Diagnóstico molecular de infecções respiratórias

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1 Diagnóstico molecular de infecções respiratórias Dr. Luiz Vicente Ribeiro F. da Silva Filho Pneumologia Pediátrica Clínica de Especialidades Pediátricas - HIAE Unidade de Pneumologia Pediátrica Instituto da Criança Prof. Pedro de Alcântara Hospital das Clínicas - FMUSP Laboratório de Virologia Instituto de Medicina Tropical de São Paulo Universidade de São Paulo

2 Infecções Respiratórias Agudas Representam uma das principais condições médicas para adultos e crianças; Uma das causas mais comuns de morbi-mortalidade na infância; Diversos agentes infecciosos envolvidos Vírus Bactérias Fungos

3 Quais os principais agentes de infecção respiratória? Vírus Bactérias Resfriado Nariz entupido Pneumonia Meningite

4 Vírus que causam doenças respiratórias graves Influenza aviária Influenza suína SARS coronavírus

5 VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO Resfriado, Bronquiolite, Pneumonia. Bronquiolite: primeira causa de internação em lactentes < 1ano Garcia CG et al, Pediatrics 2010;126: e1453-e1460

6 VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO Resfriado, Bronquiolite, Pneumonia. è Alta morbidade para grupos especiais de pacientes: Ø Lactentes jovens (prematuros) Ø Idosos Ø Imunocomprometidos Ø Outras doenças de base (FC, displasiabp, etc) Bronquiolite viral aguda por VSR em lactente com displasia broncopulmonar

7 77 lactentes com bronquiolite atendidos na emergência do Hospital Albert Risco de internação: Einstein em SP Univariada: VSR OR 4,145 [1,432 11,998] p=0,009 Multivariada: Idade OR 0,838 [0,718-0,979] p= 0,026 Familiar com atopia OR 0,202 [0,052-0,785] p=0,021 Enterovírus OR 6,033 [1,224-29,726] p=0,027 Risco de internação em UTI: Univariada: Prematuridade OR 14,762 [2,897 5,403] p= 0,001 Multivariada: Prematuridade OR 24,512 [3, ,95] p= 0,002 Nascimento MS et al, Clinics 2010; 65(11):

8 Qual a relevância do diagnóstico etiológico na prática clínica do tratamento de infecções respiratórias? Evitar o uso desnecessário de antibióticos? Ajudar na escolha do antibiótico/antiviral correto? Reduzir os riscos de infecção nosocomial? Definição de prognóstico de sibilância recorrente?

9 Caso clínico " Paciente de 12 anos, febre de 39 a 40 o C há 3 dias, mal estar e dores pelo corpo " Examinada pelo pediatra ontem, só hiperemia de cavum " Hoje com piora do mal estar febre de 40 o C " Encaminhada pelo pediatra para coleta de hemograma, hemocultura e Rx de tórax Rx tórax normal Teste rápido para Influenza A e B + Fuja da espetada!!

10 Métodos clássicos para diagnóstico viral: testes rápidos Testes rápidos Detecção de antígenos de vírus respiratórios (Imunocromatográficos) Kits comerciais: VSR, influenza A e B Métodos rápidos e fáceis de realizar Factíveis para uso à beira do leito Sensibilidade variável (60 a 80%)

11 Métodos clássicos para diagnóstico viral: imunofluorescência Imunofluorescência Uso de anticorpos monoclonais dirigidos contra epítopos específicos de vírus respiratórios Kits comerciais: VSR, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e 3, adenovírus e hmpv (poucos lugares fazem na rotina) Método rápido e sensível Técnico-dependente (treino) Indisponível para alguns vírus de interesse

12 Métodos clássicos para diagnóstico viral: cultura Cultura viral Diversas linhagens celulares (vírus têm preferências) Método trabalhoso e demorado Várias passagens - transferências Verificação do efeito citopático

13 A grande revolução no conhecimento da etiologia de infecções respiratórias por vírus: Métodos de Biologia Molecular Weinberg GA et al, J Infect Dis 2004; 189:706 10

14 Qual a influência dos métodos utilizados nos estudos de etiologia viral em infecções respiratórias agudas? Estudo Positividade % Técnica Número de agentes pesquisados Co-infecção Straliotto SM et al, % IF 5 Não estudado Thomazelli LM et al, % PCR/RT-PCR 8 13% Bosis S et al, % PCR/RT-PCR 14 18% Stempel HE et al, % PCR/RT-PCR 10 23% Miron D et al, % PCR/RT-PCR 9 31% Meerhoff TJ et al, % PCR/RT-PCR 14 48% Em todos os estudos: maior parte das co-infecções envolve rinovírus

15 Bronquiolite viral aguda, PA HIAE Vírus respiratórios isolados no 1 o episódio de chiado em lactentes, idade média ~ 6 meses (n=77) ,5% de positivos VSR Rhino Enterov hmpv hbov paraflu 3 flua corona neg Nascimento MS et al, Clinics 2010; 65(11):

16 Métodos tradicionais de amplificação genômica: PCR e RT-PCR Extração de ácidos nucléicos (retirada de proteínas, restos de membrana etc) Preparo da mistura Termociclador (ciclos de aquecimento-resfriamento) Revelação Corridas em gel de agarose-acrilamida

17 Métodos tradicionais de amplificação genômica: PCR e RT-PCR PCR / RT-PCR tempo real Extração de ácidos nucléicos Preparo da mistura Emissão e detecção de fluorescência emitida durante os ciclos de amplificação (real time) Termociclador e Revelador

18 Métodos de tradicionais amplificação de PCR genômica: e RT-PCR PCR e RT-PCR tempo real PCR / RT-PCR tempo real Mais de uma fluorescência disponível: possibilidade de multiplex (vários alvos) Não há abertura de tubos/placas na etapa pós amplificação: risco de contaminação é muito mais baixo Possibilidade de quantificação de alvos genômicos: expressão de RNA, quantificação de vírus

19 Virochip DNA microarray Tecnologia xmap sistema Luminex The Journal of Infectious Diseases 2007; 196:

20 CONCLUSIONS PneumoVIR - BioMerieux N= 21 +ve: 8 M -ve: 13 Y Amplificação (RT-PCR e PCR CM P MY em multiplex) - The Clinical Arrays Pneumovir provides essential information to our kn infections and increases the diagnostic yields for different types of respi - A comparative evaluation against the current diagnostic methods reveal - It allows initiating appropriate use of antiviral therapy, improves the follo Aplicação num array com isolation) sondas marcadas - It contributes to a better antibiotic management CY CMY K [1] Muir P, Vipond B, Carrington D. Pilot evaluation of a commercial PCR-DNA mi viruses in clinical specimens. Leitura [2] Coiras MT, Aguilar JC, Garcia ML, et al,. Simultaneous detection of fourteen re reverse transcription nested PCR assays. J Med Virol 2004; 72:

21 Plataformas mais completas de PCR e RT-PCR Automação de processos J Med Virol 2009, 81:

22 Novas perspectivas na deteção de ácidos nucléicos Nanotecnologia Vantagens: Dispensa amplificação Possibilidade de resultados rápidos Desenvolvimento de plataformas para beira do leito / campo Wei F et al, Pediatr Res 67: , 2010)

23 Métodos moleculares são tão superiores? Paciente internado com doença respiratória aguda, insuficiencia respiratória, IOT + VMec IFL para virus resp NEG Será adenovírus? Médicos querendo pulsar com corticóide.

24 Métodos moleculares são tão superiores? Paciente internado com doença respiratória aguda, insuficiencia respiratória, IOT + VMec IFL para virus resp NEG PneumoVIR: VSR+ Diagnóstico no 10 o dia nada a fazer, melhorou sem intervenção anti-viral Se eu soubesse antes Ribavirina? Ac monoclonal?

25 Vírus recentemente identificados (avanços tecnológicos) 1. Metapneumovírus humano (hmpv) Novos coronavírus 2004, Bocavírus humano (hbov) Novos poliomavírus Novos rinovírus etc Bocavírus humano (BoVH)

26 Dá pra confiar nestes resultados de biologia molecular? Muitas questões ainda estavam pendentes Frequentemente identificado em co-detecção Não havia descrição de isolamento em cultivo Não se sabia direito a dinâmica da infecção excreção viral hbov3 em microscopia eletrônica Santos N et al, J Clin Virol 2010, 48:

27 Vírus respiratórios emergentes Bocavírus humano: no Brasil 262 ANF de 248 pacientes (2005) 26 hbov + Predomínio de coinfecções Gagliardi TB et al, Epidemiol Infect 2009;137(7):1032-6

28 Bocavírus humano: no Brasil Projeto VGDN Fapesp Rede de Diversidade Gené.ca Viral - tarefa VSR Critérios de inclusão: Idade entre 0 e 5 anos Quadro clínico de infecção respiratória aguda Critérios de exclusão: Recusa em par.cipar do estudo Impossibilidade de colher aspirado nasofaríngeo Hospital Israelita Albert Einstein Hospital InfanEl Darcy Vargas Ambulatório do Programa Einstein na Comunidade de Paraisópolis

29 Bocavírus humano: no Brasil Detecção de BoVH distribuição etária (n=603) 127 amostras posievas (21,1%) Número de pacientes ,2% 66,9% 73,8% 89,5% BoVH nega.vo BoVH posi.vo 50 0 < 6 meses 6 a 11 meses 12 a 24 meses > 24 meses Faixa etária Andreia Vieira Tese Doutorado IMT-USP

30 Bocavírus humano: no Brasil Co- detecções Co- detecções: 108 (85%) Detecção única: 19 (15%) Andreia Vieira Tese Doutorado IMT-USP

31 Desafios para o uso de métodos com alta sensibilidade Como interpretar este monte de co-infecções (ou co-detecções)? Definir o papel de cada um dos agentes identificados no processo em investigação: 1. Vírus DNA: identificação de RNA = atividade viral - uso de DNAse em amostras sobra o RNA - mrna de boca e correlação com carga viral e diarreia (Dr. Eurico Arruda, PLOSone 2012) 2. Vírus RNA? (aceito sugestões)

32 Bocavírus humano: causa doença mesmo? Distribuição dos valores de oximetria de pulso encontrados, de acordo com a iden.ficação do BoVH nas amostras. Valores de oximetria de pulso dados compara.vos p= 0,086 p= 0,002 p= 0,02 Andreia Vieira Tese Doutorado IMT-USP

33 Bocavírus humano: causa doença mesmo? Idade, oximetria de pulso e valores de carga viral dos pacientes com ideneficação de BoVH, segundo sua detecção isolada ou em co- detecção com outro vírus (n=603) Idade (meses) BoVH nega.vo (n=476) BoVH co- detecção (n=108) BoVH único (n=19) p- valor Média (desvio padrão) 15 (16) 12 (11) 13 (14) 0,094* Mediana (p25- p75) 10 (3-23) 9 (5-17) 9 (5-15) Oximetria de pulso Média (desvio padrão) 93 (5) 93 (4) 96 (2) 0,01# Mediana (p25- p75) 95 (91-97) 94 (90-96) 96 (95-98) log10 cópias de DNA BoVH Média (desvio padrão) - 2,30 (1,50) 2,36 (1,39) 0,885@ Mediana (p25- p75) - 2,13 (1,18-3,07) 2,37 (1,03-3,40) * Teste de ANOVA # Teste de Kruskal- Wallis (Teste de Mann- Whitney: BoVH nega.vo x BoVH co- detecção: p= 0,086; BoVH nega.vo x BoVH único: p= 0,02; BoVH co- detecção x BoVH único: p= Teste T de Student Andreia Vieira Tese Doutorado IMT-USP

34 Bocavírus humano: causa doença mesmo? BoVH único: valores de oximetria de pulso mais elevados que os pacientes com co-detecções. A detecção única de BoVH foi associada a menor frequência de chiado e hipoxemia do que a observada em pacientes com co-detecções. Sem relação com a carga viral

35 Conclusões 1. Métodos de biologia molecular aumentam muito a sensibilidade, mas... Aumentam muito a taxa de co-detecção 2. Os maiores avanços em diagnóstico molecular são na fase de detecção de material genômico amplificado (arrays, Luminex, etc) 3. Novas perspectivas: nanotecnologia: dispensar amplificação? 4. Cuidado na interpretação de resultados: será que todos estes agentes virais são tão patogênicos? Obrigado