Equilíbrios proteína-ligando

Transcrição

1 Equilíbrios proteína-ligano Para que as reacções enzimáticas possam ocorrer, é necessário o encontro molecular entre o enzima e o substrato e a sua associação num complexo enzima-substrato O processo e associação e enzima-substrato poe ser tratao como um caso particular e equilíbrio proteína-ligano Os processos e associação proteína-ligano são iniciaores e uma grane parte os processos bioquímicos É habitual efinir a macromolécula como receptor (R) e a molécula pequena que se liga a esta como ligano (L)

2 A constante e equilíbrio e issociação (K ) No caso mais simples caa molécula e receptor poe ligar uma única molécula e ligano: R+ L RL originano as seguintes equações e conservação e massa: [R] = [RL] + [R] T [L] = [RL] + [L] T em que [R] T e [L] T são as concentração totais e receptor e ligano. Este processo é geralmente quantificao pela constante e issociação o complexo RL, aa por K = [L][R] [RL]

3 Constante e issociação e energia livre e associação A constante e issociação K está relacionaa com a energia livre e associação ( ) : G bining [LR] [L][R] Gbining = RTlnKa = RTln = RTln [L][R] [LR] G = bining RTln( K ) A constante e issociação K é mais usaa que K a porque tem imensões e concentração e poe ser vista como a concentração e ligano que prouz 50% e saturação o receptor

4 Relação entre K e G bining a 25 o C strong bining

5 Complexo biotina-estreptaviina: uma as mais fortes associações não-covalentes a Natureza biotina estreptaviina K ~ M!!! Livnah(1993) PNAS 90:

6 Tratamento cinético o equilíbrio e associação k1 k 1 R+ L RL K = k k 1 1 Consierano o ligano em excesso a reacção procee com uma cinética aparente e primeira orem: [RL] = [RL] {1 exp( k t)} t eq obs Em que [RL] t é a concentração o complexo binário no instante t e k obs é a constante aparente e primeira orem a reacção.

7 Concentração o complexo proteína-ligano vs. tempo equilíbrio

8 Tratamento cinético o equilíbrio e associação [RL] [RL] [1 exp( )] t = eq kobst Para o caso a associação reversível, k obs é ao por: k k k obs = [L] 1+ 1 Determinano k obs para uma série e iferentes concentrações e ligano, poemos obter k 1 e k -1 a partir e um gráfico e k obs em função e [L]. A constante e issociação K poe então ser calculaa a partir e: K = k k 1 1

9 Determinação cinética e K eclive = k 1 K = k k 1 1 or. na origem = k -1

10 Determinação e K no equilíbrio Apesar e ser em princípio ser possível eterminar K pelo métoo cinético exposto, na prática não é fácil pois o equilíbrio estabelece-se frequentemente num espaço e tempo muito curto, tornano ifícil este tipo e ensaios. É muito mais frequente estuar os processos e associação proteína-ligano após o equilíbrio ter sio estabelecio. [R] = [RL] + [R] T [L] = [RL] + [L] T K = [RL] = [L] [R] eq [RL] eq eq [L]([R] T [RL]) K Assume-se que toas as concentrações que não estejam inexaas e outra forma são e equilíbrio, logo abanonamos uso e eq. [L] [L] t [RL] = [R] T K 1 + [L] t Isoterma e Langmuir (Langmuir,1916)

11 Concentração o complexo RL vs. concentração total e ligano [RL] = [R] T K 1 + [L] T

12 Isoterma e Langmuir em termos e ocupação fraccional Não é necessário, e por vezes nem sequer possível, conhecer a quantiae total e receptor numa experiência e associação. Geralmente existe uma proprieae experimental Y, proporcional à quantiae e complexo RL presente, tal que: Y [RL] Y = Y max K 1 + [L]T Os valores e Y max e K são eterminaos por ajuste a um gráfico e Y em função e [L] Y Y max [RL] = = B [R] T 1 B= K 1 [L] + T T [L] = K B= 0.5 Ocupação fraccional

13 Ocupação fraccional (B) versus [L] t B = 1 K 1 + [L] t

14 Determinação e K na presença e ligação não-específica Ligação específica + Ligação não específica +

15 Determinação e K na presença e ligação não-específica Aicionar ligano marcao: Ligano marcao + Aicionar ligano frio em excesso: Sinal é função a ligação total + Sinal é função a ligação não-específica O ligano frio esloca o marcao o sítio e ligação específico, mas não o não-específico. O sinal restante inica o bining não-específico. [RL] = [RL] [RL] específica total não-específica

16 Determinação e K na presença e ligação não-específica

17 Métoos experimentais para a eterminação e K Diálise e equilíbrio Filtração Cromatografia e exclusão Métoos espectroscópicos

18 Diálise e equilíbrio K = [L] [R] eq [RL] eq eq Neste métoo é muito importante ter a certeza que o equilíbrio foi atingio antes e fazer a eterminação e [L] nos ois compartimentos.

19 Marcha para o equilíbrio numa experiência e iálise