MÓDULO PRÁTICO. Curso de Actualização sobre Diagnóstico da Infecção HIV-SIDA 11 Nov 2010

Transcrição

1 MÓDULO PRÁTICO 11 Nov 2010

2 MÓDULO PRÁTICO Quirina dos Santos-Costa Pharm D, PhD Student Assistant Lecturer Unidade dos Retrovírus e Infecções Associadas - Centro de Patogénese Molecular Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa quirina.c@ff.ul.pt

3 MÓDULO PRÁTICO Isolamento do HIV, a partir de sangue total humano, por técnica de separação de CMSP: gradiente de Ficoll- Paqueª; Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido); Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação.

4 1- NÍVEIS DE SEGURANÇA BIOLÓGICA Nível Transmissão Risco para o operador Risco para a comunidade Exemplos 1 - Nulo Nulo B. subtilis 2 Percutânea Mucosas Ingestão Moderado Moderado Hepatite B HIV aerossóis Elevado Moderado M. tuberculosis HIV concentrado 4 3 Muito elevado Muito elevado Vírus Ebola e Marburg

5 O LABORATÓRIO DE CONTENÇÃO BIOLÓGICA DE NÍVEL 3 NSB Agentes Práticas Equipamento de segurança (Barreiras primárias) Instalações (barreiras secundárias) 1 Que se desconheça causarem doença de forma consistente em adultos saudáveis Práticas de Microbiologia gerais Nenhum requerido Banco com regulação de altura 2 Associados com doença no Homem, Perigo= lesão percutânea, ingestão, exposição a membrana mucosa NBS-1 mais: Acesso limitado, Sinalização de perigo biológico, Precauções c/objectos cortantes, Manual de biosegurança que defina politicas de descontaminação de qualquer material necessário ou vigilância médica Barreiras 1ª S = NBS Classe I ou II ou outros dispositivos físicos usados para todas as manipulações de agentes que causem salpicos ou aerossóis de materiais infecciosos; Protecção: batas de laboratório, luvas, protecção da face, sempre que necessário NBS-1 mais: Autoclave disponível 3 Agentes indígenas ou exóticos potencialmente transmissíveis por aerossóis; a doença pode ter consequências sérias ou letais NBS-2 mais: Acesso controlado, Descontaminação de todo o lixo, Descontaminação do vestuário do laboratório antes de ser lavado Amostra reduzida ao mínimo Barreiras 1ª S = NBS Classe I ou II ou outros dispositivos físicos usados para todas as manipulações abertas de agentes que causem salpicos ou aerossóis de materiais infecciosos; Protecção: vestuário de protecção à bata de laboratório, luvas, protecção respiratória, sempre que necessário NBS-2 mais: Separação física dos corredores de acesso; Dupla porta de acesso que se feche automaticamente Exaustão de ar que não recircule Pressão negativa no laboratório 4 Agentes perigosos / exóticos que apresentem risco elevado de causar morte, devido a infecções laboratoriais transmitidas por aerossóis; ou agentes aparentados com risco de transmissão desconhecido NBS-3 mais: Trocar de vestuário antes de entrar, Chuveiro à saída, Descontaminação de todo o material à saída da instalação Barreiras 1ª S = todos os procedimentos na NBS Classe III ou Classe I ou II em conjunto com fato completo, com fornecimento de ar e pressão positiva NBS-3 mais: Edifício separado ou isolado; Sistemas de fornecimento de ar, exaustão, vácuo e de descontaminação especializados Outros equipamentos como autoclave com 2 portas, portas de acesso com chaves, sistemas de comunicação, etc.

6 O LABORATÓRIO de CONTENÇÃO BIOLÓGICA de NÍVEL 3

7 P3 - FFUL Laboratório de Segurança Biológica de Nível 3 QSC_FFUL_P3

8 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO Separação de sangue total humano, por técnica de gradiente de Ficoll- Paque

9 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO Separação de sangue total humano, por técnica de gradiente de Ficoll- Paque

10 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO Separação de sangue total humano, por técnica de gradiente de Ficoll- Paque

11 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO Separação de sangue total humano, por técnica de gradiente de Ficoll- Paque CONTAGEM DE CÉLULAS EM HEMATÍMETRO DE NEUBAUER 1mm 1 2 1mm Altura= 0,1 mm Área= 1mm*1mm=1mm 2 Volume= 0,1mm 3 N ( ) 0,1 µl 4 X 1000 µl Diluição com Azul de Tripan 1/10 (90 µl + 10 µl) 3 4 N/4 X 10 5 células / ml

12 COMO TUDO SE INICIA... ISOLAMENTO Separação de sangue total humano, por técnica de gradiente de Ficoll- Paque

13 MÓDULO PRÁTICO Isolamento do HIV, a partir de sangue total humano, por técnica de separação de CMSP: gradiente de Ficoll- Paqueª; Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido) Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação.

14 Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido) Teste imunocromatográfico: membrana de nitrocelulose impreganada com o conjugado (pétidos de síntese específicos: gp41 dos grupos M e O, do HIV1 e, gp36 do HIV2 ligdos a microesferas de poliestileno de cor azul) e uma linha de controlo; Fundamento Migração dos complexos Ag-Ac por capilaridade ao longo da membrana e, a posterior fixação destes aos péptidos sintéticos fixos à membrana, formam a linha azul; A linha controlo da reacção deverá passar de azul a vermelho/rosa.

15 Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido) Material: retirar o dispositivo da saqueta e usar extemporaneamente; colocar o dispositivo em superfície plana e limpa; pipetar 75uL de amostra (soro ou plasma), ou 3 gotas de sangue total para o poço-amostra (S), evitando a formaçao de bolhas de ar; leitura após/até 30 minutos; apontar o resultado; arrumar a bancada e retirar as luvas.

16 Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido) Resultados e Interpretação: POSITIVO NEGATIVO INVÁLIDO

17 MÓDULO PRÁTICO Isolamento do HIV, a partir de sangue total humano, por técnica de separação de CMSP: gradiente de Ficoll- Paqueª; Execução de um método detecção de anticorpos anti-hiv VIKIAª HIV 1/2 ( biomèrieux - teste rápido). Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação.

18 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 10: (02/01/2008) Tira 11: (10/01/2008) gp140 gp105 Tira 21: HIV2 controlo + Tira 22: HIV2 controlo - Tira 33: (10/01/2008) p68 p55 p52 gp41 p68 p56 Nossos dados: p34 gp36 Amostra do dia 02/01/2008 Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,204; Agp24: Neg p24 p26 Amostra do dia 10/01/2008: Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,191; p18 Agp24: Neg p16 controlo

19 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp140 gp105 p68 p56 Tira 21: HIV2 controlo + Tira 22: HIV2 controlo - Tira 35: amostra da primeira colheita (07/04/2009) Tira 36: amostra da segunda colheita (21/05/2009) Nossos dados: gp36 p26 p16 Amostra do dia 07/04/2009 Genscreen: Pos 1,833; cut-off: 0,204; Agp24: Neg Amostra do dia 21/05/2009: Genscreen: Pos 0,210; cut-off: 0,191; Agp24: Neg controlo

20 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 34: amostra Tira 35: amostra Tira 36: amostra gp140 gp105 Tira 21: HIV2 controlo + Tira 22: HIV2 controlo - Tira 23: amostra Tira 24: amostra p68 p55 p52 gp41 p68 p56 Nossos dados: p34 gp36 Amostra do dia 0/0/0 Genscreen: Agp24: p24 p26 Amostra do dia 0/0/0: Genscreen:; p18 Agp24: p16 controlo

21 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 19: 1ª colheita 04/04/2008 Tira 20: 2ª colheita 15/04/2008 gp140 gp105 Tira 21: HIV2 controlo + Tira 22: HIV2 controlo - Tira 01: 1ª colheita 04/04/2008 Tira 02: 2ª colheita 15/04/2008 p68 p55 p52 gp41 p68 p56 Nossos dados: p34 gp36 Amostra do dia 04/04/2008 Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,1994; Agp24: Pos (0,833) p24 p26 Amostra do dia 15/04/2008: Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,196; p18 p16 controlo

22 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 p68 p55 p52 gp41 p34 p24 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 31: amostra da primeira colheita (29/11/2008) Nossos dados: Amostra do dia 29/11/2008 Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,191 Agp24: Pos (0,143) p18

23 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 p68 p55 p52 gp41 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 07: amostra da primeira colheita (15/05/2010) Tira 06: amostra da segunda colheita (08/06/2010) Nossos dados: p34 p24 p18 Amostra do dia 15/05/2010 Genscreen: Pos 0,833; cut-off: 0,204; Agp24: Neg Amostra do dia 08/06/2010: Genscreen: Pos 1,340; cut-off: 0,191;

24 Interpretação dos resultados dos testes rápidos e de confirmação gp160 gp120 Tira 14: HIV1 controlo + Tira 15: HIV1 controlo - Tira 15: (16/09/2010) gp140 gp105 Tira 21: HIV2 controlo + Tira 22: HIV2 controlo - Tira 02: (22/09/2010) p68 p55 p52 gp41 Nossos dados: p68 p56 p34 Amostra do dia 16/09/2010 Genscreen: Pos OF; cut-off: 0,204; Agp24: Pos (0,243) gp36 p24 p26 p18 p16 controlo

25 MÓDULO PRÁTICO Muito Obrigada pela vossa Atenção!