Implementação de uma nova metodologia para detecção de painel de vírus respiratórios através RT-PCR Microarray: CLART Pneumovir.

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1 Implementação de uma nova metodologia para detecção de painel de vírus respiratórios através RT-PCR Microarray: CLART Pneumovir. Niewiadonski, V.D.T; Scarpelli, L.C; Alfieri,A; Gaburo Jr, N. Departamento de Diagnóstico Molecular - DASA Summary The Respiratory virus infection is one of the most important causes of childhood respiratory diseases and is traditionally diagnosed by direct immunofluorescence (DIF) and cell culture. However, these techniques can detect only a restricted amount of pathogens and does not include emerging respiratory viruses. To attend this demand, panels of respiratory virus analyzed with molecular biology techniques, are capable to detect emerging and traditional viruses, with increased sensitivity. Fifteen samples of nasotracheal secretions were collected from children up to 2 years of age and tested using the Clart Pneumovir, technique that simultaneously detects 18 different respiratory viruses. The results were compared with DIF and showed 93.3% positive results in Clart Pneumovir against 26.6% in DIF. There was agreement between two methods in 86.6% of samples tested. The frequency analysis of the viruses detected in Clart Pneumovir showed: Rhinovirus (40%), Bocavirus (33.3%) and RSV A (26%). The presence of multiple infections using Clart Pneumovir was observed in 53.3% of samples tested. Clart Pneumovir test showed higher positivity than the traditional method for detecting respiratory viruses in the analyzed samples. 1

2 Resumo A infecção por vírus respiratórios é uma das causas principais de doenças respiratórias infantis e, tradicionalmente, é diagnosticada através de imunofluorescência direta (IFD) e cultura de células. Entretanto, estas técnicas são capazes de detectar apenas uma quantidade restrita de patógenos e não contemplam os vírus respiratórios emergentes. Para atender a essa demanda, os painéis de vírus respiratórios analisados com técnicas de biologia molecular, são capazes de detectar vírus emergentes e tradicionais, com maior sensibilidade. Quinze amostras de secreção nasotraqueal foram coletadas de crianças com até 2 anos de idade e testadas utilizando o ensaio CLART Pneumovir, técnica que detecta simultaneamente 18 tipos de vírus respiratórios. Os resultados obtidos foram comparados com a IFD e mostraram 93,3% de resultados positivos no CLART Pneumovir contra 26,6% de positividade na IFD. Houve concordância entre as duas metodologias em 86,6% das amostras testadas. A análise das frequências dos vírus detectados no CLART Pneumovir mostrou: Rhinovirus (40%), Bocavirus (33,3%) e RSV A (26%). Já a presença de infecções múltiplas usando CLART Pneumovir foi observada em 53,3% das amostras testadas. O teste CLART Pneumovirmostrou maior positividade para detecção dos vírus respiratórios nas amostras analisadas que os métodos tradicionais. 2

3 Introdução Doenças respiratórias podem ser atribuídas a diversos agentes etiológicos, incluindo vírus da Influenza A sazonal, Influenza B, Influenza A H1N1 pandêmica, Adenovírus, Vírus sincicial respiratório (RSV), Bocavírus humano, Coronavírus, Metapneumovírus e Parainfluenza vírus, entre outros. (1). Estes vírus representam um importante papel nas infecções respiratórias de crianças, idosos e outros grupos de indivíduos imunossuprimidos, levando a hospitalização nos casos mais severos. (2). Além de sua capacidade de causar doenças, os vírus respiratórios apresentam tempo de incubação relativamente curto (Tabela 1) e podem ser transmitidos de pessoa para pessoa através de contato direto ou de gotículas de saliva. (3). Tabela 1. Período de incubação de alguns vírus respiratórios. Vírus Incubação (dias) Período de infecção Influenza dias Parainfluenza semanas Vírus Sincicial Respiratório dias Adenovírus dias Rhinovirus dias Metapneumovirus 4-6 Média de 5 dias Coronavirus 2-4 Desconhecido Bocavirus Desconhecido Desconhecido Pacientes infectados por tais patógenos desenvolvem uma série de sintomas comuns, sendo o diagnóstico e laboratorial determinante na conduta terapêutica. (4). Tradicionalmente o diagnóstico de vírus respiratórios tem se baseado na detecção do antígeno através da técnica de imunofluorescência direta (IFD) e/ou no isolamento do vírus através de cultura. A IFD apresenta algumas limitações, como por exemplo, a baixa sensibilidade da detecção de antígenos além de ter resultados com interpretação subjetiva, 3

4 e, para tal, requer profissionais altamente treinados e qualificados para realizá-la. Já a cultura de células, apesar de ser um método mais sensível quando comparado com a IFD (5), também apresenta limitações, tais como: tempo prolongado para obtenção do resultado, ser aplicável somente a vírus cultiváveis, além de requerer condições rígidas de transporte e armazenamento da amostra. Por estes motivos, tanto a IFD quanto a cultura de células são incompletas para o diagnóstico de vírus respiratórios e fazem com que alguns casos clínicos permaneçam não detectados. (6). Diante deste cenário, o aparecimento de novas técnicas se fez necessário, não só para detectar vírus emergentes não contemplados no painel tradicional como Metapneumovirus humano (HMPV), Coronavirus, Bocavirus, (7, 8), mas também para apresentar ganho real de sensibilidade, acuracia e rapidez na obtenção dos resultados. A tecnologia molecular tem sido utilizada, por apresentar melhor sensibilidade e especificidade quando comparada com os métodos tradicionais (5, 6). Além disto, ela se baseia na amplificação das seqüências de ácidos nucléicos virais específicos e pode, portanto, permitir a detecção simultânea de uma grande quantidade de vírus respiratórios tanto tradicionais quanto emergentes (2). Entre os testes moleculares disponíveis atualmente, existem diversas metodologias como as que se baseiam em partículas marcadas em suspensão, RT-PCR em tempo real, e o microarray. Dentre elas optamos pelo teste comercial CLART PneumoVir (Genomica, Madri, Espanha), pois este método permite a detecção simultânea de 18 vírus respiratórios através da amplificação por uma RT-PCR em multiplex e a detecção do produto amplificado pela tecnologia de microarray. Trata-se de um método com execução relativamente rápida, quando comparado a outros métodos como a cultura de células e que apresenta como vantagem, o fato de detectar diversos vírus em um único ensaio, favorecendo a economia de recursos como tempo, mão de obra e insumos. O objetivo deste estudo foi comparar a detecção de vírus respiratórios presentes em amostras de secreção nasotraqueal de crianças de até 2 anos, utilizando duas técnicas distintas: o método comercial CLART PneumoVir (Genomica, Madri, Espanha) e o tradicional IFD. Além disto, a frequência e distribuição dos vírus detectados pelo teste CLART PneumoVir também foram analisadas. 4

5 Material e Métodos Amostras De 01 a 29 de agosto de 2011 foram coletadas 15 amostras de aspirado nasotraqueal de crianças de 0 a 2 anos de idade atendidas nos Hospitais Sabará e Santa Helena, ambos em São Paulo,com suspeita de infecção respiratória e indicação para realização do painel. A idade média das crianças foi de 4 meses, com desvio padrão 3,99. As amostras foram coletadas em duplicata, uma delas foi enviada ao laboratório de apoio para realização do painel viral por IFD e a outra foi encaminhada ao setor de Diagnóstico Molecular da DASA para realização dos testes com o teste comercial CLART Pneumovir. Métodos CLART Pneumovir Para esta metodologia, foram obtidos os ácidos nucleicos (DNA e RNA) em cada amostra de secreção nasotraqueal que posteriormente foram amplificados por RT-PCT e, finalmente, hibridizados para visualização dos resultados no microarray. Todas estas etapas foram executadas conforme instruçoes do fabricante e se resumem como se segue: Os ácidos nucleicos foram obtidos das secreções nasotraqueais utilizando o kit comercial QIAamp RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) e posteriormente foram quantificados através de espectrofotometria (Nanodrop). A etapa seguinte consistiu em submeter as amostras obtidas ao kit comercial CLART Pneumovir. Numa primeira etapa, cada amostra foi amplificada em reação de RT-PCR Multiplex. Numa segunda etapa, a visualização do produto amplificado foi realizada numa plataforma de microarrays de baixa densidade em que ocorre a hibridização do produto amplificado com as sondas específicas imobilizadas nesta plataforma. Nos casos de presença de material genético viral, houve a precipitação de um produto insolúvel nos 5

6 locais do microarray onde ocorreu a hibridização dos produtos amplificados. Entretanto, esta reação só foi considerada positiva quando houve a hibridização do produto amplificado viral com três sondas presentes no microarray. Além disto, essa tecnologia garante a confiabilidade dos seus resultados pois permite a detecção simultânea de controles de inibição de PCR e de hibridização. O tempo de execução para amplificação e visualização do produto amplificado é e de aproximadamente 8 horas, sendo considerado relativamente rápido. Além disto, o software permite a leitura e interpretação automática dos resultados do microarray evitando interpretações subjetivas do resultado. A figura 1 apresenta a imagem do microarray de uma amostra positiva pelo ensaio CLART Pneumovir, capturada pelo leitor Clinical Array Reader (CAR). Fig. 1. Imagem Microarray H+: Controle de Hibridização a presença dos pontos indica eficiência dos reagentes utilizados durante o processo. PCR: Controle de Amplificação: a presença dos pontos indica que não houve inibição da reação de RT-PCR. V+: a presença dos pontos indica uma reação positiva para um determinado tipo viral. 6

7 Imunofluorescencia direta (IFD) A pesquisa de vírus por IFD foi realizada por laboratório de apoio seguindo a tecnica de Laundry e Ferguson (9). Nesta técnica é realizada a pesquisa de antígenos através de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo (conjugado) para detecção dos vírus respiratórios. Na Tabela 2 estão descritos os vírus passíveis de detecção pelos dois métodos abordados. Tabela 2. Vírus respiratórios detectados pelos diferentes painéis. CLART Pneumovir Imunofluorescência Direta (IFD) Adenovirus ( A D) Metapneumovírus A (HMPV A) Metapneumovirus B (HMPV B) Parainfluenza 1 (PIV-1) Parainfluenza 2 (PIV-2) Parainfluenza 3 (PIV-3) Parainfluenza 4 (PIV-4 A e B) Rhinovirus (HRv) Virus Sincicial Respiratório A (RSV A) Virus Sincicial Respiratorio B (RSV B) Bocavirus (HBoV) Coronavirus 229E (CoV) Enterovirus (Echovirus, Coxackievirus A,B) Influenza A (H3N2, H1N1, H1N1 suína) Influenza B Influenza C Influenza A Influenza B Virus Sincicial Respiratório (RSV) Parainfluenza (PIV) Adenovirus 7

8 Resultados A tabela 3 mostra que para o método comercial, das 15 amostras testadas, 14 delas (93,3%) apresentaram resultado positivo para um ou mais vírus do painel testado enquanto que para a IFD a presença de resultado positivo foi detectada apenas em 4 amostras (26,6%). Também, nesta mesma tabela, evidenciamos a presença de co-infecção pelo CLART Pneumovir, fato este não detectado pelo método tradicional. Isto é claro nas amostras 13 e 14 onde houve a detecção de dois tipos distintos de virus, respectivamente, Influenza B e de RSV na amostra 13 e Influenza A e Parainfluenza na amostra 14. Já, para estas amostras, os resultados da IFD detectou apenas a presença do vírus RSV na amostra 13 e do Parainfluenza na amostra 14. Finalmente, a tabela 3 mostra uma serie de resultados positivos que foram negativos pelo teste IFD. Muitos destes vírus não são detectados pela técnica manual, conforme descrito na Tabela 2. Considerando-se apenas os vírus detectados por ambos os testes, a concordância entre os dois métodos foi de 86,6 %. Este fato deve-se ao resultado discrepante em duas amostras que apresentaram resultado positivo para Influenza A e H3N2 (amostra 10) e RSVA (amostra 15) no CLART Pneumovir sendo Não detectadas na IFD. 8

9 Tabela 3. Resultados Painel Vírus Respiratório Paciente ID CLART PneumoVir IFD 1 HboV NEG 2 HRV / RSV A RSV 3 HBoV / HMPVA / HRV NEG 4 HRV NEG 5 HBoV / HRV NEG 6 HboV NEG 7 HBoV / HMPV / HRV NEG 8 HRV NEG 9 HRV / RSV A RSV 10 Influenza A H3N2 NEG 11 NEG NEG 12 HMPVA NEG 13 Influenza B / RSV A RSV 14 Influenza A / PIV- 3 PIV 15 HMPV B / RSV A NEG HBoV Bocavirus, HRV Rhinovirus, RSV Virus sincicial respiratório, HMPV Metapneumovirus, PIV Parainfluenza, NEG Negativo, IFD - Imunofluorescencia direta. Foi observada a presença de co-infecçao por pelo menos dois vírus em 53,3% das amostras analisadas enquanto que a infecção por um único vírus foi observada em 40% das amostras. Apenas uma amostra (6,7%) apresentou resultado negativo para todos os vírus do painel em ambos os métodos testados. O gráfico 1 representa a freqüência dos vírus detectados e o gráfico 2 apresenta os tipos de infecções observadas nos resultados obtidos pelo teste no CLART Pneumovir. 9

10 Gráfico 1 Resultado do Painel de Vírus Respiratório CLART PneumoVir (Frequência dos vírus detectados) Gráfico 2 - Tipos de infecções respiratórias. 10

11 Discussão O ensaio por microarray mostrou-se altamente sensível, e permitiu a detecção simultânea de diversos vírus que não poderiam ser detectados pelos métodos tradicionais. Além disso, detectou a presença de infecções múltiplas. A possibilidade de detecção de infecções múltiplas levanta questões referentes à patogenicidade dos diferentes vírus, pois os sintomas clínicos observados podem ser ocasionados devido a ação de apenas um ou à uma combinação dos vírus detectados. Nos resultados obtidos para as amostras 13 e 14, em que houve a detecção de coinfecção no método comercial de dois vírus passíveis de detecção pelos dois métodos testados, observamos resultado positivo na IFD para apenas um dos vírus. Este fato deve-se provavelmente à predominância da infecção de um dos vírus presente nas amostras e comprova o ganho de sensibilidade do método molecular por microarray. A presença de infecções respiratórias múltiplas ocorre em cerca de 17,4% a 30% das crianças abaixo de 2 anos de idade admitidas em hospitais segundo estudos anteriores (10). Neste estudo, foi detectada a presença de co-infecção em 57,1 % das amostras positivas pelo o método CLART Pneumovir. Foi detectada também a predominância de Rhinovirus (40%) uma das causas mais comuns de infecções respiratórias em crianças abaixo de 2 anos de idade (11). Trata-se frequentemente do vírus mais prevalente detectado em crianças com doença respiratória aguda (12). Em estudo realizado previamente em crianças com menos de cinco anos de idade hospitalizadas, apresentando doença respiratória aguda, foi reportado o Rhinovirus como o vírus respiratório mais detectado (13). O segundo vírus mais frequentemente detectado neste estudo foi o Bocavirus (33,3%) Estudos demonstram que frequência de infecções causadas por Bocavirus varia de acordo com a população estudada. (14, 15), e a incidência de infecções é inversamente proporcional a idade, sendo mais comum em crianças abaixo de 5 anos e menos freqüente após esta idade (15). Além disso, estudos demonstram que a frequência de detecção deste vírus é sazonal, sendo mais frequentemente encontrada durante os meses de outono e inverno. (8, 16). Esses dados foram confirmados pelos resultados obtidos neste estudo, pois a sazonalidade corresponde ao período de coleta das amostras (Agosto de 2011). 11

12 Também foi detectada uma prevalência de 26,6% de RSVA. Trata-se de um importante agente causador de hospitalizações em crianças (17). Do ponto de vista prático, o ensaio CLART Pneumovir é um ensaio de fácil manuseio e com obtenção de resultados relativamente rápida. Após a extração dos ácidos nucleicos, o ensaio leva aproximadamente 8 horas e é dividido em duas etapas: a RT-PCR multiplex e o processo de hibridização. O ensaio comercial CLART Pneumovir apresentou alto índice de positividade (93,3%). A especificidade descrita pelo fabricante para este método é de 99,55% a 100%, dependendo do vírus estudado, pois para a obtenção de um resultado positivo, é necessário que sejam hibridizadas no mínimo três seqüências distintas do vírus às sondas presentes no microarray, evitando desta forma resultados falso-negativos. Para as técnicas testadas (CLART Pneumovir e IFD) houve um índice de concordância de 86,6%, considerando-se apenas os vírus detectados por ambos os testes. As discrepâncias podem ser justificadas considerando-se o fato de que o método molecular é mais sensível quando comparado com a IFD. O aumento da sensibilidade analítica dos métodos moleculares é importante clinicamente, pois propicia um diagnóstico mais acurado para orientação e permite a identificação dos vírus respiratórios tradicionais e emergentes. A detecção simultânea de diversos patógenos em um uma única reação gera economia de recursos, diminuição do tempo de execução e dos consumíveis e custa menos do que o custo agregado para a realização de testes com o objetivo de detectar apenas um alvo. No caso do kit avaliado, além das vantagens citadas, há também a facilidade na interpretação dos resultados quando comparados com a IFD, devido à subjetividade da leitura. A facilidade na detecção de infecções múltiplas permite a realização de estudos para examinar a importância do significado clinico das mesmas e contribuindo para o entendimento da epidemiologia dos vírus respiratórios (3). 12

13 Conclusão O presente estudo comparativo entre os dois métodos (CLART Pneumovir e IFD) apresentou concordância considerável entre os vírus tradicionais pesquisados por ambos os testes. As frequências e distribuição dos vírus detectados pelo método molecular CLART Pneumovir apresentaram presença de co-infecção na maior parte das amostras estudadas. O método molecular CLART Pneumovir, apresenta alta sensibilidade utilizando a tecnologia de microarray e pode ser aplicado no diagnóstico de doenças respiratórias agudas, principalmente em atendimentos pediátricos visando à rapidez na liberação dos resultados e a obtenção de um diagnóstico acurado para orientação da melhor conduta terapêutica. 13

14 Referências 1. Wang W, Ren P, Sheng J, Mardy S, Yan H, Zhang J, et al. Simultaneous detection of respiratory viruses in children with acute respiratory infection using two different multiplex reverse transcription-pcr assays. J Virol Methods 2009;162(1-2): Frobert E, Escuret V, Javouhey E, Casalegno JS, Bouscambert-Duchamp M, Moulinier C, et al. Respiratory viruses in children admitted to hospital intensive care units: evaluating the CLART(R) Pneumovir DNA array. J Med Virol 2011;83(1): Mahony JB. Detection of respiratory viruses by molecular methods. Clin Microbiol Rev 2008;21(4): Renois F, Talmud D, Huguenin A, Moutte L, Strady C, Cousson J, et al. Rapid detection of respiratory tract viral infections and coinfections in patients with influenza-like illnesses by use of reverse transcription-pcr DNA microarray systems. J Clin Microbiol 2010;48(11): Reis AD, Fink MC, Machado CM, Paz Jde P, Jr., Oliveira RR, Tateno AF, et al. Comparison of direct immunofluorescence, conventional cell culture and polymerase chain reaction techniques for detecting respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates from infants. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2008;50(1): Syrmis MW, Whiley DM, Thomas M, Mackay IM, Williamson J, Siebert DJ, et al. A sensitive, specific, and cost-effective multiplex reverse transcriptase-pcr assay for the detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples. J Mol Diagn 2004;6(2): Drosten C, Gunther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt HR, Becker S, et al. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med 2003;348(20):

15 8. Kesebir D, Vazquez M, Weibel C, Shapiro ED, Ferguson D, Landry ML, et al. Human bocavirus infection in young children in the United States: molecular epidemiological profile and clinical characteristics of a newly emerging respiratory virus. J Infect Dis 2006;194(9): Landry ML, Ferguson D. SimulFluor respiratory screen for rapid detection of multiple respiratory viruses in clinical specimens by immunofluorescence staining. J Clin Microbiol 2000;38(2): Calvo C, Garcia-Garcia ML, Blanco C, Vazquez MC, Frias ME, Perez-Brena P, et al. Multiple simultaneous viral infections in infants with acute respiratory tract infections in Spain. J Clin Virol 2008;42(3): Calvo C, Garcia-Garcia ML, Blanco C, Pozo F, Flecha IC, Perez-Brena P. Role of rhinovirus in hospitalized infants with respiratory tract infections in Spain. Pediatr Infect Dis J 2007;26(10): Chung JY, Han TH, Kim SW, Hwang ES. Respiratory picornavirus infections in Korean children with lower respiratory tract infections. Scand J Infect Dis 2007;39(3): Miller EK, Lu X, Erdman DD, Poehling KA, Zhu Y, Griffin MR, et al. Rhinovirusassociated hospitalizations in young children. J Infect Dis 2007;195(6): Brieu N, Guyon G, Rodiere M, Segondy M, Foulongne V. Human bocavirus infection in children with respiratory tract disease. Pediatr Infect Dis J 2008;27(11): Kim JS, Lim CS, Kim YK, Lee KN, Lee CK. Human bocavirus in patients with respiratory tract infection. Korean J Lab Med 2011;31(3):

16 16. Ma X, Endo R, Ishiguro N, Ebihara T, Ishiko H, Ariga T, et al. Detection of human bocavirus in Japanese children with lower respiratory tract infections. J Clin Microbiol 2006;44(3): Freymuth F, Vabret A, Cuvillon-Nimal D, Simon S, Dina J, Legrand L, et al. Comparison of multiplex PCR assays and conventional techniques for the diagnostic of respiratory virus infections in children admitted to hospital with an acute respiratory illness. J Med Virol 2006;78(11):