Palavras chave: doença respiratória aguda, crianças, parainfluenzavírus

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1 CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 UFU 30 anos PARAINFLUENZAVÍRUS EM SECREÇÃO DE NASOFARINGE DE CRIANÇAS COM DOENÇA RESPIRATÓRIA AGUDA, ATENDIDAS EM UBERLÂNDIA, MG Nayhanne Tizzo de Paula Universidade Federal de Uberlândia (UFU).³Av. Pará, 1720, Bloco 4C, Umuarama, Uberlândia, nayhanne@yahoo.com.br Paulo Guilherme Guimarães Ribeiro pauloggribeiro@hotmail.com Divina Aparecida Oliveira Queiróz Resumo Os parainfluenzavírus (PIV) são importantes causas de infecções respiratórias aguda em indivíduos de todas as idades, acomentendo pricipalmente as crianças. Esses patógenos são detectados principalmente através das técnicas de imunofluorescência indireta (IFI) e isolamento em cultura de células, no entanto esta última demanda de uma a duas semanas para obtenção do resultado. Investigou-se a presença dos PIV pela IFI em 133 aspirados de nasofaringe de crianças menores de cinco anos de idade com doença respiratória aguda, sendo este agente encontrado em sete das amostras avaliadas. Além disso, a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) do tipo multiplex, foi padronizada para utilização em um futuro próximo. Palavras chave: doença respiratória aguda, crianças, parainfluenzavírus 1. INTRODUÇÃO Os vírus respiratórios são importantes agentes responsáveis por causar infecções respiratórias agudas (IRA) (WELLIVER, 2003), sendo responsáveis por patologias do trato respiratório em indivíduos de todas as idades, especialmente durante a infância (TSUCHIYA et al.; 2005), e tendo um risco mais elevado para aquelas crianças que são pré-termo, que possuem distúrbios cardíacos, pulmonares ou do sistema imune (DINIZ et al., 2005). Tais infecções respondem por altos índices de hospitalizações (COUNIHAN et al., 2001), no entanto, podem ocorrer de forma assintomática ou com sintomas brandos (HIBBITS et al., 2002). No que diz respeito à circulação e às doenças causadas por vírus, estes podem ocorrer sazonalmente ou em surtos (OLIVEIRA et al., 2004; COSTA et al., 2006) sendo que surtos epidêmicos resultam em um aumento considerável de consultas médicas (HIBBITS et al., 2002). Dentre os vírus respiratórios responsáveis pelas IRAs, os principais são: o vírus respiratório sincicial (VRS), os rinovírus (HRV), os parainfluenzavírus (PIV), os influenzavírus (FLU), os adenovírus (AdV) e os metapneumovírus (hmpv), (MOSCONA, 2005). ¹ Mestranda do Programa de Parasitologia e Imunologia Aplicadas - nayhanne@yahoo.com.br ; ² Aluno de Iniciação Científica PIBIC/CNPq; ³ Orientadora - Instituto de Ciências Biomédicas (ICBIM) Universidade Federal de Uberlândia (UFU).³Av. Pará, 1720, Bloco 4C, Umuarama, Uberlândia,

2 Os PIV, pertencentes à família Paramyxoviridae, têm ampla distribuição mundial e as infecções causadas por eles são consideradas comuns (ECHEVARRÍA et al., 2000). Estes vírus foram isolados pela primeira vez entre 1956 e 1960 e são divididos em tipos 1, 2, 3, 4A e 4B (SANTOS et al., 2002), possuem tamanho médio e genoma organizado em uma fita simples de RNA negativo. Estes agentes apresentam características estruturais e biológicas similares, e podem acometer indivíduos de diferentes faixas etárias. Dessa forma, constituem causa de infecções do trato respiratório inferior e superior em crianças, adultos, indivíduos imunocomprometidos e idosos (HENRICKSON, 2003). Existe uma grande relação entre os PIV-1, PIV-2 e PIV-3 com síndromes clínicas específicas, assim como, com a idade da criança e o período de circulação (HENRICKSON, 2003). Por essa razão estes patógenos podem causar rinites, otites, laringotraqueobronquites, bronquiolites e pneumonias (VAINIONPAA, HYYPIA, 1994; COLLINS et al., 1996; KIM et al., 2000), e de acordo com WEINBERG (2006), os PIV-1 e - 3 são os principais responsáveis pelos casos sintomáticos, uma vez que os PIV- 2 e - 4 causam um número menor de síndromes aparentes. O período de incubação dos PIV varia de dois a seis dias (SANTOS et al., 2002) e cada sorotipo apresenta distintos aspectos clínicos: PIV-1 é associado com crupe e traqueobronquites até o segundo ano de vida; PIV-2 é associado com crupe; PIV-3 geralmente causa bronquiolites e pneumonias, enquanto que o PIV- 4 tem sido pouco detectado (COUNIHAN et al., 2001). Estes vírus apresentam um padrão de sazonalidade: PIV-1 responde por um aumento bianual nos casos de crupe no outono; PIV-2 ocorre todos os anos, também no outono e PIV-3 circula anualmente, entretanto predominando na primavera e no verão (KIM et al., 2000; HALL, 2001). Os PIV causam doenças respiratórias similares àquelas causadas pelo VRS, porém respondem por um número menor de hospitalizações e sabe-se que pneumonias e bronquiolites causadas pelo PIV-3 ocorrem principalmente nos primeiros seis meses de vida (HALL, 2001), e este sorotipo tem sido o mais frequentemente identificado em crianças menores que cinco anos (NASCIMENTO et al., 1991; YANG et al., 2003 COSTA et al., 2006) A maior parte das crianças apresenta anticorpos neutralizantes contra os quatro tipos antigênicos ao nascimento, porém os títulos decrescem durante os primeiros seis meses de vida (HENRICKSON, 2003), no entanto, evidências sorológicas de infecções são comuns até os cinco anos de idade (COUNIHAN et al., 2001; HENRICKSON, 2003). A primeira infecção por algum dos PIV não confere imunidade permanente contra estes vírus e reinfecções são comuns, porém a primeira infecção muitas vezes é suficiente para restringir a replicação viral no trato respiratório inferior e prevenir doenças graves (MOSCONA, 2005). Os PIV tipos 1, 2 e 3 são geralmente detectados pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI) ou por isolamento em cultura de células (HENRICKSON, 2003). Entretanto, métodos de diagnóstico molecular mais sensíveis, como a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) têm sido utilizados (ECHEVARRÍA et al., 1998). Considerando que as IRAs no estágio inicial são clinicamente semelhantes entre si e que os resultados dos tratamentos com antivirais para a maioria dos vírus são pouco satisfatórios (MOSCONA, 2005), os métodos rápidos de diagnóstico tornaram-se essenciais para identificar qual agente viral causou a infecção, objetivando assim uma monitoração clínica adequada dos pacientes de risco (DENNY, 1995). Diante disso, sete vírus respiratórios vêm sendo identificados pela IFI em aspirados de nasofaringe de crianças, com doença respiratória aguda, atendidas em Uberlândia, MG. Entretanto, neste estudo os PIV tipos 1, 2 e 3 foram investigados pela IFI em 133 amostras de secreção de nasofaringe de crianças menores de cinco anos de idade, com doença respiratória aguda, atendidas em Uberlândia, MG. Considerando que poucas amostras clínicas foram positivas para os PIV, optou-se por implantar a técnica de RT-PCR do tipo multiplex, para que a mesma possa ser utilizada num futuro próximo para detecção desses vírus. 2

3 2. PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS Aspirados de nasofaringe (ANF) vêm sendo coletados de crianças de 0-5 anos de idade com doença respiratória aguda, atendidas no Hospital de Clínicas de Uberlândia (HCU) nos seguintes setores: pronto atendimento pediátrico (PAP), pronto socorro (PS), unidade de terapia intensiva (UTI), enfermaria, berçário e de unidades de atendimento integrado (UAIs). O estudo obteve parecer favorável do Comitê de Ética da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFU de acordo com as resoluções de nº 007/2003, 249/05, 164/07 e 198/07. A coleta dos ANF, realizada após consentimento expresso dos pais ou responsável e preenchimento de uma ficha clínica pelo pediatra responsável, foi realizada conforme previamente descrito por Ribeiro et al. (2008), com pequenas modificações. Resumidamente, foi realizada a instilação de 1ml de soro fisiológico estéril (0,9%) em cada uma das narinas da criança, seguida de aspiração da secreção com um catéter, utilizando-se um sistema de vácuo e transferência para um frasco estéril. Os espécimes clínicos foram transportados ao Laboratório de Virologia (ICBIM) da UFU e processados em um tempo máximo de 4h como previamente descrito (OLIVEIRA et al., 2008). Resumidamente, a amostra foi dividida em três alíquotas: i) para a reação de imunofluorescência indireta (IFI), ii) inoculação em cultura de células (CC) e iii) in natura para extração de ácidos nucléicos (DNA e RNA). As duas últimas foram estocadas em freezer -70 C e em tanque de nitrogênio líquido. Após este procedimento foi realizado o teste de IFI, para identificação de sete vírus respiratórios (vírus respiratório sincicial, influenzavírus A e B, parainfluenzavírus 1, 2 e 3 e adenovírus) utilizando-se o kit comercial: Respiratory Panel I Viral Screning and Identification by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) Kit (Chemicon International Inc., Temecula, CA), conforme instruções do fabricante. O teste de IFI foi considerado positivo quando um número maior que três células foram observadas com fluorescência, negativo quando não foi observada nenhuma fluorescência em um número maior que 20 células e suspeito se um número menor que três células apresentou fluorescência (QUEIRÓZ et al., 2002). RT-PCR para os PIV 1-3 Inicialmente foi realizada a extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) com Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com instruções do fabricante. A técnica de amplificação do RNA, bem como as condições do termociclador foi conduzida de acordo com Echevarría et al. (1998) com algumas modificações. Resumidamente a PCR multiplex foi realizada utilizando-se primers para detecção destes vírus em uma única reação, acrescidos de uma mistura de deoxinucleotídeos trifosfatados e transcriptase reversa. Os primers utilizados foram descritos também por Echevarría et al. (1998). Os produtos das reações foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2,5% em TBE (Tris-Borate-Ethylenedianinetetraceticacid) 0,5X (SAMBROOK, RUSSELL, 2001), contendo 0,5 g/ml de brometo de etídeo. O gel de agarose foi visualizado e fotografado por um sistema digital ImageMaster VDS, GE Healthcare. 3

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO No período de 2005 a 2008, foram investigados pela imunofluorescência indireta (IFI) um total de 133 aspirados de nasofaringe (ANF) de crianças com doença respiratória aguda (DRA). O teste de IFI foi realizado para detecção de sete vírus respiratórios: o vírus respiratório sincicial (VRS), os influenzavírus tipos A e B (FLU A e B), os parainfluenzavírus tipos 1, 2 e 3 (PIV 1, 2 e 3) e os adenovírus (AdV). Pela IFI os resultados positivos para os PIV corresponderam a 5,3% (7/133) do total de espécimes, sendo cinco casos de PIV-1, um de PIV-2 e um de PIV-3. Um percentual de 25,5% (34/133) das amostras apresentou positividade para outros vírus respiratórios, enquanto que as amostras negativas e inconclusivas responderam por 45,1% (60/133) e 24,1% (32/133), respectivamente (Figura I). PIV 1, 2 e 3 5,3% Inconclusivas 24,1% Resultados positivos para outros vírus 25,5% Negativas 45,1% Figura I: resultados de vírus respiratórios testados pela imunofluorescência indireta (IFI), no período de Dos sete casos que apresentaram positividade para os PIV, cinco eram maiores de um ano de idade, o que pode estar relacionado a um efeito protetor dos anticorpos maternos em crianças mais jovens (CROWE, 2001). 4

5 A porcentagem de detecção dos PIV através da IFI foi menor que o esperado, uma vez que trabalhos mostram uma relevância dos PIV nos casos de infecções respiratórias agudas (IRA) de nove a 30%, e no presente trabalho estes vírus foram detectados em apenas 5,3% das amostras clínicas. Essas diferenças nos dados obtidos podem estar relacionadas a dois fatores: o primeiro é o fato de os anticorpos monoclonais (MAb s) utilizados na IFI terem sido produzidos em 1985 e tendo em vista a alta taxa de mutações as quais estão sujeitos os RNA vírus, é provável que os epítopos para os quais esses MAb s foram produzidos já tenham sofrido mudanças; o segundo fator que pode estar relacionado com a baixa detecção dos PIV seria o número elevado de resultados inconclusivos, que pode estar ligado a problemas envolvendo o manuseio da secreção, tanto durante a coleta quanto durante o processamento. Considerando que a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) do tipo multiplex para os PIV 1, 2 e 3 apresenta resultados satisfatórios, quanto à rapidez e sensibilidade (HENRICKSON et al., 2003), entende-se que para averiguar com eficiência a circulação desses vírus em Uberlândia, será necessário testar por esse método as 133 amostras de secreção de nasofaringe, previamente aqui investigadas pela IFI. A padronização da RT-PCR em amostras que apresentaram resultados positivos pela IFI já foi realizada. Portanto, essa técnica será empregada nas amostras acima referidas. 4. COMCLUSÕES Apesar do pequeno número de amostras de parainfluenzavírus (PIV) detectado, foi possível identificar pela técnica de imunofluorescência indireta a circulação dos PIV tipos 1, 2 e 3 em amostras de secreção de nasofaringe de crianças atendidas em Uberlândia, MG. Entretanto, é necessário aprimorar sua detecção com a finalidade de se avaliar mais detalhadamente aspectos epidemiológicos dos vírus, visto que se trata de um importante agente de doenças respiratórias, particularmente em crianças. 5. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), a Universidade Federal de Uberlândia, ao Instituto de Ciências Biomédicas (ICBIM/UFU), ao Instituto de Ciências Biológicas (INBIO/UFU), ao laboratório de Virologia e à orientadora profa. Dra. Divina Aparecida Oliveira Queiroz. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arens, M., 1999, Methods for subtyping and molecular comparison of human viral genomes. Clin Microbiol Rev, v.12, n.4, p Collins, P.L. Chanock, R. M. Mcintosh, K., 1996, Parainfluenza viruses, In: Fields BN, editor. Fields virology. Philadelphia, PA: Lippincott- Raven, p Costa, L. F. Yokosawa, J. Mantese, O. C. Oliveira, T. F. Silveira, H. L. Nepomuceno, L. L. Moreira, L. S. Dyonisio, G. Rossi, L. M. Oliveira, R. C. Ribeiro, L. Z. E Queiroz, D. A., 2006, Respiratory viruses in children younger than five years old with acute respiratory disease from 2001 to 2004 in Uberlandia, MG, Brazil, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.101, n.3, p Counihan, M. E. Shay, D. K. Holman, R.C. Lowther,S. A. Anderson, L.J., 2001, Human parainfluenza virus-associated hospitalizations among children less than five years of age in the United States, Pediatric Infect Diseases Journal. v.20, n.7, p

6 Crowe, J. E. Jr., 2001, Influence of maternal antibodies on neonatal immunization against respiratory viruses, Vaccines. v. 33, p Denny, F. W., 1995, The clinical impact of human respiratory virus infection, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, New York, NK. v.152, p.s4-s12. Diniz, E. M. Vieira, R. A. Ceccon, M. E. Ishida, M. A. E. Vaz, F. A., 2005, Incidence of respiratory viruses in preterm infants submitted to mechanical ventilation, Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, v.47, n.1, p Echevarría, J.E. Erdman, D. D. Swierkosz, E. M. Holloway, B. P. Anderson, L. J., 1998, Simultaneous detection and identification of human parainfluenza viruses 1, 2 and 3 from clinical samples by multiplex PCR, Journal Clinical Microbiology. v.36, p Echevarría, J. E. Erdman, D. D. Meissner, H. C. Anderson, L., 2000, Rapid molecular epidemiologic studies of human parainfluenza viruses based on direct sequencing of amplified DNA from a multiplex RT-PCR assay, Journal of Virological Methods. v.88, p Hall, C. B., 2001, Medical Progress: Respiratory Syncitial Virus and Parainfluenza Virus, New England Journal of Medicine. v.344, n.25, p Henrickson, K. J., 2003, Parainfluenza viruses, Clinical Microbiology Review. v.16, p Hibbits, S. Fox, J. D. Thea, 2002, Application of Molecular Techniques to Diagnosis of Viral Respiratory Tract Infections, Reviews in Medical Microbiology. v.13, n.4, p Kim, M. R. Lee, H. R. Lee, G. M., 2000, Epidemiology of Acute Viral Respiratory Tract Infections in Korean Children, Journal of Infection, v. 41, p Kuypers, J. Wright, N. Ferrenberg, J. Huang, M. L. Cent, A. Corey, L. E. Morrow, R., 2006, Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children, J Clin Microbiol, v.44, n.7, p Moscona, A., 2005, Entry of parainfluenza vírus into cells as a target for interrupting childhood respiratory disease, The Journal of Clinical Investigation, v 115, n.7. Nascimento, J. P. Siqueira, M. M. Sutmoller, F. Krawczuk, M. M. De Farias, V. Ferreira, V. E. Rodrigues, M. J., 1991, Longitudinal study of acute respiratory diseases in Rio de Janeiro: occurrence of respiratory viruses during four consecutive years, Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, v.33, n.4, p Oliveira, J. F. De Sá, J. P. O. E Cruz, M. E. M., 2004, Identificação e monitoração do vírus influenza A e B, na população de Maceió. Ciência & Saúde Coletiva, v.9, n.1. Oliveira, T.F.M. Freitas1, G.R.O. Ribeiro, L.Z.G. Yokosawa, J. Siqueira, M.M. Portes, S.A.R. Silveira2, H.L. Calegari, T., Costa, L.F., Mantese, O.C., Queiróz, D.A.O., 2008, Prevalence and clinical aspects related to respiratory syncytial virus A and B groups in children attended at Hospital de Clínicas of Uberlândia, MG, Brazil, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, in press. Parkinson, A. J. Muchmore, H. G. Scott, L. V. Miles, J. A. R., 1980, Parainfluenza virus isolation enhancement utilizing a portable cell culture system in the field, Journal of Clinical Microbiology, v.11, n.5, p

7 Queiróz, D. A. O. Durigon, E. L. Botoso, V. F. Ejzemberg, B. Vieira. S. E. Mineo, J. R. Yamashita, C. Hein, N. Lopes, C. L. Cacharo, A. L. Stewien, K. E., 2002, Immune response to respiratory syncytial virus in Young Brazilian children, Brazilian Journal of Medical and Biological Research. v.35, n.10, p Ribeiro, L. Z. G. Tripp, R. A. Rossi, L. M. G. Palma, P. V. B. Yokosawa, J. Mantese, O. C. Oliveira, T. F. M. Nepomuceno, L. L. E. Queiroz, D. A. O., 2008, Serum Mannose-Binding Lectin Levels are Linked with Respiratory Syncytial Virus (RSV) Disease, Journal Clinical Immunology, Oct 20, p.(in press). Santos, N. S. O. Romanos, M. T.V. Wigg, M. D., 2002, Introdução à Virologia Humana, Ed. Guanabara Koogan, 120p. Tsuchiya, L. R. R. V. Costa, L. M. D. Raboni, S. M. Nogueira, M. B. Pereira, L.A. Rotta, I., Takahashi, G. R. A. Coelho, M., Siqueira, M. M., 2005, Viral Respiratory Infection in Curitiba, Southern Brazil, Journal of Infection, v. 51, p Vainionpaa, R. Hyypia, T., 1994, Biology of Parainfluenza viruses, Clinical Microbiology Reviews. v. 7, n. 2. Weinberg, G. A., 2006, Parainfluenza Viruses An Underappreciated Cause of Pediatric Respiratory Morbidity, Concise Reviews Of Pediatric Infectious Diseases. v. 25, p Welliver, R. C. 2003, Respiratory syncitial virus and other respiratory viruses, Pediatric Infectious Diseases Journal. v.22, n.2, p.s6-s12. Yang, Tsung-Yen, Lu, Chun-Yi, Kao, Chuan-Yang, Chen, Rong-Tsung, Ho, Yu-Huai, Yang, Shun- Xeng, Lee, Ping-Ing, Chen, Jong-Min, Lee, Chin-Yun, Huang, Li-Min. 2003, Clinical manifestations of parainfluenza infection in children, Journal of Microbiology and Immunology Infection, v. 36, p PARAINFLUENZAVÍRUS EM SECREÇÃO DE NASOFARINGE DE CRIANÇAS COM DOENÇA RESPIRATÓRIA AGUDA, ATENDIDAS EM UBERLÂNDIA, MG Nayhanne Tizzo de Paula Universidade Federal de Uberlândia (UFU).³Av. Pará, 1720, Bloco 4C, Umuarama, Uberlândia, Paulo Guilherme Guimarães Ribeiro Divina Aparecida Oliveira Queiróz Resumo 7

8 Os parainfluenzavírus (PIV) são importantes agentes responsáveis por causar infecção respiratória aguda em indivíduos de diferentes idades, acomentendo pricipalmente as crianças. Esses patógenos são detectados principalmente através das técnicas de imunofluorescência indireta (IFI) e isolamento em cultura de células, no entanto esta última demanda de uma a duas semanas para obtenção do resultado. Investigou-se a presença dos PIV pela IFI em 133 aspirados de nasofaringe de crianças menores de cinco anos de idade com doença respiratória aguda, sendo este agente encontrado em sete das amostras avaliadas. Além disso, a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) do tipo multiplex, foi padronizada para utilização em um futuro próximo. Palavras chave: doença respiratória aguda, crianças, parainfluenzavírus 8