulfametoxazol-trimetoprim 0 (0) (,) c 0,00 Vancomicina (00) (00) a Trinta e uma (, %) das e b (0,%) das amostras de MRSA sensíveis ao cloranfenicol e rifampicina, respectivamente, tranportavam o SCCmecIII. c Nenhuma das oito amostras sensíveis a sulfametoxazol-trimetoprim apresentavam SCCmecIII.

64 Resultados.. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para oxacilina O nível de resistencia à oxacilina foi determinado pelo método da microdiluição em caldo e os valores foram mostrados na Tabela. Dentre as amostras isoladas em, (,%) mostraram alto nível de resistência à oxacilina com valores de CIM µg/ml e (,%) apresentaram CIM de µg/ml. Em 00, (0,%) amostras apresentaram CIM µg/ml, (,%) CIM de µg/ml, (,%) CIM de µg/ml, (,%) CIM de µg/ml e (,%) amostras apresentaram CIM para oxacilina de µg/ml. 0 Tabela. Nível de resistência à oxacilina das amostras de MRSA isoladas de pacientes internados no HC da UFTM nos anos de e 00. CIM para oxacilina Amostras isoladas em Amostras isoladas em 00 (µg/ml) n(%) n(%) (,) 0 (,) 0 (,) (,) (,) (,) (0,) TOTAL.. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina A determinação da CIM da vancomicina foi analisada pela diluição em caldo (micro e macrodiluição) e Etest e os resultados foram sumariados na Tabela. Todas as amostras de

65 Resultados 0 MRSA (isoladas em e 00) avaliadas foram sensíveis à vancomicina (CIM μg/ml), segundo os critérios atuais do CLSI (0), pelos métodos fenotípicos realizados. Não houve diferença estatística entre os períodos por nenhum método avaliado. Comparando os métodos, nos dois períodos estudados, observou-se que a CIM modal para as amostras de MRSA foi de 0,µg/mL (,% em e,% em 00) pela microdiluição comparado com µg/ml pela macrodiluição (,% em e,% em 00) e Etest (,% em e,% em 00). Várias amostras apresentaram CIM de,μg/ml pela macrodiluição (,% e,% em e 00) e Etest (% e,% em e 00), entretanto, estes valores de CIM não foram detectados pela microdiluição em caldo. Além disso, uma (,%) amostra de e uma (,%) de 00 apresentou CIM de µg/ml pela macrodiluição e Etest, respectivamente. Diferentemente, CIM de 0,μg/mL foi obtida apenas pelo método da microdiluição em caldo (,% em e 0,% em 00). Quando as amostras de MRSA foram agrupadas de acordo com os valores da CIM em μg/ml e,μg/ml (Figura ), observou-se que todas as amostras analisadas em e 00 apresentaram CIM da vancomicina μg/ml pela microdiluição (P<0,0). Diferentemente,,% e,% das amostras em e,% e,% em 00, apresentaram CIM,µg/mL pela macrodiluição e Etest, respectivamente.

66 Resultados Tabela. Comparação das CIMs da vancomicina determinada pela diluição em caldo (micro e macrodiluição) e Etest para as amostras de MRSA isoladas em (n=) e 00 (n=) CIM para vancomicina (μg/ml) Nº (%) de amostras de MRSA isolados em e 00 de acordo com os métodos Microdiluição Macrodiluição Etest , (,) (0,) 0, 0 (,) (,) (,) () (0,) (,) (0,) (,) (,) (,) 0 (,) (,), (,) (,) () (,) (,) (,)

67 Resultados %, 0%,,, 0% 0%,,,, 0% 0* 0* 0% Micro Macro Etest Micro Macro Etest MRSA MRSA 00 *P <0,0 CIM µg/ml CIM,µg/mL Figura. Comparação dos métodos de determinação da CIM da vancomicina de acordo com a porcentagem de amostras de MRSA de e 00 com CIM μg/ml e > μg/ml.. PFGE, MLST e determinação do CC 0 Vinte e uma amostras de MRSA foram selecionadas para análise por PFGE após digestão do DNA cromossômico com SmaI, e para determinação do CC pelo teste RM. Dentre estas amostras, ( de e de 00) apresentavam o SCCmecIII e (todas de 00) apresentavam outros tipos de SCCmec. As características moleculares, CIM da oxacilina e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos destas amostras estão representados na Tabela. As amostras de MRSA foram agrupadas no CC e CC. O CC compreendeu as amostras de MRSA SCCmecIII, que foram resistentes a maioria dos antimicrobianos testados